Summary
We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.
Abstract
Bescherming tegen besmettelijke ziekten gemedieerd door het immuunsysteem 1,2. T-lymfocyten zijn het meestercoördinatoren van het immuunsysteem, het reguleren van de activatie en reacties van meerdere immuuncellen 3,4. T-celactivering is afhankelijk van de herkenning van antigenen weergegeven door antigen presenterende cellen (APCs). De T-cel antigeen receptor (TCR) is voor elke T-cel kloon en bepaalt antigeenspecificiteit 5. De binding van de TCR aan het antigeen induceert fosforylatie van componenten van het TCR complex. Om T-cel activatie te bevorderen, moet dit signaal worden getransduceerd door het membraan naar het cytoplasma en de nucleus, inleiding diverse belangrijke reacties zoals recrutering signaaleiwitten de TCR, APC site (de immune synaps), hun moleculaire activatie, cytoskelet omlegging, verhoging van de intracellulaire calciumconcentratie en veranderingen in genexpressie 6,7. De juistitiation en beëindiging van activerende signalen cruciaal passende T-celreacties. De activiteit van signaaleiwitten is afhankelijk van de vorming en ontbinding van eiwit-eiwit interacties posttranslationele modificaties zoals proteïne fosforylatie, vorming van eiwitcomplexen, eiwit ubiquitinering en de rekrutering van diverse cellulaire eiwitten plaatsen 8. Inzicht in de werking van de T-cel activatie proces is voor zowel immunologisch onderzoek en klinische toepassingen.
Verschillende assays werden ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties te onderzoeken, maar niet biochemische assays, zoals de gebruikte co-immunoprecipitatie werkwijze niet toe eiwit locatie te onderscheiden, waardoor elke waarneming waardevolle inzichten in de dynamiek van cellulaire mechanismen. Bovendien, deze massa assays combineert gewoonlijk eiwitten uit verschillende cellen die mogelijk in verschillende stadia van de tHij onderzocht cellulaire proces. Dit kan een nadelig effect op temporele resolutie hebben. Het gebruik van real-time beeldvorming van levende cellen kunnen zowel de ruimtelijke volgen van eiwitten en het vermogen om tijdelijk onderscheiden signalerende gebeurtenissen, dus licht werpen op de dynamiek van het proces 9,10. We stellen een werkwijze real-time imaging van signaal-complexvorming in T-cel activatie. Primaire T-cellen of T-cellijnen, zoals Jurkat, getransfecteerd met plasmiden die coderen voor eiwitten van belang gefuseerd aan monomere fluorescerende eiwitten, dat niet-fysiologische oligomerisatie 11. Levende T-cellen worden neergezet op een dekglaasje vooraf bekleed met T-cel activerende antilichaam 8,9, dat bindt aan het CD3/TCR complex, induceren T-celactivering terwijl overwinnen dat specifieke activerende antigenen. Geactiveerde cellen voortdurend afgebeeld met het gebruik van confocale microscopie. Beeldgegevens worden geanalyseerd om kwantitatieve resultaten, zoals col opbrengstocalization coëfficiënt van de signalering eiwitten.
Protocol
1. T-cel transfectie
- Bereid de geactiveerde Amaxa Nucleofector oplossing door het mengen van de kit "Supplement" oplossing voor het Nucleofector Solution. De geactiveerde oplossing kan bij 4 ° C gedurende drie maanden opgeslagen.
- Kweek Jurkat T-cellen in kweekmedium [10% foetaal kalf serum (FCS), 1% penicilline-streptomycine-oplossing en 2 mM L-glutamine in RPMI]. Optimaal dienen cellen worden 1-2 weken na ontdooien. Met behulp van celculturen in logaritmische groei is cruciaal voor hoge transfectie-efficiëntie en overleving van cellen. Als alternatief, met kleine modificaties, dit protocol kan worden gebruikt met primaire T-cellen, zoals eerder beschreven 8. Er zij op gewezen dat de duur van het activeringsproces van primaire T-cellen langer dan die van Jurkat T-cellen (~ 30 min) is, een microscoop podium geplaatst incubatiesysteem worden gebruikt om CO2, luchtvochtigheid en temperatuur in het handhaven activeringsproces.
