Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

T细胞实时成像实时信号复合物的形成

Published: June 23, 2013 doi: 10.3791/50076
* These authors contributed equally

Summary

我们描述一个活细胞成像的方法在T细胞活化过程中,提供了洞察蛋白质动力学。我们展示了结合使用的T细胞扩散法,激光共聚焦显微镜成像分析得到的定量结果,按照整个T细胞活化信号复合物的形成。

Abstract

防止传染病介导的免疫系统1,2。 T淋巴细胞的免疫系统的主协调,调节多个免疫细胞3,4的活化和反应。 T细胞活化是依赖于特定的抗原的识别由抗原呈递细胞(APC)显示。具体到每个T细胞克隆的T细胞抗原受体(TCR)和确定抗原特异性5。对抗原的T细胞受体的结合诱导的磷酸化的T细胞受体复合物的组成部分。为了促进T细胞活化,该信号必须转膜细胞质和细胞核,发起各种关键的反应,如招募到TCR信号蛋白APC网站(免疫突触),其分子活化,细胞骨架重排,细胞内钙离子浓度升高,并在6,7基因表达的变化。正确itiation和终止激活信号是至关重要的适当的T细胞应答。信号蛋白的活性依赖的形成和终止的蛋白质-蛋白质相互作用,翻译后的修改,如蛋白质磷酸化,形成的蛋白质复合物,蛋白泛素化和招聘的蛋白质,各种蜂窝基站的8。了解T细胞活化过程的内部运作是至关重要的免疫学研究和临床应用。

已经开发了各种测定为了研究蛋白质 - 蛋白质相互作用,然而,生化分析,如广泛使用的免疫共沉淀法,不使蛋白的定位待观察,从而排除了宝贵的见解的观察到的动态蜂窝机制。此外,这些批量的检测通常结合蛋白吨的不同阶段,从许多不同的细胞,可能会对他研究细胞过程。这可以有一个不利的影响时间分辨率。活细胞实时成像的使用允许空间跟踪的蛋白质和信号事件之间的时间分辨能力,从而脱落的过程9,10的动态光。我们提出一个方法的实时成像的T细胞活化过程中的信号复合物的形成。的主要的T细胞或T细胞系,如Jurkat细胞,被转染的质粒编码的单体荧光蛋白融合蛋白质的利益,防止非生理齐聚11。现场T细胞下跌超过盖玻片预先涂有T细胞活化抗体8,9,结合复杂的CD3/TCR的同时克服了需要为特定的活化抗原,诱导T细胞活化。活化细胞都在不断使用共焦显微镜成像。成像数据进行分析,以得到定量的结果,如山坳的信号蛋白的ocalization系数。

