Summary
אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.
Abstract
הגנה מפני מחלות זיהומיות מתווכת על ידי 1,2 המערכת החיסונית. לימפוציטים מסוג T הם רכזי האב של מערכת החיסון, המסדיר את ההפעלה ותגובות של תאים חיסוניים 3,4 מרובים. הפעלת תא T תלויה בהכרה של אנטיגנים ספציפיים המוצגים על ידי תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים). קולט אנטיגן T-cell (TCR) ספציפי לכל שיבוט תאי T וקובע סגוליות אנטיגן 5. הכריכה של TCR לאנטיגן גורמת לזירחון של מרכיבי קומפלקס TCR. על מנת לקדם את הפעלת תא T, אות זה חייב להיות transduced מן הקרום אל הציטופלסמה והגרעין, ייזום תגובות שונות חיוניות כגון גיוס של חלבוני איתות לTCR; אתר APC (סינפסה החיסונית), ההפעלה המולקולרית שלהם, סידור מחדש cytoskeletal, גובה של ריכוז סידן תוך תאי, ושינויים בביטוי גני 6,7. הנכוןitiation וסיום של אותות המפעילים הוא קריטי לתגובות תא T המתאימות. הפעילות של חלבוני איתות תלויה בהיווצרות וסיום האינטראקציות בין חלבונים, לפרסם שינויי translational כגון זרחון חלבון, היווצרות של קומפלקסי חלבונים, ubiquitylation החלבון וגיוס של חלבונים לאתרים שונים 8 סלולריים. הבנת הפעולה הפנימית של תהליך הפעלת תא T היא קריטית עבור מחקר חיסוני ויישומים קליניים.
מבחני שונים פותחו כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים, עם זאת, מבחני ביוכימיים, כגון שיטת שיתוף immunoprecipitation בשימוש נרחב, אינם מאפשרים מיקום חלבון להיה להבחין, ובכך נמנע אפשרות התצפית של תובנות רבות ערך לדינמיקה של הסלולר מנגנונים. בנוסף, מבחני אלה בדרך כלל בתפזורת לשלב חלבונים מהתאים רבים ושונים שעשויות להיות בשלבים שונים של t שוניםהוא חקר את התהליך סלולרי. זה יכול להיות השפעה מזיקה על החלטה זמנית. השימוש בהדמיה בזמן אמת של תאי חיים מאפשר גם מעקב המרחבי של חלבונים ואת היכולת להבחין בין temporally אירועי איתות, ובכך שופך אור על הדינמיקה של תהליך 9,10. אנו מציגים שיטה של הדמיה בזמן אמת של היווצרות איתות-מורכבת במהלך הפעלת תא T. T-cell קווים, כגון Jurkat T-תאים ראשוניים או, הם transfected עם פלסמידים קידוד לחלבונים של עניין התמזגו לחלבוני ניאון monomeric, מניעת oligomerization הלא פיסיולוגי 11. חיים תאי T הם ירדו מעל coverslip מראש מצופה עם נוגדן תא T הפעלת 8,9, אשר נקשר למתחם CD3/TCR, גרימת הפעלת תאי T תוך התגברות על הצורך בהפעלת אנטיגנים ספציפיים. תאים הופעל הם צילמו כל הזמן עם השימוש במיקרוסקופיה confocal. נתוני הדמיה מנותחים להניב תוצאות כמותיות, כגון colמקדם ocalization של חלבוני האיתות.