- Verzamel 5× 10 6 log-fase-T-cellen per transfectie in een 15-ml tube.
- Centrifugeer cellen gedurende 7 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur.
- Tijdens het centrifugeren, bereiden een 6-wells plaat. Vul een putje per transfectie met 5 ml kweekmedium, en pre-incuberen bij 37 ° C.
- Verzamel de buizen van de centrifuge en gooi het supernatant. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml RPMI.
- Centrifugeer cellen gedurende 7 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur.
- Tijdens het centrifugeren, de voorbereiding van de transfectie oplossing. In een well van een 96-well plaat, meng geactiveerde 100 ul Amaxa Nucleofector bereid in stap 1 met 5 ug van het plasmide DNA van belang codeert voor een fluorescent gemerkt eiwit. Optimaal dienen DNA concentratie dan 1 ug / ml zijn om te voorkomen dat verdunning van de transfectie-oplossing.
- Meng goed door zachtjes te pipetteren.
- Na centrifugeren van de cellen, verwijder voorzichtig de supernatant zonder dat disturbing de pellet.
- Pipetteer de DNA / transfectieoplossing tweemaal.
- Voeg de DNA / transfectieoplossing de pellet.
- Breng de cellen naar de Amaxa cuvette.
- Plaats de cuvet in de Amaxa Nucleofector apparaat.
- Gebruik de H-10 Amaxa transfectie setting voor elektroporatie (bij Jurkat) of T-23 (voor primaire T-cellen).
- De 6-well plaat uit de incubator.
- Na elektroporatie Breng voorzichtig de supernatant met de celsuspensie aan de 6-well plaat met behulp van een Pasteur pipet. Een pellet bestaande uit celresten kunnen vormen. Vermijd overdracht van de pellet.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C.
- Overdracht van 2,5 ml celsuspensie uit elk putje in een nieuwe put. Voeg 2,5 ml warm kweekmedium (beschreven in stap 2) aan elk putje.
- Na 72 uur, dragen de cellen naar een steriele buis en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en vervang het with kweekmedium aangevuld met de zoogdiercel selectie antibioticum geschikt voor het toegepaste plasmide (toepassing een geschikte concentratie voor de gebruikte antibiotica, gebruikten we G418 en / of hygromycine in een concentratie van 1,3 mg / ml en / of 0,2 mg / ml, respectievelijk). Cultuur van de celsuspensie in een frisse goed. Alternatief kunnen cellen tijdelijk worden getransfecteerd en afgebeeld 48 uur na transfectie. Om transient getransfecteerde cellen te bereiden, co-transfecteren de cellen met de twee plasmiden tegelijkertijd bij stap 8, blijven normaliter naar stap 20, en vervolgens ga dan direct door naar stap 23. Merk op dat in dit scenario, de cellen onmiddellijk gebruikt te worden, en in het algemeen hun fluorescentie-intensiteit is heterogeen en niet per se hoog.
- Groeien cellen met kweekmedium aangevuld met de juiste selectie antibioticum. Splits de cellen en aan te vullen met antibiotica aangevuld kweekmedium als dat nodig is.
- Na 2 weken, controleren succesvolle transfectie met het gebruik van FACS (grieporescence-geactiveerde celsortering) als volgt:
- Verzamel 10 6 getransfecteerde cellen 10 6 schijn-getransfecteerde cellen (negatieve controle) en 10 6 cellen waarvan bekend is dat het stabiel tot expressie fluorescent gemerkte eiwit. Als cellen worden met meerdere fluorescent eiwit (zie stap 27), gebruik van meerdere, afzonderlijk gelabeld cellijnen als positieve controles.
- Centrifugeer cellen gedurende 7 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant. Resuspendeer cellen in 500 pi FACS buffer (PBS w / o Ca2 + en Mg2 +, 5% FCS, 0,05% natriumazide).
- Een analytisch FACS cellulaire fluorescentie controleren. Vergelijk fluorescentie van de getransfecteerde cellen aan die van de negatieve en positieve controles.
- Om de cellen te transfecteren met een extra, fluorescent gemerkte eiwit Herhaal stap 3-26 met de getransfecteerde cellen.
