Summary
우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.
Abstract
전염성 질병에 대한 보호는 면역 시스템 1,2에 의해 중재된다. T 림프구는 여러 면역 세포 3,4의 활성화와 반응을 조절, 면역 시스템의 마스터 코디네이터입니다. T-세포의 활성화는 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 표시되는 특정 항원의 인식에 따라 달라집니다. T 세포 항원 수용체 (TCR)는 각 T 세포 클론에 특정한 항원 특이성 5를 결정합니다. 항원에 TCR의 바인딩은 TCR 복합 구성 요소의 인산화를 유도합니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해이 신호는 같은 TCR에 신호 단백질의 모집 등 다양한 중요한 응답을 시작, 막의 세포질과 핵 형질해야하며 APC 사이트 (면역 시냅스), 자신의 분자 활성화, 골격 재 배열, 세포 내 칼슘 농도의 상승, 유전자 발현 6,7의 변화. 에서 올바른활성화 신호의 itiation 및 종료 적절한 T 세포 반응을 위해 매우 중요합니다. 신호 단백질의 활동은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성과 종료에 따라 달라집니다, 이러한 단백질 인산화 단백질 복합체, 단백질의 ubiquitylation 다양한 휴대 사이트 8 단백질의 모집 형성으로 번역 수정을 게시 할 수 있습니다. T-세포 활성화 과정의 내부 동작을 이해하는 것은 면역 학적 연구와 임상 응용 프로그램 모두에 매우 중요합니다.
다양한 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었습니다, 그러나, 널리 사용되는 공동 immunoprecipitation의 방법으로 생화학 적 분석은, 따라서 세포의 역학에 대한 귀중한 통찰력의 관찰을 배제, 단백질의 위치가 식별 될 수 없습니다 메커니즘. 또한 이러한 대량 분석은 일반적으로 t의 다른 단계에있을 수있는 많은 다른 세포에서 단백질을 결합그는 세포 프로세스를 조사 하였다. 이 시간 해상도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 살아있는 세포의 실시간 영상의 사용은 따라서 공정 9,10의 역학에 빛을 흘리는, 단백질의 공간적 추적 및 시간적 신호 이벤트를 구별 할 수있는 능력을 모두 할 수 있습니다. 우리는 T 세포 활성화 중에 신호 복잡한 형성의 실시간 영상의 방법을 제시한다. 기본 T 세포 또는 인 Jurkat 같은 T - 세포 라인, 비 생리적 인 올리고머 11을 방지 단량체 형광 단백질에 융합 관심의 단백질에 대한 인코딩 플라스미드 형질 전환됩니다. 라이브 T 세포는 특정 활성화 항원에 대한 필요성을 극복하면서 T 세포의 활성화를 유도 CD3/TCR 복합체에 결합 T-세포 활성화 항체 8,9와 coverslip을 미리 코팅을 통해 삭제됩니다. 활성화 된 세포는 지속적으로 공 촛점 현미경의 사용으로 몇 군데 있습니다. 영상 데이터는 COL과 같은 정량적 인 결과를 산출하기 위해 분석신호 단백질의 ocalization 계수.
Protocol
1. T-세포의 형질
- Nucleofector 솔루션 키트의 "보충"솔루션을 혼합하여 활성화 Amaxa Nucleofector 솔루션을 준비합니다. 활성화 된 솔루션은 3 개월까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 문화 매체 인 Jurkat T 세포를 증가 【10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 2 RPMI에서 mM의 L-글루타민]. 최적의 세포는 1-2주 해동 후 사용한다. 로그 성장 세포 배양을 사용하여 높은 형질 전환 효율과 세포의 생존을 위해 매우 중요합니다. 또는 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 기본 T 세포와 함께 사용할 수 있습니다, 앞에서 8을 설명했다. 그것은 기본 T 세포의 활성화 과정의 기간 더 긴 인 Jurkat T 세포 (~ 30 분)보다 것을 강조되어야한다, 현미경 단계 배양 시스템은 CO 2, 전역 습도와 온도를 유지하는 데 사용해야 장착 활성화 프로세스입니다.
- 5 수집15 ML 튜브에 형질 전환 당 × 10 6 로그 상 T 세포.
- 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기.
- 원심 분리하는 동안 6 잘 플레이트를 준비합니다. 37 5 ML 문화 매체 및 사전 부화 각 형질에 대해 잘 하나를 채울 ° C.