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1。 T细胞转染

  1. 准备激活Amaxa Nucleofector溶液混合套件的“补充说明”解决Nucleofector解决方案。激活的解决方案可以被存储在4℃下为不超过三个月。
  2. 成长Jurkat T细胞,在培养基中[10%胎儿小牛血清(FCS),1%青霉素 - 链霉素溶液,2mM L-谷氨酰胺的RPMI。理想情况下,应该使用细胞解冻后1-2周。使用对数生长期的细胞培养,转染效率高和细胞生存的关键。或者,稍作修改,该协议可以使用的主要的T细胞,如前面所述应该强调的是,作为主T细胞的激活过程中的持续时间长于Jurkat T细胞(〜30分钟),显微镜载物台上安装孵化体系必须被用来维持CO 2,湿度水平和温度在整个激活过程。
  3. 收集5个×10 6对数生长期的T细胞转染每到15毫升管。
  4. 离心7分钟,在400×g下在室温下的细胞。
  5. 在离心过程中,准备一个6孔板。填补以及为每个转染在37℃下用5毫升培养基,预孵育
  6. 收集管从离心机中,并弃去上清液。在1毫升的RPMI重悬细胞沉淀。
  7. 离心7分钟,在400×g下在室温下的细胞。
  8. 在离心过程中,准备转染的解决方案。在一个孔的96孔板中,加入100μl混合激活Amaxa Nucleofector在步骤1中制备的溶液与5微克的质粒DNA的编码荧光标记的蛋白的权益。理想情况下,DNA浓度应大于1微克/毫升,以避免稀释的转染溶液。
  9. 轻柔吹打拌匀。
  10. 细胞离心后,小心地取出所有的上清,而不是Disturbing沉淀。
  11. 移液器的DNA /转方案的两倍。
  12. 加入沉淀DNA /转染溶液。
  13. 细胞转移到Amaxa比色皿。
  14. 试管插入到Amaxa Nucleofector设备。
  15. 使用H-10 Amaxa转设置电(为JURKAT)的T-23(主T细胞)。
  16. 从培养箱中取出6孔板。
  17. 电穿孔后,小心地用细胞悬浮液将上清转移到6孔板,使用巴斯德吸管。一种粒料组成的细胞碎片可能形成。避免转移的沉淀。
  18. 孵育细胞24小时,在37°C。
  19. 2.5 ml的细胞悬液转移到一个新的井每口井。向每孔中加入2.5毫升温暖的培养基中(在步骤2中所述)。
  20. 72小时后,细胞转移到一个无菌管和离心7分钟,在400×g下在室温下。弃上清,取代它的Wi个培养基中补充了哺乳动物细胞选择适当的抗生素所用的质粒(适用的浓度适合于所使用的抗生素,我们用G418和/或潮霉素浓度为1.3毫克/毫升和/或0.2毫克/毫升,分别)。在一个新鲜的以及文化的细胞悬液。另外,细胞可被转染瞬时成像转染后48小时。要准备瞬时转染细胞,共同转染细胞与两个质粒同时在第8步,继续正常步骤20,然后直接跳到步骤23。请注意,在这种情况下,细胞应立即使用,一般其荧光强度异构不一定高。
  21. 辅以适当的选择抗生素的培养基培养细胞。分裂细胞,并补充以补充抗生素的培养基中,根据需要。
  22. 2周后,使用流式细胞仪(流感验证成功转染orescence激活细胞分选),如下所示:
  23. 收集10 6转染的细胞,10 6模拟转染的细胞(阴性对照),和10 6个细胞是已知的稳定表达荧光标记的蛋白。如果与一个以上的荧光蛋白(见步骤27)转染的细胞,使用多个单独使用的标签,作为阳性对照的细胞系。
  24. 离心7分钟,在400×g下在室温下的细胞。
  25. 弃上清。将细胞重新悬浮于500μlFACS缓冲液(PBS W / O型的Ca 2 +和Mg 2 +,5%FCS,0.05%叠氮化钠)。
  26. 使用一个分析的流式细胞仪来验证细胞荧光。比较转染的细胞的荧光的阴性和阳性对照。
  27. 转染的细胞与一个额外的,荧光标记的蛋白质,重复步骤3-26,使用转染的细胞。
  28. 显示高水平的荧光的细胞应该被使用。最理想的情况是,至少50%的在培养的细胞应该是高荧光。通过流式细胞仪的细胞分选,可以增加细胞荧光。