- Cellen die hoge niveaus van fluorescentie worden gebruikt. Optimaal, ten minste 50% vande cellen in de kweek moet zeer fluorescent. Cel fluorescentie kan worden verhoogd met celsorteren via FACS.
Eventuele extra gemerkte eiwitten worden gefuseerd aan verschillende fluoroforen en worden gecodeerd op plasmiden die coderen voor verschillende antibiotica selectie. Selectiemedium voor cellen getransfecteerd met meer dan een plasmide worden aangevuld met de juiste antibiotica.
2. T-cel verspreiden Assay Voorbereiding
- Gebruik Lab-Tek II Duitse coverglass systeem 4 kamer dia's. Zorg ervoor dat niet per ongeluk krassen op de binnenkant van de kamers, bijv. met een pipet tip, tijdens de bereiding of het gebruik.
- Bereid 50-ml dia voorbereiding oplossing: Neem 4,6 ml van 12 M (37%) HCl, voeg 38,5 ml 100% ethanol en 6,9 ml dubbel gedestilleerd water.
- Vul elke kamer van de dia met 500 pi glijbaan voorbereiding oplossing.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Aspireren de kamers, drogen ze volledig.
- Incubeer de onbedekte glaasjes gedurende 1 uur bij 45 ° C tot volledig droog.
- Bereid 0,01% poly-L-lysine-oplossing door verdunning 0,1% poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) in dubbel gedestilleerd water.
- Toepassing 500 ul aan elke kamer.
- Incubeer de glijbaan voor 15 min bij kamertemperatuur geroerd.
- Aspireren de kamers, drogen ze volledig.
- Incubeer 3 uur bij 45 ° C tot volledig droog.
- Gecoate glaasjes kunnen droog worden opgeslagen verscheidene maanden bij kamertemperatuur.
- Bereid een activerende antilichaam oplossing. Gebruik van een anti-CD3-antilichaam: ofwel HIT3a (BD Pharmingen, # 555.337) of UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml in 400 pl PBS, per kamer. Deze oplossing moet worden voorbereid kort voor de bereiding glijbaan.
- Vul elke kamer met 400 ul van de activerende antilichaam oplossing.
- Incubeer de glijbaan voor 2 uur bij 37 ° C of, bij voorkeur, een nacht bij 4 ° C.
- Verwijder het activerende antilichaam solution en spoel de kamer twee keer met 300 pi PBS. Vanaf dit punt, zorg ervoor dat de kamers gevuld blijven met buffer.
- Bewaar de PBS-gevulde schuif bij 4 ° C. We raden het gebruik van de voorbereide dia kamers binnen 1 week.
3. T-cel activering en imaging
- Bereid beeldvorming buffer [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38,75 ml RPMI zonder fenol rood]. Imaging buffer bij 4 ° C na filtratie worden opgeslagen.
- Activeer de Zeiss LSM 510 Meta microscoop. Verwarm de microscoop verwarmbare montageframe tot 37 ° C. Selecteer "Expert mode".
- Klik op het tabblad "Acquire" en open de volgende tabbladen: Lasers; Microscopy, Configuration, Scan, Time Series.
- Activeer de benodigde lasers. Voor excitatie van mCFP en mYFP, zet de Argon / 2 laser op "standby" gedurende 5 minuten, daarna op "on".
- Als je deze live-cell imaging-test hebben uitgevoerd vóór, met dezelfde fluoroforen, opent u het resulterende LSM-bestand, klikt u op het "hergebruik" icon, en ga verder met stap 9. Anders verder met stap 6.
- Definieer kanalen van geschikte filters voor excitatie en emissie van de fluorescerende eiwitten gebruikt.
- In het venster "Scan control", selecteer de stack optie Z.
- Voer de volgende scan parameters: Aantal schijfjes: 5; Interval: 0,5 micrometer; Huidige slice: 3.
- Bereid een Accublock Digital Dry Bath (Labnet) bij 37 ° C in de buurt van de microscoop.
- Verwarm de beeldvorming buffer tot 37 ° C.
- Bereid de opgeslagen dia door opzuigen van de PBS, te vervangen door 600 ul van warme beeldvorming buffer.
- Incubeer de glijbaan bij 37 ° C. Houd de schuif in de incubator tot stap 13, gedurende tenminste 15 minuten.
- Verzamel 5 x 10 5 getransfecteerde T cellen.
- Centrifugeer cellen gedurende 2 minuten bij 400 x g.
- Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer cellen in 1 ml warme beeldvorming buffer, en overbrengen naar een 1,5 ml Eppendorf buis.
- Plaats de test buis op de Accublock Digital Dry Bath.
- Neem de verwarmde dia uit de incubator, en monteer het op de verwarmde microscoop montageframe.
- Klik op de "VIS" icoon.
- Meng de celsuspensie en verwijder 1-2 pl.
- Steek de punt van de pipet in het beeldvormende buffer boven de bodem van de schuif. Voorkom krassen op de glijbaan.
- Zaad van de cellen over opening van de doelstelling van.
- Onmiddellijk beginnen visueel volgen van de fluorescerende cellen als ze afdalen. Selecteer een cel die hoge fluorescentie weergeeft in beide kanalen.
- Vóór de cel het oppervlak van de schuif bereikt, activeert de LSM-modus.
- Toggle slechts een excitatie laser. Selecteer een laser waarvoor u een DIC kanaal.
- Stel Zoom naar 1. Klik op de "Fast XY" icoon. Klik op het pictogram "Stop". Met behulp van het gereedschap Uitsnijden, selecteer een ROI gecentreerd op de cel.
- Stel Zoom naar 3. Klik op de "Fast XY" icoon, vervolgens handmatig de focus in te stellen naar de cel optimaal te bekijken. Klik op de "Stop" icon.
- Schakelen alle benodigde excitatie lasers.
- Begin met opnemen door te klikken op het pictogram "StarTT". Beeld de cel voor het geheel van het verspreidorgaan proces (gewoonlijk 5 min). Wanneer u klaar bent, klikt u op het pictogram "Stop".
- Sla het bestand op.
- Om extra cellen te verkrijgen, klikt u op de "VIS" icoon. Als er cellen die nog niet in aanraking zijn gekomen met de onderkant van de dia's, verder vanaf stap 23. Vermijd beeldvorming cellen die al begonnen de verspreiding proces. Anders gaat u door naar stap 32.
- Als de waargenomen diagebied is grotendeels verstoken van cellen, voeg een ander monster van cellen (verder bij stap 20). Anders gaat u door naar stap 33.
- Om extra cellen te verwerven, verplaats de schuif zodat het gebied boven de opening van de doelstelling is verstoken van cellen.
- Voeg nog een monster van cellen (en ga verder vanaf stap 20).
- Na het uitvoeren van alle gewenste beeldvorming, opent u een opgeslagen bestand LSM.
- Klik op "Gallery", "Time + Z" en "subset".
- Selecteer de relevant tijd bereik en Z-stack.
- Sla het nieuwe bestand.
- Voer de stappen 35-38 voor alle beeldvormende bestanden.
4. Imaging Data Analysis
- Open de LSM-bestanden met behulp van Imaris software (Bitplane AG, Zürich Zwitserland).
- Klik op "Overtref". Klik op het menu "Image Processing", en selecteer "Swap Time en Z". Dit zal helpen bij de juiste bijsnijden van de afbeelding.
- Klik op de werkbalk "Bewerken" en selecteer de optie 'Crop 3D "in het drop-menu. Bijsnijden van de afbeelding om alleen het gebied rondom de cel omvatten. Wij stellen voor bijsnijden van een 300 × 300 pixel vierkant gecentreerd op de cel. Merk op dat de vorm en de ligging van de cel kan veranderen in de tijd. Het observeren van de t-as, zorg ervoor dat de cel binnen het bijgesneden gebied op alle tijdstippen.
- Klik op het menu "Image Processing", en selecteer "Swap Time en Z" aan de oorspronkelijke tijdelijke scheiding van het beeld te herstellen.
- Druk op de "Coloc" knop op de belangrijkste werkbalk. Selecteer "Build Time Dep. Coloc ". Imaris berekent automatisch de intensiteit drempels voor elk kanaal op elk tijdstip.
- Bekijk de resultaten van de colocalization analyse door het selecteren van "Kanaal Statistics". De gegevens te exporteren door te klikken op "Exporteren".
- Herhaal de stappen 1 tot en met 6 voor elke verbeelde cel. We raden ten minste 50 cellen geanalyseerd op deze manier.
- Bereken de gemiddelde colocalization coëfficiënt Pearson's en de standaardafwijking of deviatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We geven een voorbeeld van levende T-cell imaging en analyse. Voorafgaand aan de beeldvormende experiment werden SLP76 deficiënte T-cellen (J14) geanalyseerd met gebruik van FACS om de expressie van de fluorescerende eiwitten (Figuur 1) te bepalen. T-cellen getransfecteerd met de gelabelde signaaleiwitten mCFP-Nck en SLP76-mYFP werden afgezet over activeren slides en afgebeeld in T-cell spreiding (figuur 2). Verzamelde beelden tonen de dynamiek van eiwit lokalisatie in activering en verspreiding (Figuur 3). Geautomatiseerde beeldverwerking biedt nieuwe inzichten en kwantitatieve informatie uit de gevisualiseerde cellen, terwijl het minimaliseren van de menselijke vooringenomenheid. Om de colocalization van de twee eiwitten te onderzoeken gedurende de cellulaire activatie-proces, we gebruik gemaakt van de colocalization instrument van de Imaris software (Bitplane AG, Zürich Zwitserland). Door de colocalization coëfficiënten tussen verschillende tijdstippen te vergelijken over verbeelde cellen, waren we kunnen vaststellen dat de colocalization van Nck en SLP76 niet significant verandert gedurende de T-cel activatie (p> 0,3) (figuur 4).
Figuur 1. FACS-analyse van cellen dubbel getransfecteerd met fluorescent gelabelde eiwitten gegevens worden getoond als fluorescentie-intensiteit histogrammen voor (A) mCFP;. (B) mYFP, en (C) als een dot plot. Fluorescentie-intensiteit van J14-cellen die met mCFP-Nck en SLP76-mYFP zijn vertegenwoordigd in cyaan en geel, respectievelijk. Ongetransfecteerde J14 negatieve controle cellen worden aangegeven met zwarte lijnen.
/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
Figuur 2. Een schematische weergave van de live T-celspreiding assay (A) De voorbereiding van T-cel activerende slides;. (B) woont T-celspreiding test en analyse;. (C) microscopie setup Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Verdeling van Nck en SLP76 tijdens de T-cel activering. Cellen die mCFP-Nck en SLP76-mYFP gedropt op anti-CD3 antilichaam stimulerende pre-coated dekglaasjes en constant afgebeeld gedurende 7 minuten. mCFP-Nck wordt vertegenwoordigd door cyaan, terwijl SLP76-mYFP wordt getoond in het geel.
Figuur 4. Kwantitatieve analyse van eiwitten colocalization. Beeldverwerking van cellen werd uitgevoerd met de software Imaris (Bitplane AG, Zürich Switzerland). Colocalisatie wordt berekend als de Pearson correlatiecoëfficiënt tussen de intensiteiten van de mCFP kanaal en mYFP kanaal voor elke pixel. Pearson's colocalization coëfficiënten berekend uit verschillende tijdstippen worden vergeleken. Dertig seconden in het activeringsproces, werd het colocalization coëfficiënt van mCFP-Nck en SLP76-mYFP aanzienlijk toegenomen (p <0,05). Deze resultaten werden berekend door analyse> 50 onafhankelijke cellen. Gemiddelde ± standaardafwijking worden weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De regulatie en werking van verschillende cellulaire processen zijn afhankelijk van de vorming en de beëindiging van eiwit-eiwit interacties. Microscopische beeldvorming maakt de real-time tracking van fluorescent gelabelde eiwitten in levende cellen. Colocalization van gemerkte eiwitten suggereren een directe of indirecte interactie tussen de eiwitten en kunnen worden gebruikt om de verkregen resultaten van biochemische werkwijzen, zoals immunoprecipitatie versterken. In tegenstelling tot de biochemische methoden, leef-cell imaging maakt deze inter-eiwit interacties ruimtelijk en in de tijd te worden geobserveerd, het vergemakkelijken van de bewaking van fysiologische processen als ze zich voordoen en de opsporing van de cellulaire verdeling van eiwitten. Diverse gereedschappen voor de kwantitatieve analyse van colocalization zijn ontwikkeld; Pearson correlatiecoëfficiënt blijft een zeer aantrekkelijk en breed beschikbare methode voor de kwantificering van de mate van co-lokalisatie tussen twee eiwitten 12. Terwijl fluorescentie resonantie energy transfer (FRET) experimenten kan de detectie van inter-eiwitinteracties gekenmerkt door de nabijheid (10 nm), vereist deze werkwijze gespecialiseerde instellingen (apparatuur en compatibiliteit van fluorescente taggings gebruikt) en complexe verwerking. Voor de meeste toepassingen, colocalization analyse in conjugatie met biochemische methoden, vormt een eenvoudig te gebruiken en eenvoudige methode voor de waarneming eiwit-eiwit interacties in de tijd.
De oprichting van een fluorescentie-intensiteit drempel voor geanalyseerd pixels, terwijl het negeren van pixels onder de intensiteit drempel voor beide kanalen, is van cruciaal belang voor een nauwkeurige en gevoelige colocalization analyse. De meest gebruikte algoritme voor het doel en geautomatiseerde bepaling van deze drempels is ontwikkeld door Costes et al.. 13 en wordt uitgevoerd door beeldbewerking programma's zoals Imaris en Volocity.
Hier tonen we het gebruik van het levende T-cell imaging werkwijze voor het analyseren van de dynamiek van SLP76, een belangrijke steiger in T cellen en Nck, een adapter eiwit, die beide essentieel zijn voor T-celactivering 14,15. Afbeeldingen van T-cellen tijdens activatie verzameld suggereren dat de twee eiwitten in de cellulaire colocalized activeringsproces (figuur 3). Dit wordt kwantitatief bevestigd door het uitvoeren van de Pearson's colocalization test beelden gedurende het activeringsproces verzameld. De Pearson's colocalization coëfficiënten variëren van -1 tot 1, waarbij een score van -1 betekent anti-correlatie, een score van 1 betekent een perfecte colocalization en 0 betekent geen correlatie tussen de twee beeld kanalen. Vergelijking van Pearson's colocalization coëfficiënten berekend voor verschillende tijdstippen en in verschillende cellen blijkt dat colocalization van Nck en SLP76 niet significant veranderen tijdens cellulaire activatie, maar blijft constant (p> 0,3, figuur 4). Hoewel de algemene colocalization coefficiënte van deze eiwitten niet verandert gedurende het activeringsproces, is het niet de mogelijkheid van een dynamisch proces van associatie en dissociatie optreedt tussen deze eiwitten 18 elimineren.
Het gepresenteerde protocol we kunnen ook worden aangepast aan andere hematopoietische cellijnen door aanpassing cel groeiomstandigheden naar behoefte een transfectie instelling geschikt voor de cellijn in kwestie te selecteren en modificeren van de cellulaire activering, indien van toepassing. Houd er rekening mee dat, terwijl we de LSM 510 Meta confocale microscoop, met de nodige aanpassingen en het gebruik van instellingen, andere confocale microscopie systemen kunnen worden gebruikt met succes ook.
Het gebruik van levende T-cell imaging maakt de regelgeving en activering processen direct te worden gecontroleerd, waardoor signalering gebeurtenissen worden verkend met de temporele en ruimtelijke resolutie beschikbaar met behulp van biochemische en moleculaire methoden. We presenteren een eenvoudige method voor het uitvoeren van een live T-cel verspreiding assay controle relevante proteïnen in real-time en analyseren van de gegevens van kwantitatieve resultaten. Resulterende microscopie gegevens kunnen ook worden gebruikt voor andere stroomafwaartse toepassingen zoals mobiele-vormindex analyse 16 en FRET analyse 17,18, afhankelijk van de specifieke experimentele opzet en onderzoeksdoeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken Sophia Fried voor technische ondersteuning. MBS bedankt de volgende organisaties voor hun onderzoek support: The Israel Science Foundation voor subsidies no.1659/08, 971/08, 1503-1508 en 491/10, de ministeries van Volksgezondheid en Wetenschap voor subsidies niet. 3-4114 en 3-6540, het Israël Cancer Association door de Estate van wijlen Alexander Smidoda, en de Taubenblatt Family Foundation voor de Bio-medische excellentie subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame - Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 | |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