Protocol
1. Transfection תא T
- הכן את פתרון Nucleofector Amaxa הופעל על ידי ערבוב הפתרון "מוסף" של הערכה לפתרון Nucleofector. הפתרון מופעל עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
- לגדל תאי T Jurkat במדיום התרבות [10% עוברי עגל בסרום (FCS), 1% פניצילין, סטרפטומיצין פתרון, ו2 מ"מ L-גלוטמין בRPMI]. בצורה אופטימלית, יש להשתמש בתאים 1-2 שבועות לאחר ההפשרה. שימוש בתרביות תאים בגידול לוגריתמי הוא חיונית ליעילות transfection גבוהה והישרדות תא. לחלופין, עם שינויים קלים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם תאי T עיקריים, כפי שתואר בעבר 8. יודגש, כי כמשך הזמן של תהליך ההפעלה של תאי T העיקריים היא ארוך יותר מזה של Jurkat תאי T (~ 30 דקות), במה מיקרוסקופ רכוב מערכת דגירה יש להשתמש כדי לשמור על CO 2, רמות לחות וטמפרטורה בכל תהליך הפעלה.
- לאסוף 5× יומן שלב 10 6 תאי T לכל transfection לתוך צינור 15 מ"ל.
- צנטריפוגה תאים ל7 דקות ב 400 × גרם בטמפרטורת חדר.
- במהלך צנטריפוגה, להכין צלחת 6 באר. מלא אחד גם עבור כל transfection עם 5 מיליליטר מדיום התרבות, ומראש דגירה על 37 ° C.
- לאסוף את הצינורות מצנטריפוגה וזורקים supernatant. Resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר RPMI.
- צנטריפוגה תאים ל7 דקות ב 400 × גרם בטמפרטורת חדר.
- במהלך צנטריפוגה, להכין את פתרון transfection. באחד גם צלחת 96 היטב, לערבב פתרון הופעל 100 μl Amaxa Nucleofector מוכן בשלב 1 עם 5 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד עניין קידוד חלבון מתויג fluorescently. בצורה אופטימלית, ריכוז ה-DNA צריך להיות גדול מ 1 מיקרוגרם / מ"ל על מנת למנוע דילול פתרון transfection.
- מערבבים היטב על ידי pipetting העדין.
- לאחר צנטריפוגה של התאים, להסיר את כל supernatant בזהירות ואילו לא דisturbing גלולה.
- פיפטה פתרון ה-DNA / transfection פעמיים.
- הוסף את ה-DNA / transfection פתרון לגלולה.
- להעביר את תאי קובט Amaxa.
- הכנס את קובט לתוך מכשיר Nucleofector Amaxa.
- השתמש בהגדרת H-10 Amaxa transfection עבור electroporation (לJurkat) או T-23 (לתאי T עיקריים).
- הסר את הצלחת 6 היטב מן החממה.
- בעקבות electroporation, להעביר בזהירות את supernatant עם ההשעיה התא לצלחת 6 היטב בעזרת פיפטה פסטר. גלולה בהיקף של תא פסולת עלולה להיוצר. הימנע מהעברת גלולה.
- דגירה התאים למשך 24 שעות ב 37 ° C.
- העבר 2.5 מ"ל של השעיה תא מכל טוב לבאר חדשה. הוסף 2.5 מיליליטר מדיום תרבות חם (מתואר בשלב 2) זה טוב.
- לאחר 72 שעות, להעביר את תאי צינור צנטריפוגות סטרילי ל7 דקות ב 400 × גרם בטמפרטורת חדר. בטל supernatant ולהחליף אותו wiמדיום תרבות ה בתוספת האנטיביוטיקה בחירת התא היונקים המתאימה לפלסמיד משמש (להחיל ריכוז מתאים לאנטיביוטיקה בשימוש; השתמשנו G418 ו / או hygromycin בריכוזים של 1.3 מ"ג / מ"ל ו / או 0.2 מ"ג / מ"ל, בהתאמה). תרבות ההשעיה תא היטב טרי. לחלופין, ניתן transfected תאי transiently וצלמו 48 שעות לאחר transfection. כדי להכין את תאי transfected transiently, שיתוף transfect התאים עם שני פלסמידים בו זמנית בשלב 8, ממשיך בדרך כלל לשלב 20, ולאחר מכן דלג ישירות לשלב 23. שימו לב שתחת תרחיש זה, יש להשתמש בתאים באופן מיידי, ובאופן כללי עוצמת הקרינה שלהם היא הטרוגנית ולא בהכרח גבוהה.