任何额外的标记蛋白质,必须融合到不同的荧光基团和不同的选择抗生素质粒编码进行编码。与一个以上的质粒转染的细胞的选择培养基中应补充合适的抗生素。

2。 T细胞传播的含量制备

  1. 使用实验室泰克II德国玻璃罩系统4玻片。确保不意外划伤腔的内表面, 例如用枪头,准备或使用过程中。
  2. 准备玻片制备溶液50毫升:12米(37%),盐酸4.6毫升,加入38.5毫升100%的乙醇和6.9毫升二次蒸馏水。
  3. 填写每个室的幻灯片,用500μl玻片制备解决方案。
  4. 在室温下孵育10分钟。
  5. 吸室,它们完全干燥。
  6. 孵育1小时45°C,直到完全干燥裸露的幻灯片。
  7. 准备双蒸水稀释的0.1%的聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich公司)0.01%聚-L-赖氨酸溶液。
  8. 将500微升每个室。
  9. 孵育15分钟,在室温下滑动。
  10. 吸室,它们完全干燥。
  11. 孵育3小时,在45°C至完全干燥。
  12. 包被的载玻片,可以存储在室温下干燥数月。
  13. 准备激活抗体溶液。使用抗CD3抗体:要么HIT3a(BD Pharmingen公司,#555337)或UCHT1(BD Pharmingen公司,#555330),10微克/毫升于400μlPBS中,每个腔室。这个解决方案应该准备前不久幻灯片准备。
  14. 填充每个腔室的活化的抗体溶液,用400μl。
  15. 孵育2小时,在37℃,或优选的滑动,在4℃下过夜
  16. 删除激活抗体溶胶ution立即洗室300微升PBS两次。从这一点来说,确保商会保持充满缓冲。
  17. 在4℃下存储的PBS填充的滑动我们建议使用准备幻灯片商会在1周内。

3。 T细胞的激活与成像

  1. 准备成像缓冲无酚红] [1.25毫升HEPES(1米),10毫升FCS RPMI,38.75毫升。成像缓冲器可以存储在4℃后,过滤。
  2. 激活蔡司LSM 510元显微镜。显微镜加热的安装架预热至37°C。选择“专家模式”。
  3. 点击“获取”选项卡,并打开以下标签:激光显微镜;配置;扫描时间序列。
  4. 激活所需的激光器。对于激发的MCFP和mYFP设置氩气/ 2激光5分钟,然后到“待机”为“开”。
  5. 如果你已经执行了这个活细胞成像分析之前,使用相同的荧光团,打开LSM文件,点击“重用”我CON,并继续从第9步。否则,继续从第6步。
  6. 定义使用过滤器,适用于所使用的荧光蛋白的激发和发射的信道。
  7. 在“扫描控制”窗口中,选择的Z堆栈选项。
  8. 输入下面的扫描参数:片数:5;间隔:0.5微米;当前切片:3。
  9. 准备在显微镜附近一个数字 Accublock 干浴 LABNET在37°C。
  10. 暖的摄像缓冲液到37℃。
  11. 准备吸的PBS,取而代之的是用600微升的温暖成像缓冲存储的幻灯片。
  12. 孵育的幻灯片,在37°C。保持在孵化滑动,直到第13步中,至少15分钟。
  13. 收集5×10 5转染的T细胞。
  14. 在400×g离心2分钟的细胞。
  15. 弃上清。
  16. 1毫升温成像缓冲液中的悬浮细胞,并将它们转移到1.5毫升的Eppendorf管。
  17. 放置吨EST管上的的数字Accublock干浴。
  18. 从孵化器中加热的幻灯片,把它安装在温暖显微镜安装架。
  19. 点击“VIS”图标。
  20. 混合细胞悬液,除去1-2微升。
  21. 的移液管的尖端插入到成像缓冲器的底部上方的滑动。避免刮伤幻灯片。
  22. 种子细胞对客观的光圈。
  23. 视觉跟踪荧光细胞立即开始下降。选择一个单元格,显示在两个通道中的高荧光。
  24. 前的细胞到达表面的滑动,激活的LSM模式下。
  25. 切换只有一个激发激光。选择激光,你有DIC通道。
  26. 设置缩放1。点击“快速XY”图标。点击“停止”图标。使用“裁剪”工具,选择细胞中心的投资回报率。
  27. 设置缩放至3。点击“快速XY”图标,然后手动将焦点设置到最佳观看细胞。点击“停止”ICO名词
  28. 切换所需的所有激励激光器。
  29. 开始记录点击的“StartT”图标。图片的单元格的扩展处理的全部(通常为5分钟)。完成后,单击“停止”图标。
  30. 保存该文件。
  31. 为了获得更多的细胞,点击“VIS”图标。如果存在还没有接触到的幻灯片的底部的细胞,从步骤23继续。避免成像细胞已经开始蔓延过程。否则,请继续步骤32。
  32. 如果观察到的幻灯片区域主要是缺乏的细胞,添加另一个细胞(继续从第20步)等分。否则,继续执行步骤33。
  33. 为了获得额外的电池,移动幻灯片,使该地区上述目标的光圈是缺乏的细胞。
  34. 添加另一个细胞(和继续从第20步)等分。
  35. 执行所有所需的成像后,打开保存的LSM文件。
  36. 点击“图库”,“时间+ Z”和“子集”。
  37. 选择relevant为时间范围和Z堆栈。
  38. 保存新的文件。
  39. 所有影像文件执行步骤35-38。