- 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상층 액을 버린다. 1 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기.
- 원심 분리하는 동안 형질 솔루션을 준비합니다. 96 - 웰 플레이트 잘 하나, 찬란 태그 단백질을 코딩 관심 플라스미드의 5 μg의 DNA와 1 단계에서 제조 된 활성화 100 μl의 Amaxa Nucleofector 솔루션을 섞는다. 최적의 DNA 농도는 형질 솔루션을 희석 방지하기 위해 1 ㎍ / ㎖보다 커야합니다.
- 부드러운 피펫으로 잘 섞는다.
- 세포 원심 분리 한 후,주의 깊게 상층 액을 제거 D되지 동안펠렛을 isturbing.
- DNA / 형질 전환 솔루션 두번을 피펫.
- 펠렛의 DNA / 형질 전환 솔루션을 추가합니다.
- Amaxa 큐벳에 세포를 전송합니다.
- Amaxa Nucleofector 장치에 큐벳을 삽입합니다.
- electroporation을위한 H-10 Amaxa의 형질 설정 (인 Jurkat) 또는 T-23 (기본 T 세포)를 사용합니다.
- 인큐베이터에서 6 잘 플레이트를 제거합니다.
- electroporation에 따라주의 깊게 파스퇴르 피펫을 사용하여 6 잘 플레이트에 세포 현탁액에 뜨는을 전송합니다. 세포 파편으로 구성된 펠렛이 형성 될 수 있습니다. 펠렛을 전송하지 마십시오.
- 37 24 시간 동안 세포를 품어 ° C.
- 새로운 우물에 각 우물에서 세포 현탁액의 2.5 ML을 전송합니다. 각 well에 2.5 ML 따뜻한 문화 매체 (2 단계에서 설명)를 추가합니다.
- 72 시간 후 400 7 분 × g, 실온에서 대한 멸균 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다. 뜨는을 취소하고이를 위스콘신 교체사용되는 플라스미드에 적합한 포유류 세포 선택 항생제 (, 우리는 각각 1.3 밀리그램 / ML 및 / 또는 0.2 밀리그램 / ML의 농도 G418 및 / 또는 그로 마이신을 사용하는 데 사용되는 항생제에 적합한 농도를 적용) 보충 번째 배지. 신선한 잘있는 문화 세포 현탁액. 또한, 세포는 일시적으로 형질 전환 및 형질 전환 후 48 시간을 이미지 할 수 있습니다. 일시적으로 형질 전환 된 세포를 준비하려면 20 단계로 일반적으로 계속 8 단계에서 동시에 두 개의 플라스미드와 세포를 공동 형질하고 23 단계로 없습니다. 이 시나리오에서, 세포가 즉시 사용되어야합니다, 일반적으로 자신의 형광 강도는 이기종 반드시 높지 않다.
- 적절한 선택 항생제가 첨가 배지로 세포를 성장. 세포를 분리하고 필요에 따라 항생제 첨가 배지와 함께 그들을 보충합니다.
- 이주 후 FACS의 사용 (독감 성공적으로 형질을 확인로 orescence - 활성화 된 셀 정렬은) 다음 :
- 10 6 형질 전환 세포 10 6 모의 형질 세포 (대조군), 그리고 안정적으로 찬란 태그 단백질을 표현하는 것으로 알려져있다 10 6 세포를 수집합니다. 세포가 하나 이상의 형광 단백질 (27 단계 참조) 형질 전환되는 경우에, 긍정적 인 컨트롤 등 여러 단독 태그 세포 라인을 사용합니다.
- 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기.
- 상층 액을 버린다. 500 μL FACS 버퍼 (PBS W / O 칼슘 2 +와 마그네슘 2 + 5 % FCS, 0.05 % 나트륨 아 지드)에있는 세포를 resuspend.
- 세포의 형광을 확인 분석 FACS를 사용합니다. 부정과 긍정적 인 컨트롤의로 형질 전환 된 세포의 형광을 비교합니다.
- 형질 전환 된 세포를 사용하여 추가, 찬란 태그 단백질의 단계를 반복 3-26과 세포를 형질합니다.
- 형광의 높은 수준을 표시하는 셀이 사용되어야한다. 의 최적, 최소 50 %문화의 세포가 높은 형광해야한다. 세포의 형광 FACS를 통해 세포 분류에 의해 증가 될 수있다.
모든 추가 태그 단백질은 서로 다른 형광 물질에 융합되어야하며, 다른 선택의 항생제 인코딩 플라스미드에 인코딩. 하나 이상의 플라스미드로 형질 전환 된 세포를 선택하는 매체는 모든 적절한 항생제로 보충해야한다.
2. T 세포 확산 분석 준비
- 실험실 테크 II 독일어 커버 글라스 시스템 4 챔버 슬라이드를 사용합니다. 실수로 준비 또는 사용 중 피펫 팁 예를 들어 챔버의 내부 표면, 스크래치하지 않도록합니다.
- 50-ML 슬라이드 준비 솔루션을 준비 : 12 M (37 %), 염산 4.6 mL를 취하여, 38.5 ML 100 % 에탄올 6.9 ML 이중 증류수를 추가합니다.
- 500 μL 슬라이드 준비 솔루션 슬라이드의 각 챔버를 채우십시오.
- 10 분 실온에서 알을 품다.
- 챔버 흡입의, 완전히 건조.
- ° C까지 완전히 건조 45 1 시간 동안 폭로 슬라이드를 품어.
- 이중 증류수에 0.1 % 폴리-L-라이신 (시그마 - 알드리치)을 희석하여 0.01 % 폴리-L-라이신 솔루션을 준비합니다.
- 각 챔버에 500 μl를 적용합니다.
- 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어.
- 그들을 완전히 건조 챔버를 대기음.
- ° C까지 완전히 건조 45 3 시간 동안 품어.
- 코팅 된 슬라이드는 실온에서 몇 달 동안 건조 저장할 수 있습니다.
- 활성화 항체 솔루션을 준비합니다. HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) 또는 UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 챔버 당 400 ㎕의 PBS에서 10 ㎍ / ㎖ 하나 : 항 CD3 항체를 사용합니다. 이 솔루션은 곧 슬라이드 준비하기 전에 준비를해야합니다.
- 활성화 항체 용액 400 μL 각 챔버를 채우십시오.
- 4에서 하룻밤, 바람직하게는 37 ° C 또는에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 ° C.
- 활성화 항체 졸 제거ution 즉시 300 μL PBS로 두 번 실을 씻는다. 이 시점에서, 실이 버퍼로 가득 남아 있는지 확인합니다.
- 4 ℃에서 PBS - 채워진 슬라이드를 저장 우리는 1 주 안에 준비된 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 좋습니다.
3. T 세포 활성화 및 이미징
- [1.25 ML의 HEPES (1 M) 10 ㎖ FCS, 38.75 ML RPMI 페놀 레드없이] 이미지 버퍼를 준비합니다. 이미지 버퍼는 4 ° C 후 여과에 저장할 수 있습니다.
- 자이스 혈구 LSM 510 메타 현미경을 활성화합니다. 37 현미경 가열이 장착 프레임을 따뜻하게 ° C. "전문가 모드"를 선택합니다.
- "취득"탭을 클릭하고 다음 탭을 엽니 레이저, 현미경, 구성, 검사, 시간 시리즈.
- 필요한 레이저를 활성화합니다. MCFP 및 mYFP의 자극에 대한 다음 "의"5 분 "대기"로 아르곤 / 2 레이저가 설정합니다.
- 당신은 같은 형광체를 사용하기 전에이 라이브 세포 이미징 분석을 수행 한 경우, 결과 LSM 파일을 열고, 나는 "재사용"을 클릭사기꾼, 9 단계에서 계속합니다. 그렇지 않으면 6 단계에서 계속합니다.
- 사용 된 형광 단백질의 여기 및 방출에 대한 적절한 필터를 사용하여 채널을 정의합니다.
- "스캔 제어"창에서, Z 스택 옵션을 선택합니다.
- 0.5 μm의, 현재 조각 : 3; 슬라이스 번호 : 간격 5 다음 검색 매개 변수를 입력합니다.
- 현미경 근처에 37 Accublock 디지털 건조한 목욕 (Labnet) ° C를 준비합니다.
- 37 ° C.에 이미지 버퍼를 따뜻하게
- 따뜻한 이미지 버퍼 600 μL로 대체, PBS를 흡입하여 저장된 슬라이드를 준비합니다.
- 37 슬라이드를 품어 ° C. 13 단계까지 적어도 15 분 동안 인큐베이터에서 슬라이드를 유지합니다.
- 5를 수집 × 10 5 형질 전환 된 T 세포를.
- 400 × g에서 2 분간 세포를 원심 분리기.
- 상층 액을 버린다.
- 1 ML 따뜻한 이미지 버퍼에있는 세포를 resuspend하고, 1.5 ML 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다.
- t를 놓고Accublock 디지털 건조한 목욕에 동부 표준시 관.
- 인큐베이터에서 따뜻하게 슬라이드를 가지고, 예열 현미경 장착 프레임에 마운트합니다.
- "VIS"아이콘을 클릭합니다.
- 세포 현탁액을 혼합하고 1-2 μl를 제거합니다.
- 슬라이드의 하단에 위의 이미지 버퍼에 피펫의 팁을 삽입합니다. 슬라이드가 긁히지 않도록.
- 목표의 구멍에 씨앗 세포를.
- 그들이 내려 가면 즉시 시각적으로 형광 세포를 추적을 시작합니다. 두 채널에서 높은 형광을 표시하는 셀을 선택합니다.
- 셀이 슬라이드의 표면에 도달하기 전에, LSM 모드를 활성화합니다.
- 단 하나의 여기 레이저를 전환합니다. 당신은 DIC 채널을 가지고있는 레이저를 선택합니다.
- 1로 줌을 설정합니다. "빠른 XY"아이콘을 클릭합니다. "정지"아이콘을 클릭합니다. 자르기 도구를 사용하여 셀을 중심으로 투자 수익 (ROI)을 선택합니다.
- 3 줌을 설정합니다. "빠른 XY"아이콘을 클릭 한 다음 수동으로 최적의 셀을 볼 포커스를 설정합니다. "정지"ICO을 클릭N.
- 모든 필요한 여기 레이저를 전환합니다.
- "StartT"아이콘을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 이미지 확산 과정 (일반적으로 5 분)의 전체 셀을. 완료되면, "정지"아이콘을 클릭합니다.
- 파일을 저장합니다.
- 추가 세포를 획득하려면 "VIS"아이콘을 클릭합니다. 아직 슬라이드의 바닥에 접촉하지 않은 세포가있는 경우, 23 단계에서 계속합니다. 이미 확산 과정을 시작했습니다 이미징 세포를 피할 수 있습니다. 그렇지 않으면 32 단계로 진행합니다.
- 관찰 슬라이드 영역이 세포의 대부분이없는 경우, 셀 (20 단계부터 계속합니다)의 또 다른 나누어지는을 추가합니다. 그렇지 않으면 33 단계로 진행합니다.
- 추가 세포를 얻으려면 목적의 구멍 위의 영역이 세포의 결여되도록 슬라이드를 이동합니다.
- 세포 (및 20 단계에서 계속) 다른 나누어지는을 추가합니다.
- 원하는 모든 이미지를 수행 한 후, 저장된 LSM 파일을 엽니 다.
- "갤러리", "시간 + Z"와 "부분"을 클릭합니다.
- relevan을 선택t 시간 범위와 Z 스택.
- 새 파일을 저장합니다.
- 모든 이미지 파일에 대한 단계 35-38를 수행합니다.
4. 영상 데이터 분석
- Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)를 사용하여 LSM 파일을 엽니 다.
- "능가"을 클릭합니다. "이미지 프로세싱"메뉴를 클릭하고 "시간과 Z 스왑"를 선택합니다. 이 이미지의 정확한 자르기에 도움이 될 것입니다.
- "편집"도구 모음을 클릭하고 드롭 메뉴에서 "자르기 3D"옵션을 선택합니다. 세포를 둘러싸고있는 영역 만 포함하도록 이미지를 자르. 우리는 셀을 중심으로 300 × 300 픽셀의 사각형을 자르기 좋습니다. 세포의 모양과 위치가 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있습니다. t 축을 관찰하면 세포가 모든 시간 지점에서 자른 영역 내에 있는지 확인합니다.
- "이미지 프로세싱"메뉴를 클릭하고 이미지의 원래 시간적 분리를 복원하는 "시간과 Z 스왑"를 선택합니다.
- 기본 도구 모음에서 "Coloc"버튼을 누르십시오. "데 시간 빌드를 선택P. Coloc. "Imaris는 각 시점에서 각 채널에 대한 강도 임계 값을 계산합니다.
- "채널 통계"를 선택하여 colocalization을 분석의 결과를 볼 수 있습니다. "내보내기"를 클릭하여 데이터를 내 보냅니다.
- 각 군데 셀에 대해 6 단계를 반복합니다. 우리는 적어도 50 세포가 이러한 방식으로 분석하는 것이 좋습니다.
- 평균 피어슨의 colocalization을 계수 및 표준 오류 또는 편차를 계산합니다.
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Representative Results
우리는 살아있는 T 세포 이미징 및 분석의 예를 제시한다. 영상 실험에 앞서, SLP76 결핍 T 세포 (J14)는 형광 단백질 (그림 1)의 발현을 결정하는 FACS의 사용으로 분석 하였다. 태그 신호 단백질 MCFP - NCK와 SLP76-mYFP로 형질 전환 된 T 세포는 활성화 슬라이드를 통해 입금 및 T 세포의 확산 (그림 2) 중 몇 군데 있었다. 수집 된 이미지 활성화 및 (그림 3) 확산을 통해 단백질 지방화의 역 동성을 보여줍니다. 인간의 편견을 최소화하면서 컴퓨터 이미지 처리, 새로운 통찰력과 시각 세포의 정량적 정보를 제공합니다. 세포의 활성화 과정을 통해 두 단백질의 colocalization을 검토하기 위해, 우리는 Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)의 colocalization을 도구를 활용. 몇 군데 세포에 걸쳐 서로 다른 시간 지점 사이 colocalization을 계수를 비교하여, 우리는 있었다 NCK와 SLP76의 colocalization을이 T-세포 활성화 (p> 0.3) (그림 4)에 걸쳐 크게 변화하지 않는 것을 확인할 수.
그림 1. (B) mYFP;. 세포의 FACS 분석은 두 데이터는 (A) MCFP에 대한 형광 강도 막대 그래프로 표시됩니다 형광 표지 된 단백질 형질 전환 및 (C) 도트 플롯으로. MCFP - NCK와 SLP76-mYFP 형질 전환 J14 세포의 형광 강도는 각각 시안과 노란색으로 표시됩니다. Untransfected J14 대조군 세포는 검은 색 선으로 표시됩니다.
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그림 2. 라이브의 개략도 T 세포 분석을 확산 (A) T-세포 활성화 슬라이드의 준비;. (B) T 세포 확산 분석 및 분석을 살고. (C) 현미경 설정 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. MCFP - NCK와 SLP76-mYFP을 표현하는 T 세포의 활성화 과정에서 NCK와 SLP76의 배포. 세포는 항-CD3 자극 항체 사전 코팅 coverslips를 통해 삭제하고 지속적 7 분의 기간 동안 몇 군데 있었다. SLP76-mYFP는 노란색으로 표시되어있는 동안 MCFP - NCK는 청록색으로 표시됩니다.
그림 4. 단백질 colocalization을의 정량 분석. 세포의 이미지 처리는 Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)를 사용하여 수행 하였다. colocalization을이 MCFP 채널의 강도와 각 픽셀에 대한 mYFP 채널 사이의 피어슨 상관 계수로 계산됩니다. 서로 다른 시간 지점에서 계산 피어슨의 colocalization을 계수는 비교됩니다. 30 초 활성화 프로세스로, MCFP - NCK와 SLP76-mYFP의 colocalization을 계수는 (p <0.05) 유의하게 증가 하였다. 이러한 결과는> 50 독립 셀을 분석하여 계산 하였다. 평균 ± 표준 오차가 표시됩니다.
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Discussion
여러 세포 프로세스의 규제 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성 및 종료에 따라 달라집니다. 현미경 영상은 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질의 실시간 추적을 할 수 있습니다. 태그 단백질의 colocalization을이 단백질 사이의 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 제안 할 수 있습니다, 그리고 면역 침전 등의 생화학 적 방법에 의해 얻어진 결과를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 적 방법과는 달리, 살아있는 세포 이미징이 간 단백질의 상호 작용이 발생할 때 생리적 인 과정의 모니터링을 촉진하고 단백질의 세포 분포의 검출, 공간적 및 시간에 관찰 할 수 있습니다. colocalization을의 정량 분석을위한 다양한 도구가 개발되었다; 피어슨의 상관 계수는 두 개의 단백질 12 사이 colocalization을 정도의 정량화를위한 아주 매력적이고 널리 사용되는 방법 남아 있습니다. 반면 형광 공명 전자에너 전송 (무서워) 실험 가까이 (10 NM)을 특징으로 간 단백질 상호 작용의 검출을 가능하게,이 방법은 특수 설정 (사용되는 형광 taggings의 장비와 호환) 및 복잡한 데이터 처리를 필요로합니다. 대부분의 용도 colocalization을 분석을 위해, 생화학 적 방법과 활용에는 사용하기 쉬운 구성하고 시간이 지남에 단백질 - 단백질 상호 작용을 관찰하는 간단한 방법.
두 채널의 강도 임계 값보다 픽셀을 무시하고, 분석 픽셀에 대한 형광 강도 임계 값을 설정하면 정확하고 민감한 colocalization을 분석을위한 매우 중요합니다. 이러한 임계 값의 객관적이고 자동화 된 측정을위한 일반적으로 사용되는 알고리즘은 13. Costes 등에 의해 개발되었으며 같은 Imaris 및 Volocity 같은 이미지 처리 프로그램에 의해 구현됩니다.
여기, 우리는 살아있는 T 세포 IMAG의 사용을 보여줍니다SLP76의 역학을 분석 ING 방법은 중요한 T 세포 지지체와 NCK, 어댑터 단백질, 둘 다 T-세포 활성화 14,15를 위해 필수적입니다. 활성화 과정에서 수집 된 T 세포의 이미지는 두 단백질 (그림 3) 세포의 활성화 과정 전반에 걸쳐 colocalized하는 것이 좋습니다. 이 정량적으로 정품 인증 과정을 통해 수집 된 영상에서 피어슨의 colocalization을 테스트를 수행하여 뒷받침된다. -1에서 -1의 점수 안티 상관 관계를 의미한다 1, 피어슨의 colocalization을 계수 범위는 1의 점수는 완벽한 colocalization을하고 0은 두 개의 이미지 채널 간의 상관 관계를 나타냅니다. 서로 다른 시간 포인트를 다른 세포에 대한 계산 피어슨의 colocalization을 계수의 비교 NCK와 SLP76의 colocalization을 크게 세포의 활성화 과정에서 변경되지 않음을 나타냅니다 만, (p> 0.3, 그림 4 참조) 일정하게 유지됩니다. 반면 전체 colocalization을 공동이 단백질의 효율적인 활성화 과정을 통해 변경되지 않습니다, 그것은 협회 및 이러한 단백질 18 사이에서 발생하는 분열의 동적 프로세스의 가능성을 제거하지 않습니다.
우리가 제시 한 프로토콜은 또한 필요에 따라 세포 성장 조건을 조절 문제 세포주에 적합한 형질 전환 설정을 선택하고 해당하는 경우, 세포 활성화 프로세스를 수정하여 다른 조혈 세포 라인에 적용 할 수 있습니다. 우리가 적절한 조정과 설정의 사용으로, LSM 510 메타 공 촛점 현미경을 사용하면서 다른 공 촛점 현미경 시스템이 성공적으로도 사용할 수 있습니다하시기 바랍니다.
라이브 T 세포 이미징의 사용은 생화학 및 분자 방법을 사용하여 공간적 해상도를 사용할 수와 함께 탐험하는 신호 이벤트를 활성화, 규제 및 활성화 과정을 직접 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 간단 마약을 제시, 살아있는 T 세포 확산 분석을 수행하는 실시간 관련 단백질을 모니터링하고 정량적 인 결과를 산출하기 위해 데이터를 분석 OD. 결과 현미경 데이터는 또한 세포 모양 인덱스 분석과 같은 다른 다운 스트림 응용 프로그램, 16에 사용 및 특정 실험 장치 및 연구 목적에 따라 분석 17,18을 무서워 할 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원 소피아 튀김 감사합니다. 보조금 no.1659/08, 971 / 08, 1503년부터 1508년까지 및 10분의 491, 아니 보조금 보건 및 과학의 사역에 대한 이스라엘 과학 재단 : MBS는 자신의 연구 지원을 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다. 3-4114과 3-6540, 후반 알렉산더 Smidoda의 부동산을 통해 이스라엘 암 협회와 바이오 의약품의 우수성 부여에 대한 Taubenblatt 패밀리 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame - Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 | |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
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