- לגדל תאים עם מדיום התרבות בתוספת האנטיביוטיקה הבחירה המתאימה. לפצל את התאים ולהשלים אותם עם מדיום תרבות לאנטיביוטיקה בתוספת במידת צורך.
- לאחר 2 שבועות, ודא transfection המוצלחת עם השימוש בFACS (שפעתמיון תא orescence המופעל) כדלקמן:
- אסוף 10 6 תאי transfected, 10 6 תאים transfected מדומים (ביקורת שלילית), ו10 6 תאים שידועים כי הם מבטאים את החלבון מתויג fluorescently ביציבות. אם תאי transfected עם חלבון פלואורסצנטי יותר מפעם אחת (ראה שלב 27), השתמש בשורות תאים מרובות, מתויגים ביחידים כפקדים חיוביים.
- צנטריפוגה תאים ל7 דקות ב 400 × גרם בטמפרטורת חדר.
- בטל supernatant. תאי Resuspend ב 500 חיץ FACS μl (PBS w / o + ו +, FCS, אזיד הנתרן 0.05% 5% Mg 2 Ca 2).
- השתמש בFACS אנליטיים כדי לוודא הקרינה סלולרית. שקלו את הקרינה של תאי transfected לזה של בקרות השליליות וחיוביות.
- לtransfect התאים עם AN, מתויג fluorescently חלבון, חזור על צעדים נוספים 3-26 תוך שימוש בתאי transfected.
- תאי רמות גבוהות של הקרינה מוצגות צריכים להיות בשימוש. בצורה אופטימלית, לפחות 50% מהתאים בתרבות צריכים להיות ניאון מאוד. הקרינה סלולרי עלולה להיות מוגברת על ידי מיון תאים באמצעות FACS.
כל חלבונים מתויגים נוספים יש התמזגו fluorophores שונה ולהיות מקודדים בפלסמידים קידוד לאנטיביוטיקת בחירה אחרת. בחירת מדיום לתאי transfected עם יותר מאחד פלסמיד יש להשלים עם כל האנטיביוטיקה המתאימה.
2. הכנת Assay הפצת תא T
- השתמש במעבדת-Tek מערכת השנייה הגרמני coverglass 4 שקופיות קאמריות. הקפד לא לגרד את פני השטח הפנימיים של התאים, למשל עם קצה פיפטה, בטעות במהלך הכנה או שימוש.
- הכן את פתרון הכנת שקופית 50 מ"ל: קח 4.6 מ"ל של M HCl 12 (37%), תוסיף 38.5% אתנול 100 מ"ל, ו6.9 מיליליטר מים מזוקקים שבעתיים.
- ממלא כל תא של השקופית עם 500 פתרון הכנת שקופית μl.
- דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
- לשאוב קאמריים, ייבושם לחלוטין.
- דגירה השקופיות שנחשפו לשעה 1 ב 45 ° C עד יבש באופן מלא.
- הכן 0.01% פתרון פולי-L-ליזין על ידי דילול 0.1% פולי-L-ליזין (סיגמא אולדריץ ') במים מזוקקים פעמיים.
- החל μl 500 לכל תא.
- דגירה השקופיות במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשאוב התאים, ייבושם לחלוטין.
- דגירה במשך 3 שעות על 45 מעלות צלזיוס עד יבש באופן מלא.
- ניתן לאחסן שקופיות מצופים יבשים במשך כמה חודשים בטמפרטורת חדר.
- הכן את פתרון נוגדן הפעלה. השתמש בנוגדן אנטי CD3: או HIT3a (BD Pharmingen, # 555,337) או UCHT1 (BD Pharmingen, 555,330 #), 10 מיקרוגרם / מ"ל ב400 PBS μl, לכל תא. פתרון זה צריך להיות מוכן זמן קצר לפני הכנת שקופית.
- ממלא כל תא עם 400 μl של פתרון נוגדן ההפעלה.
- דגירה השקופיות במשך שעה 2 על 37 מעלות צלזיוס או, עדיף, הלילה בשעה 4 ° C.
- הסר את הפעלת נוגדני סולution ולשטוף באופן מיידי את החדר פעמיים עם 300 PBS μl. מנקודה זו, ודא התאים נשארים מלאים במאגר.
- אחסן את השקופיות מילא-PBS ב 4 ° C. אנו ממליצים להשתמש בתאי השקופיות המוכנים בתוך שבוע 1.
3. הפעלת תא T והדמיה
- הכן את חיץ הדמיה [1.25 HEPES מ"ל (ז 1), 10 מ"ל FCS, 38.75 מ"ל RPMI ללא פנול אדום]. ניתן לאחסן חיץ הדמיה על 4 מעלות צלזיוס לאחר הסינון.
- הפעל את המיקרוסקופ Meta LSM Zeiss 510. לחמם את מסגרת מיקרוסקופ heatable ההרכבה עד 37 ° C. בחר באפשרות "מצב מומחה".
- לחץ על הכרטיסייה "לרכוש" ולפתוח את הלשוניות הבאות: לייזרים; מיקרוסקופית; התצורה; הסריקה; סדרות עתיות.
- הפעל את הלייזרים הדרושים. לעירור של mCFP וmYFP, להגדיר את ארגון / 2 לייזר כדי "המתנה" במשך 5 דקות, ולאחר מכן ל" על ".
- אם ביצע assay לחיות תאי הדמיה זה בעבר, תוך שימוש באותן fluorophores, פתח את קובץ LSM התקבל, לחץ על "שימוש חוזר" אניקון, ולהמשיך משלב 9. אחרת תמשיך משלב 6.
- הגדרת ערוצים בשימוש במסננים מתאימים לעירור והפליטה של חלבוני הניאון בשימוש.
- בחלון "סריקת השליטה", בחר באפשרות ערימת Z.
- הזן את הפרמטרים הבאים: סריקת מספר פרוסות: 5; מרווח: 0.5 מיקרומטר; הפרוסה נוכחית: 3.
- הכן את אמבט Accublock דיגיטלי יבש (Labnet) על 37 מעלות צלזיוס בסמוך למיקרוסקופ.
- לחמם את חיץ ההדמיה עד 37 ° C.
- הכן את השקופית מאוחסנת על ידי aspirating PBS, והחלפתו 600 μl של חיץ הדמיה חם.
- דגירה השקופיות ב 37 ° C. שמור את השקופית בחממה עד שלב 13, במשך לפחות 15 דקות.
- לאסוף 5 × 10 5 תאי T transfected.
- צנטריפוגה תאים למשך 2 דקות ב 400 × גרם.
- בטל supernatant.
- תאי Resuspend בחיץ הדמיה חם 1 מ"ל, ולהעביר אותם לצינור Eppendorf 1.5 מ"ל.
- הנח את tצינור EST על אמבט יבש הדיגיטלי Accublock.
- קח את השקופית חימם מהחממה, ולעגן אותה במסגרת ההרכבה מיקרוסקופ התחמם.
- לחץ על הסמל "VIS".
- מערבבים את ההשעיה התא ולהסיר 1-2 μl.
- הכנס את הקצה של פיפטה לתוך מאגר ההדמיה מעל החלק התחתון של השקופית. להימנע מגרד את השקופית.
- תאי זרע על פני הצמצם של המטרה.
- מייד מתחיל מעקב חזותי תאי הניאון שהם יורדים. בחר תא שמציג הקרינה גבוהה בשני הערוצים.
- לפני התא מגיע לפני השטח של השקופית, להפעיל את מצב LSM.
- להחליף רק אחד לייזר עירור. בחר לייזר שיש לכם ערוץ דסק"ש.
- הגדר זום ל1. לחץ על הסמל "המהיר XY". לחץ על הסמל "עצור". באמצעות כלי החיתוך, בחר את ההחזר על ההשקעה מרוכזת על התא.
- הגדר זום ל3. לחץ על הסמל "המהיר XY", ואז להגדיר באופן ידני את הפוקוס כדי להציג את התא בצורה אופטימלית. לחץ על "עצור" ICOn.
- לעבור את כל לייזרי העירור הדרושים.
- להתחיל את ההקלטה על ידי לחיצה על הסמל "StartT". תמונת התא למכלול תהליך הפצה (בדרך כלל 5 דקות). כשתסיים, לחץ על הסמל "עצור".
- שמור את הקובץ.
- לרכוש תאים נוספים, לחץ על הסמל "VIS". אם יש תאים שעדיין לא באים במגע עם החלק התחתון של השקופית, להמשיך משלב 23. הימנע מתאי הדמיה שכבר החלו בתהליך הפצה. אחרת המשך לשלב 32.
- אם אזור השקופית שנצפה הוא בעיקר נטול תאים, להוסיף aliquot אחרת של תאים (להמשיך משלב 20). אחרת המשך לשלב 33.
- לרכוש תאים נוספים, להעביר את השקף כך שהאזור שמעל הפתח של המטרה הוא נטול תאים.
- הוסף aliquot אחרת של תאים (ולהמשיך משלב 20).
- לאחר ביצוע כל ההדמיה הרצויה, לפתוח קובץ LSM הציל.
- לחץ על "גלריה", "זמן + Z" ו "תת".
- בחר relevanלא טווח זמן וערימת Z.
- שמור את הקובץ החדש.
- בצע את השלבים 35-38 לכל קבצי ההדמיה.
4. ניתוח נתוני הדמיה
- לפתוח את הקבצים באמצעות תוכנת LSM Imaris (Bitplane AG, ציריך שוויץ).
- לחץ על "לעלות". לחץ על תפריט "עיבוד התמונה", ובחר "החלף זמן ו-Z". זה יסייע בחיתוך הנכון של התמונה.
- לחץ בסרגל הכלים "ערוך" ובחר באפשרות "חתוך 3D" בתפריט הנפתח. לחתוך את התמונה לכלול רק את האזור שמסביב לתא. אנו מציעים חיתוך מרובע 300 × 300 פיקסל מרוכז על התא. שימו לב שצורתו ומיקומו של התא יכולים להשתנות עם הזמן. התבוננות ציר T, לוודא כי התא הוא בתוך האזור הקצוץ בכל הנקודות הזמן.
- לחץ על תפריט "עיבוד התמונה", ובחר "החלף זמן וZ" כדי לשחזר את ההפרדה הזמנית המקורית של התמונה.
- לחץ על הכפתור "Coloc" בסרגל הכלים הראשי. בחר "בנה זמן Deעמ '. Coloc ". Imaris ייחשב באופן אוטומטי ספי עוצמה עבור כל ערוץ בכל נקודת זמן.
- להציג את תוצאות ניתוח colocalization על ידי בחירה "סטטיסטיקת ערוץ". לייצא את הנתונים על ידי לחיצה על "יצוא".
- חזור על שלבי 1 עד 6 עבור כל תא הדמיה. אנו ממליצים כי לפחות 50 תאים להיות מנותחים בצורה זו.
- לחשב את מקדם colocalization של פירסון הממוצע והשגיאה או סטיית התקן שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מציגים דוגמה של הדמיה T-תא חי וניתוח. לפני ניסוי ההדמיה, SLP76 תאי T לקויים (J14) נותחו עם השימוש בFACS על מנת לקבוע את הביטוי של חלבוני הניאון (איור 1). תאי T transfected עם איתות חלבונים המתויגים mCFP-NCK וSLP76-mYFP הופקדו על שקופיות הפעלה וצלמו במהלך T-תא הפצה (איור 2). תמונות שנאספו מראות את הדינמיקה של לוקליזציה חלבון לאורך כל הפעלה ומתפשט (איור 3). עיבוד תמונה ממוחשב מספק תובנות חדשות ומידע הכמותי מהתאים דמיינו, תוך מזעור נטייה אנושית. כדי לבחון את colocalization של שני החלבונים לאורך תהליך ההפעלה הסלולרי, השתמש בכלי colocalization של תוכנת Imaris (Bitplane AG, ציריך שוויץ). על ידי השוואת מקדמי colocalization בין נקודות זמן שונות על פני תאים צלמו, היינו תוכל לוודא שcolocalization של NCK וSLP76 אינו משתנה באופן משמעותי לאורך הפעלת תא T (P> 0.3) (איור 4).
איור 1. ניתוח FACS של תאי transfected כפול עם חלבוני fluorescently שכותרתו הנתונים מוצגים כהיסטוגרמות עוצמת הקרינה ל() mCFP;. (ב ') mYFP, וכן (ג) כעלילת נקודה. עוצמת הקרינה של J14 תאי transfected עם mCFP-NCK וSLP76-mYFP מיוצגות בציאן וצהוב, בהתאמה. J14 תאי בקרה שלילי untransfected מסומנים על ידי קווים שחורים.
/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
איור 2. ייצוג סכמטי של החיה תא T מתפשט assay (א) הכנת שקופיות הפעלת תא T;. (ב ') לחיות תא T-assay הפצה וניתוח;. (ג) התקנת מיקרוסקופיה לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. הפצה של NCK וSLP76 במהלך תהליך תא T ההפעלה. תאים להביע mCFP-NCK וSLP76-mYFP בוטלו על coverslips נוגדנים מראש מצופי גירוי אנטי CD3 וצלמו כל הזמן, לתקופה של 7 דקות. mCFP-NCK מיוצג על ידי ציאן, בעוד SLP76-mYFP מוצגת בצהוב.
לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 4. ניתוח כמותי של colocalization החלבון. עיבוד תמונה של תאים בוצע באמצעות תוכנת Imaris (Bitplane AG, ציריך שוויץ). Colocalization מחושב כמקדם המתאם של פירסון בין העוצמות של ערוץ mCFP וערוץ mYFP עבור כל פיקסל. מקדמי colocalization של פירסון מחושבים מנקודות זמן שונות מושווים. שלושים שניות לתהליך ההפעלה, מקדם colocalization של mCFP-NCK וSLP76-mYFP היה גדל באופן משמעותי (p <0.05). תוצאות אלו חושבו על ידי ניתוח> 50 תאים עצמאיים. ממוצע ± סטיית התקן מוצג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הרגולציה והפונקציה של תהליכים תאיים רבים תלויה בהיווצרות וסיום האינטראקציות בין חלבונים. הדמיה מיקרוסקופית מאפשרת מעקב בזמן אמת של חלבונים מתויגים fluorescently בתאים חיים. Colocalization של חלבונים מתויגים יכול להציע אינטראקציה ישירה או עקיפה בין החלבונים, וניתן להשתמש בו כדי לחזק את הממצאים שהושגו על ידי שיטות ביוכימיות, כגון immunoprecipitation. שלא כמו שיטות ביוכימיות, הדמיה לחיות תאים מאפשרת אינטראקציות בין החלבונים אלה כדי להיות שנצפו במרחב ובזמן, שתאפשרנה את הניטור של תהליכים פיסיולוגיים כפי שהם מתרחשים וזיהוי של החלוקה התאית של חלבונים. כלים שונים לניתוח כמותי של colocalization פותחו; מקדם המתאם של פירסון נותר שיטה מאוד אטרקטיבית וזמינה לציבור רחב לכימות של מידת colocalization בין שני חלבונים 12. אמנם דואר תהודה הקרינהnergy העברה (סריג) ניסויים יאפשר זיהוי של אינטראקציות בין חלבונים המתאפיינים בסמיכות (10 ננומטר), שיטה זו דורשת הגדרות מיוחדות (ציוד ותאימות של taggings ניאון בשימוש) ועיבוד נתונים מורכב. עבור רוב השימושים, ניתוח colocalization, בנטייה בשיטות ביוכימיות, מהווה קל לשימוש, ושיטה פשוטה להתבוננות אינטראקציות בין חלבונים לאורך זמן.
הקמת סף הקרינה בעוצמה לפיקסלים ניתח, תוך התעלמות פיקסלים מתחת לסף העצמה לשני הערוצים, היא בעלת חשיבות מכרעת לניתוח colocalization מדויק ורגיש. האלגוריתם משמש בדרך כלל לקביעה האובייקטיבית והאוטומטית של ספים אלה פותח על ידי קוסט et al. -13 ומיושם על ידי תוכניות לעיבוד תמונה כגון Imaris וVolocity.
הנה, אנחנו מדגימים את השימוש במתאר לעצמי T-התא החישיטת ing לניתוח הדינמיקה של SLP76, פיגום מרכזי בתאי T, וNCK, חלבון מתאם, אשר שניהם חיוניים לתאי T הפעלת 14,15. תמונות של תאי T שנאספו במהלך ההפעלה מראות כי שני החלבונים colocalized לאורך תהליך ההפעלה הסלולרי (איור 3). זה אומת על ידי ביצוע בדיקת כמותית colocalization של פירסון על תמונות שנאספו לאורך תהליך ההפעלה. טווח מקדמי colocalization של פירסון מ -1 עד 1, שבו ציון של -1 הפירוש אנטי מתאם, ציון של 1 מסמל colocalization המושלם ו0 אומר שאין מתאם בין שני אפיקי התמונה. השוואה בין מקדמי colocalization של פירסון שחושבו לנקודות זמן שונות ולתאים שונים מציינת כי colocalization של NCK וSLP76 אינו משתנה באופן משמעותי במהלך הפעלה סלולרית, אך נשארה קבוע (p> 0.3, איור 4). תוך שיתוף colocalization הכללייעיל של החלבונים האלה אינו משתנה לאורך תהליך ההפעלה, זה לא לשלול את האפשרות של תהליך דינמי של התאחדות וניתוק המתרחש בין החלבונים אלה 18.
הפרוטוקול שהצגנו יכול גם להיות מותאם לשורות תאי hematopoietic אחרות על ידי התאמת תנאי תא צמיחה כנדרש, בחירה בהגדרת transfection מתאימה לשורת התאים בשאלה, ולשנות את תהליך ההפעלה הסלולרי, אם ישים. אנא שים לב כי בעת שנהגנו מיקרוסקופ Meta confocal 510 LSM, בהתאמות והשימוש בהגדרות המתאימות, מערכות מיקרוסקופיה confocal אחרות יכולות לשמש בהצלחה גם כן.
השימוש בהדמית T-תא חי מאפשרת את תהליכי הרגולציה והפעלה כדי להיות במעקב באופן ישיר, מה שמאפשר אירועי איתות כדי להיחקר עם רזולוציה של זמן ומרחב זמין תוך שימוש בשיטות ביוכימיות ומולקולרית. אנו מציגים ספיד ישירOD לביצוע assay חי מתפשט תא T, מעקב אחר חלבונים רלוונטיים בזמן אמת וניתוח נתונים כמותיים כדי להניב תוצאות. נתוני מיקרוסקופיה תוצאה יכולים לשמש גם עבור יישומים במורד הזרם אחרים, כגון ניתוח מדד תא 16 וצורה סריג ניתוח 17,18, בהתאם להגדרת הניסוי הספציפית ומטרות מחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים סופיה פריד לקבלת סיוע טכני. MBS הסוכנויות מודה הבאות על תמיכת המחקר שלהם: הקרן הלאומית למדע למענקי no.1659/08, 971/08, 1503-1508 ו491 / 10, משרדי בריאות ומדע למענקים אין. 3-4114 ו3-6540, סרטן אגודת ישראל באמצעות עזבון אלכסנדר Smidoda מאוחר, וקרן משפחת Taubenblatt למענק ההצטיינות ביו הרפואה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R87589 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame - Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 | |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