4。成像数据分析

  1. 打开LSM文件使用Imaris里软件(位平面AG,瑞士苏黎世)。
  2. 点击“超越”。点击“图像处理”菜单,并选择“交换时间和Z”。这将有助于在正确的裁剪的图像。
  3. 点击“编辑”工具栏,在下拉菜单中选择“剪裁3D”选项。裁剪图像只包括区域周围的细胞。我们建议种植细胞集中在了300×300像素的正方形。需要注意的是细胞的形状和位置可以随时间变化。观察的t轴线,确保细胞在所有时间点的裁剪区域内。
  4. 点击“图像处理”菜单,并选择“交换时间和Z”恢复原来的时空分离的图像。
  5. 按“COLOC的”主工具栏上的按钮。选择“生成时间德第COLOC Imaris里会自动计算每个信道在各时间点的强度阈值。
  6. 共存分析的结果选择“通道统计”。点击“导出”,导出数据。
  7. 重复步骤1到6,每个成像单元。我们建议在这种方式中,至少50个细胞进行分析。
  8. 计算平均皮尔逊的共存系数及其标准的错误或偏差。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

我们提出现场T细胞成像和分析的一个例子。成像实验之前,SLP76缺陷的T细胞(J14)确定的荧光蛋白的表达( 图1)与使用的FACS分析。标签信令的蛋白质MCFP-NCK和SLP76 mYFP的的转染T细胞激活幻灯片和沉积在成像过程中T细胞的扩散( 图2)。收集到的图像显示在整个激活和扩散( 图3)的蛋白质的定位的动态。电脑图像处理提供了新的见解和定量信息的可视化细胞,同时最大限度地减少人为偏差。要检查整个细胞活化过程中的两种蛋白质共存,我们利用Imaris里的软件工具(位平面AG,瑞士苏黎世)共存。通过比较不同时间点之间的共存系数跨越成像细胞,我们能够确定NCK和SLP76共定位,并不显着改变整个T细胞活化(P> 0.3)( 图4)。

图1
图1。流式细胞仪分析细胞双染荧光标记的蛋白质,数据显示为荧光强度的直方图(A)MCFP;(B)mYFP;(C)点图。 J14细胞转染与MCFP NCK和SLP76 mYFP的的荧光强度,青色和黄色,分别表示。未转染J14阴性对照组用黑线表示。

/ files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg的“/>
图2。现场的示意图T细胞扩散试验(A)(B)编制T细胞活化的幻灯片;住T细胞扩散试验和分析;(C)显微设置。 点击这里查看大图

图3
图3。 NCK和SLP76分布在T细胞活化过程中表达MCFP NCK和SLP76 mYFP的的下跌超过抗-CD3刺激抗体预涂盖玻片,不断一段7分钟的成像。 MCFP-NCK表示的青色,而SLP76 mYFP的显示为黄色。


图4。使用Imaris里软件(位平面AG,瑞士苏黎世)进行定量分析蛋白质共存的细胞图像处理。 MCFP信道的强度和对每一个像素的mYFP通道之间的Pearson相关系数的计算公式为共定位。皮尔逊的共存系数计算不同时间点进行了比较。 30秒进入激活过程,共存系数MCFP NCK和SLP76 mYFP的的显着增加(P <0.05)。这些结果进行计算分析> 50个独立的细胞。平均值±标准错误。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

多种细胞过程的调节和功能依赖于蛋白质 - 蛋白质相互作用的形成和终止。荧光标记的蛋白质在活细胞显微成像可以实时跟踪。标签的蛋白的共定位,能否提供一个直接或间接的蛋白质之间的相互作用,可以用来加强通过生物化学的方法,如免疫沉淀获得的研究结果。与生化方法不同的是,活细胞成像可以观察这些蛋白间的相互作用空间,随着时间的推移,促进发生的生理过程的监测和检测的蛋白质在细胞中的分布。已经开发了各种工具,用于定量分析的共定位,Pearson相关系数的量化的程度的两种蛋白质之间的共定位12仍然是一个非常有吸引力的和广泛使用的方法。虽然荧光共振ê能源科技转移(FRET)的实验使蛋白间的相互作用,其特征在于由靠近(10纳米)的检测,该方法需要专门设置(设备和兼容使用的荧光的Tagging)和复杂的数据处理。对于大多数用途,共定位分析,结合生化方法,构成一个易于使用的,随着时间的推移观察蛋白质 - 蛋白质相互作用的简单的方法。

建立用于分析​​的像素的荧光强度的阈值,而忽略低于强度阈值的任一通道的像素,是至关重要的准确和灵敏的共定位分析。科斯特这些阈值的目标和自动测定常用算法开发13和Imaris里和Volocity图像处理程序,如实施。

在这里,我们展示了使用的活的T细胞成像SLP76动态分析的方法,在T细胞中的一个关键支架和Nck和一个适配器蛋白,这两者都是必不可少的T细胞活化14,15。画像的T细胞在激活过程中收集的整个细胞激活过程中,这两种蛋白的共定位( 图3)。这是定量证实皮尔逊的共存测试整个激活过程中收集到的图像通过执行。皮尔逊的的共存系数范围从-1到1,-1表示得分反相关,得分为1表示完美的共存和0意味着两个图像通道之间没有相关性。 Pearson的系数计算不同时间点和不同的细胞共定位的比较表明,共定位NCK和SLP76不显着改变在细胞活化,但保持不变的(P> 0.3, 图4)。虽然整体共存合作这些蛋白质的效率在整个活化过程中不会改变,它并不能消除的可能性,这些蛋白质18之间发生的关联和解除关联的一个动态的过程。

提出的协议中,我们也可以适应其他的造血细胞系中,根据需要通过调节细胞的生长条件,选择适合的细胞系的转染设置和修改的细胞的激活过程中,如果适用。请注意,当我们使用LSM 510元共聚焦显微镜,用适当的调整和使用设置,其他共聚焦显微镜系统可以成功地使用,以及获得。

现场T细胞成像允许使用直接监控,监管和激活过程,使信号无法使用生化和分子生物学方法,时间和空间分辨率的事件加以探讨。我们提出了一个简单的方法外径进行现场扩散法,T细胞相关蛋白在实时监测和分析数据,得到定量的结果。得到的显微镜数据也可以被用于其他下游的应用,如细 ​​胞形状指数分析16 FRET分析17,18中 ,根据具体的实验装置和研究目标。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

我们没有利益冲突的披露。

Acknowledgments

作者感谢索菲亚炸的技术援助。 MBS感谢以下机构为他们的研究支持:以色列科学基金会补助no.1659/08,971/08,1503/08和491/10,没有补助的健康与科学部。 3-4114和3-6540,透过地产已故的亚历山大Smidoda的,以色列癌症协会和Taubenblatt家庭基金会为生物医药的卓越补助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
T细胞实时成像实时信号复合物的形成
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).More

Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter