Summary
وتم وضع بروتوكول نضوب RNA الريباسي (الرنا الريباسي) لتخصيب رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) لRNA-يليها من metatranscriptome الأمعاء البعوض. تم إنشاء نموذج الرنا الريباسي تحقيقات محددة، والتي كانت تستخدم لإزالة الرنا الريباسي عبر الطرح، من البعوض والميكروبات الوتر. يمكن أداء بروتوكول يؤدي إلى إزالة ما يقرب من 90-99٪ من الرنا الريباسي.
Abstract
القناة الهضمية البعوض يستوعب المجتمعات الميكروبية الحيوية عبر مراحل مختلفة من دورة حياة الحشرة. وتوصيف الوظائف والقدرات الوراثية للمجتمع الأمعاء توفير نظرة ثاقبة على آثار مجهريات البقعة الأمعاء على الصفات الحياة البعوض. Metagenomic أصبح RNA-تسلسل أداة مهمة لتحليل transcriptomes من الميكروبات المختلفة موجودة في المجتمع الميكروبي. RNA الرسول يتألف عادة٪ فقط 1-3 من الحمض النووي الريبي مجموع، بينما الرنا الريباسي يشكل حوالي 90٪. أنه يمثل تحديا لتخصيب رسول RNA من عينة الحمض النووي الريبي metagenomic الميكروبية لأن معظم الأنواع مرنا بروكاريوتيك تفتقر مستقرة بولي (A) ذيول. هذا يمنع بنسبة ضئيلة د مرنا بوساطة (T) العزلة. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يستخدم عينة مشتقة الرنا الريباسي التقاط تحقيقات لإزالة الرنا الريباسي من عينة الحمض النووي الريبي مجموع metagenomic. لتبدأ، وتتضخم كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي الوحيدات شظايا صغيرة وكبيرة من عينة DNA metagenomic المجتمع. ثم، وcommuوقد تم تجميع بيئتهم الخاصة العقاقير المعقدة البيروكسيديز الريباسي تحقيقات RNA T7 في المختبر باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز. والمهجنة للتحقيقات المعقدة البيروكسيديز الرنا الريباسي الحمض النووي الريبي مجموع ل. يتم التقاط الهجينة من streptavidin المغلفة الخرز وإزالتها من الحمض النووي الريبي مجموع. هذا البروتوكول على أساس الطرح يزيل بكفاءة كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي من العينة RNA الكلي. تتم معالجة مزيد من العينة المخصب مرنا لتضخيم الحمض النووي الريبي RNA وتسلسل.
Introduction
وقد تقدمت الجيل المقبل من تكنولوجيا التسلسل إلى حد كبير من خلال السماح metagenomics دراسة لتقييم التكوين التصنيفي وظائف الجيني للتجمع الجراثيم. يمكن RNA في رسم التسلسل (RNA-تسلسل) 1 تجاوز الثقافة القائمة على أساليب التحقيق metatranscriptomes الميكروبية في 2-5 سياقات مختلفة. عقبة رئيسية أمام الميكروبية RNA-يليها هو صعوبة في إثراء مرنا، لأنها لا الأنواع مرنا بروكاريوتيك مذيل بعديد الأدينيلات ثابت. ولذلك، بنسبة ضئيلة د رسول بوساطة (T) لا ينطبق تخصيب. إزالة الرنا الريباسي وفيرة، وهو نهج بديل لتخصيب مرنا. وقد استخدمت التجارية مجموعات استنفاد الرنا الريباسي، مثل Microexpress الجرثومي مرنا عدة التخصيب (Ambion)، RiboMinus Transcriptome كيت عزل (بكتيريا) (لايف تكنولوجيز)، ومرنا-ONLY عزل مرنا بروكاريوتيك مجموعة (EPICENTRE) التي تحط تفضيلي الرنا الريباسي مع نوكلياز خارجية، لإزالة الرنا الريباسي 6-8. ومع ذلك، فإن تحقيقات في التقاط Microexpressأو RiboMinus جيدة لإزالة الرنا الريباسي المعروفة من نموذجي الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام (انظر مواصفات الصانعين)، ولكن أقل متوافقة مع الرنا الريباسي من الميكروبات غير معروف. ونتيجة لذلك، قد تكون إزالة أقل كفاءة لمدة 8-10 عينات metagenomic. الى جانب ذلك، كان الإخلاص وفرة مرنا مشكوك عندما تم تطبيق العلاج نوكلياز خارجية 11. وعموما، كان الطرح القائم على استنزاف الرنا الريباسي أقل انحيازا وأكثر فعالية في تخصيب مرنا في إعدادات metagenomic 10-13.
القناة الهضمية البعوض تستوعب المجتمع الميكروبية الحيوية 14. ونحن مهتمون في وصف وظيفة القناة الهضمية microbiome البعوض باستخدام RNA-SEQ. في عينة الحمض النووي الريبي معزولة عن الشجاعة البعوض، سواء RNA البعوض والجراثيم موجودة. هنا، نحن تصف بروتوكول تعديل لاستخدام الرنا الريباسي المجتمع تحقيقات محددة في استنزاف بكفاءة الرنا الريباسي البعوض والجراثيم عن طريق التهجين مطروح. ومرنا الناتجةعينات المخصب المناسبة لRNA-SEQ. ويصور سير العمل الكلي في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إجراء
1. البعوض تربية
- الخلفية البعوض الأنوفيلة الغامبية سلالة G3 في insectary 27.5 ° C في ذات الرطوبة 80٪ و12:12 دورة ساعة من الضوء / الظلام.
- تتغذى اليرقات مع القط الغذاء الأرضي مع الخميرة في نسبة 1:1.
- تغذية البعوض البالغ على دم الفئران لمدة 3 أيام في آخر ظهور لإنتاج البيض.
2. البعوض الوتر تشريح
- أدوات تشريح الأوتوكلاف (الشرائح وملقط).
- جمع 50 البعوض باستخدام الشافطة ووضعها على السرير CO تدفق 2 (في نهاية المطاف Flypad). شطف عينة البعوض بشكل تسلسلي في أطباق بتري تحتوي على 3 الإيثانول 70٪ لتنظيف سطح الجسم البعوض.
- وضع العينة على شريحة زجاجية تحت stereomicroscopy. إزالة الأمعاء.
- جمع 50 الشجاعة في حالة لعزل الحمض النووي metagenomic. جمع 50 الشجاعة في حالة عزلة عن RNA metagenomic. 3. Metagenomic DNA عزل
- وضع 50 في 300 الشجاعة البعوض TE ميكرولتر. التجانس لهم لمدة 1 دقيقة باستخدام بيو جنرال PRO200 الخالط (PRO العلمي المؤتمر الوطني العراقي، الولايات المتحدة الأمريكية) في 2،000 دورة في الدقيقة السرعة على الجليد.
- إضافة 2 ميكرولتر من محلول الليزوزيم جاهزة وليز و 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز A إلى تعليق الخلية. مزيج من vortexing واحتضان في C ° 37 لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 300 ميكرولتر من التلوي يزيس محلول (2X) و 1 ميكرولتر من K بروتين إلى الأنبوب. مزيج من vortexing. لفترة وجيزة نبض أجهزة الطرد المركزي في أنبوب للتأكد من أن جميع من الحل هو في الجزء السفلي من الأنبوب، واحتضان في 65 ل° C 15 دقيقة، باردة لدرجة حرارة الغرفة، ثم مكان على الجليد لمدة 3-5 دقيقة.
- إضافة 350 ميكرولتر من البروتين MPC الكاشف الأمطار إلى أنبوب ومزيج من vortexing بقوة لمدة 10 ثانية.
- بيليه رانه الحطام بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 XG في 4 درجات مئوية.
- نقل طاف لأنبوب مل 2-نظيفة، وتجاهل بيليه.
- إضافة 570 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لطاف. مزيج من الأنبوب مرات عدة قلب.
- بيليه الحمض النووي بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 XG في 4 درجات مئوية. إزالة الأيزوبروبانول دون طرد بيليه DNA.
- إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 75٪ لغسل بيليه. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12000 XG في C. ° 4 إزالة الإيثانول من دون إزعاج بيليه DNA. الهواء تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: لا الإفراط في تجفيف بيليه DNA.
- إعادة تعليق بيليه DNA في 50 ميكرولتر من العازلة TE.
- تحقق من صحة حجم DNA المعزولة من خلال المقارنة مع الحمض النووي تحكم Fosmid (40 KB و 100 نانوغرام / ميكرولتر) الواردة في هذه المجموعة، عن طريق الكهربائي للهلام هلام الاغاروز على 1٪.
- وضع 50 الشجاعة البعوض في أنبوب مل 2-مع 500 ميكرولتر TriPure الكاشف عزل. التجانس لمدة 1 دقيقة في 2،000 دورة في الدقيقة السرعة على الجليد باستخدام الخالط. اسمحوا الجلوس في RT لمدة 5 دقائق للسماح للتفكك المجمعات البروتين النووي.
- إضافة 100 ميكرولتر الكلوروفورم ودوامة لمدة 12 ثانية، وترك الجلوس في RT لمدة 2 دقيقة.
- الطرد المركزي في 10000 XG لمدة 10 دقيقة. تأخذ بعناية الأنبوب من دون إزعاج مراحل فصل.
- نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد، إضافة 250 ميكرولتر الأيزوبروبانول، تخلط جيدا، ووضع في -20 ° C لمدة 20 دقيقة.
- الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لRNA راسب.
- تجاهل طاف دون طرد بيليه. غسل بيليه مع الايثانول 75٪ 750 ميكرولتر.
- ماصة قبالة طاف دون الإخلال بيليه. Aالأشعة تحت الحمراء أنبوب تجفيف لمدة 2 دقيقة.
- إعادة تعليق على RNA مع 30 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز.
- علاج مع الحمض النووي الريبي مجموع الدناز في C ° 37 لمدة 20 دقيقة، ثم تعطيل والدناز من احتضان عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. RNA راسب مع الإيثانول وRNA resuspend في 30 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز.
- تحديد كمية الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام NanoDrop.
- PCR التضخيم من الجينات الريباسي شظايا الحمض النووي الريبي
هذه الخطوة بإنشاء حمامات عينة محددة الرنا الريباسي، التي سيتم استخدامها كقوالب لفي النسخ المختبر لإنتاج مضاد للاحساس الريباسي الحمض النووي الريبي (arRNA) تحقيقات التي هي مجانية لالرنا الريباسي في العينة RNA الكلي.- تصميم وتركيب مجموعات التمهيدي لالرنا الريباسي جزء PCR (الجدول 1).
- تشغيل PCR في 50ميكرولتر رد فعل البلمرة DNA باستخدام طق (QIAGEN) مع 50 نانوغرام قالب DNA، 1 × PCR العازلة، المغنيسيوم 1.5mM 2 الكلورين، 0.2 ميكرومتر الاشعال مع 35 دورات يبدل طبيعة في 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 15 ثانية الصلب عند 40 درجة مئوية لمدة AMPLICON 23S البكتيرية، و 50 ° C للamplicons أخرى، وتمتد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق).
- عرض المنتجات PCR على 1٪ الاغاروز هلام.
- تنقية المنتجات PCR PCR باستخدام تنقية QIAquick عدة مع شطف العازلة في 50 ميكرولتر شطف. قياس تركيز باستخدام NanoDrop.
- في النسخ المختبر من البيوتين التي تحمل علامات تحقيقات الرنا الريباسي المضادة للإحساس (arRNA). ملاحظة: في هذه الخطوة، وقد تم تجميع عينة محددة من تحقيقات amplicons الرنا الريباسي مختلف باستخدام T7 MEGAscript عدة.
- إعداد رد فعل 20 ميكرولتر لكل عينة محددة الرنا الريباسي AMPLICON عن طريق خلط المكونات أدناه (الجدول 2). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 ميكرولتر الدناز I (المدرجة في المجموعة) إلى رد فعل واحتضان في C ° 37 لمدة 20 دقيقة لإزالة قالب DNA.
- إضافة 100 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100٪ إلى رد فعل، الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ليعجل توليفها arRNA. تجاهل طاف وغسل بيليه مع الايثانول 75٪ 750 ميكرولتر. إعادة تعليق تحقيقات RNA في 50 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز.
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام NanoDrop. تحقيقات المحل في -80 درجة مئوية.
- إعداد رد فعل 20 ميكرولتر لكل عينة محددة الرنا الريباسي AMPLICON عن طريق خلط المكونات أدناه (الجدول 2). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- الرنا الريباسي الطرح مع arRNA المعقدة البيروكسيديز. ملاحظة: هذه الخطوة توظف arRNA المعقدة البيروكسيديز لهجن لالرنا الريباسي في العينة RNA الكلي. يتم التقاط الهجينة الرنا الريباسي-arRNA من streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي. ويستند هذا الإجراء على بروتوكول الموصوفة في المرجع 13 مع تعديلات طفيفة.
- الكواشف
- إعداد 0،1 N هيدروكسيد الصوديوم، الصوديوم الكلور 20XIDE-سترات (SSC) و 1 X SSC مع الفورماميد 20٪.
- تهجين
- مزيج RNA ميكروغرام 1 المجموع مع 16S 23S البكتيرية وتحقيقات (0.75 ميكروغرام لكل منهما)، 18S 28S البعوض وتحقيقات (0.75 ميكروغرام لكل منهما)، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، 2.5 ميكرولتر 20X العازلة SSC، 10 ميكرولتر الفورماميد 100٪ في أنبوب PCR ميكرولتر 200 ، إضافة نوكلياز خالية المياه إلى 50 ميكرولتر.
- وضع أنبوب التفاعل في cycler الحرارية واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفتح هيكل الثانوي والطريق المنحدر إلى أسفل إلى 25 ° C باستخدام 5 ° C الزيادات لمدة 1 دقيقة لكل ° C للسماح للتهجين من تحقيقات والرنا الريباسي arRNA.
- إزالة الرنا الريباسي
- نقل 300 ميكرولتر الخرز المغلفة streptavidin في أنبوب مل 1.7. وضع أنبوب على رف الفصل المغناطيسي لشل الخرز. إزالة طاف. إعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم و0.1N ميلX أيضا. وضع أنبوب عودة إلى رف المغناطيسي وماصة قبالة طاف. إعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من 1X SSC، تخلط جيدا، والخرز شل ماصة قبالة طاف. تكرار غسل مع 300 ميكرولتر من 1X وقت واحد أكثر SSC.
- تقديم 3 مأخوذة من الخرز، 100 ميكرولتر لكل منهما، في أنابيب مل 1.7. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي، وإزالة طاف بواسطة pipetting. ملاحظة: يتم استخدام مأخوذة من الخرز لمدة 3 جولات من التقاط المعقدة البيروكسيديز الرنا الريباسي-arRNA الهجينة.
- إضافة 50 ميكرولتر 1X SSC مع الفورماميد 20٪ في رد فعل 50 ميكرولتر التهجين. نقل رد الفعل في أنبوب قسامة حبة الأول، وتخلط جيدا. احتضان RT في لمدة 10 دقيقة للسماح استولت على التحقيق المعقدة البيروكسيديز-الرنا الريباسي الهجينة من الخرز streptavidin. نفض الغبار الأنبوب كل دقيقة 2 إلى مزيج أثناء الحضانة.
- وضع أنبوب على الرف المغناطيسي لشل الخرز، ونقل إلى طاف عليق 2عشق من الخرز، تخلط جيدا واحتضان على النحو الوارد أعلاه. إجراء القبض الثالثة نقل طاف في أنبوب الثالث من الخرز. خلط واحتضان.
- نقل غير الرنا الريباسي طاف في أنبوب جديد وتنقية السلوك باستخدام مجموعة MinElute RNeasy لإزالة الفورماميد بعد دليل الشركة المصنعة.
- التحقق من كفاءة استنفاد الرنا الريباسي باستخدام RNA 6000 اجيلنت بيكو عدة شرائح على Bioanalyzer (الشكل 4).
- الكواشف
ملاحظة: يتم عزل DNA Metagenomic باستخدام ميتا-G-DNA نومي عزل كيت (التكنولوجيات الحيوية EPICENTRE) مع التعديل هو موضح أدناه.
4. مجموع RNA العزلة
ملاحظة: تنظيف منطقة العملمع RNaseZap للحد من التلوث ريبونوكلياز. تم عزل الحمض النووي الريبي Metagenomic من عينات الأمعاء البعوض باستخدام الكاشف عزل TriPure (روش) مع تعديل طفيف.
5. الريباسي RNA استنفاد
ملاحظة: تم وضع بروتوكول يعتمد على الأساليب المذكورة سابقا 12،13،15.
ملاحظة: إن المنضب الرنا الريباسي عينات الحمض النووي الريبي تتعرض لمرنا التضخيم إذا لزم الأمر 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أن البروتوكول تضمن ثلاثة أقسام: (1) إعداد قوالب DNA PCR metagenomic لالرنا الريباسي، (2) إنشاء عينة محددة تحقيقات الرنا الريباسي القبض، (3) استنزاف الرنا الريباسي من الحمض النووي الريبي مجموع بواسطة التهجين مطروح. عزل جودة عالية DNA RNA metagenomic وضروري في العملية برمتها. وتعديل عزل الحمض النووي ميتا-G-نومي بروتوكول غلة عالية الجودة DNA metagenomic من الشجاعة البعوض، كما هو مبين في الشكل 2. يمكن أن يكون تحديا لعزل عالية الجودة الحمض النووي الريبي مجموع من الشجاعة البعوض. هذا هو الأرجح بسبب وجود الإنزيمات المختلفة، بما في ذلك ريبونوكلياز، في الشجاعة البعوض. قارنا استخراج الحمض النووي الريبي مجموع أداء عدة QIAGEN العزلة RNA إلى TriPure روش. وأظهرت مخطط رحلاني التحليل Bioanalyzer اجيلنت أن عزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام TriPure يحتوي على قمم واضحة الرنا الريباسي (الشكل 3)، والذي لا ينظر في RNA الحصول عليها باستخدام عدة QIAGEN. ربما البعوض المشتقة من ريبونوكلياز يتم تعطيل فعاليةد من الفينول في TriPure. عادة، 50 العائد الشجاعة البعوض ~ RNA ميكروغرام 20 المجموع. كمية مثالية من الحمض النووي الريبي مجموع المدخلات للعملية الحالية استنفاد الرنا الريباسي هو ~ 1 ميكروغرام، الذي يحسن من كفاءة وعوائد الطرح الرنا الريباسي ~ 150 نانوغرام تنقية RNA. ويبين الشكل 4 مقارنة electropherograms RNA قبل وبعد الطرح الرنا الريباسي. تمت إزالة بكفاءة الرنا الريباسي بينما أثرى كثيرا من الأنواع غير الرنا الريباسي في RNA المتبقية. وجود RNA الحجم الكبير (> 2000 بي بي) يشير إلى وجود نوعية جيدة من مرنا التخصيب (الشكل 4B). يمكن زيادتها بروتوكول لاستيعاب أكبر مساهمة RNA للمعالجة. وعادة ما يتم المطلوبة 5 ميكروغرام RNA RNA لعملية-يليها. ولذلك، كنا MessageAmp تضخيم II-RNA البكتيريا كيت لتوليد كمية كافية من الرنا الريباسي المنضب RNA RNA-لتسلسل. نوصي باستخدام 150 نانوغرام أو أكثر تنقية RNA لتضخيم الحمض النووي الريبي لضمان الدقة من التضخيم. وكان هذا البروتوكول تطبيق ورقةالعبوات الناسفة لمشروع البعوض RNA-تسلسل القناة الهضمية. وقد تحقق بفعالية استنزاف الرنا الريباسي باستخدام عينة تحقيقات القبض مشتقة. الجدول 3 قوائم نسبة الرنا الريباسي يقرأ في إخراج RNA-تسلسل من أربع عينات. تمت معالجة اثنين من السكر والتي تعتمد على عينتين القناة الهضمية الدم التي تغذيها للنضوب وتسلسل الحمض النووي الريبي. تسلسل البورشيد 23-24M ولدت ليقرأ كل عينة. الطرح الرنا الريباسي إزالة بشكل فعال 90-99٪ من الرنا الريباسي الأنسجة البعوض والميكروبات سواء في عينات الأمعاء. كان استنفاد كامل تقريبا في عينات الأمعاء السكر التي تغذيها، والرنا الريباسي 6،12-10،98٪ بقوا في عينات الدم التي تغذيها (الجدول 3).
| AMPLICON | إلى الأمام 5'-3 ' | عكس 5'-3 ' |
| البكتيرية 16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| البكتيرية 23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| البعوض 18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| البعوض 28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
تم تصميم مجموعات التمهيدي الجدول 1. ل16S الرنا الريباسي التضخيم جزء البكتيرية والاشعال بناء على 20،19 23. تسلسل المروج T7 في جريئة.
| 2 ميكرولتر | |
| PCR المنتجات (0.5-1 ميكروغرام) | ميكرولتر 1.5 |
| ATP (75mm بدرجة) | 2 ميكرولتر |
| GTP (75mm بدرجة) | 2 ميكرولتر |
| CTP (75mm بدرجة) | ميكرولتر 1.5 |
| UTP (75mm بدرجة) | ميكرولتر 1.5 |
| البيوتين-11-CTP (10MM) | 3،75 ميكروليتر |
| البيوتين-16-UTP (10MM) | 3،75 ميكروليتر |
| T7 بوليميريز RNA | 2 ميكرولتر |
الجدول 2. مكونات المختبر في التوليف من تحقيقات الرنا الريباسي.
| عينة | مجموع يقرأ | البعوض الرنا الريباسييقرأ (٪) | 16S الميكروبية يقرأ (٪) | 23S الميكروبية يقرأ (٪) | ٪ من إجمالي الوظائف من قراءة الرنا الريباسي * |
| SM1 | 24341850 | 121،987 (0.50) | 3،717 (0.02) | 6،810 (0.03) | 0.54 |
| SM2 | 23487202 | 114،430 (0.49) | 30،271 (0.13) | 38،261 (0.16) | 0.78 |
| BM1 | 23438304 | 265،433 (1.13) | 2،054،777 (8.77) | 253،051 (1.08) | 10،98 |
| BM2 | 24212240 | 110،240 (0.46) | 1،186،423 (4.90) | 185،074 (0.76) | 6.12 |
الجدول 3. ستاتوالإمداد من الرنا الريباسي يقرأ في RNA-يليها الإخراج. SM: السكر الاحتياطي الفيدرالي القناة الهضمية؛ BM: بنك الاحتياطي الفيدرالي القناة الهضمية الدم. *: مجموع النسب المئوية للالرنا الريباسي البعوض والجراثيم الرنا الريباسي يقرأ.
الشكل 1. الرسم البياني يوضح الخطوات الإجرائية لDNA metagenomic والعزلة RNA، الرنا الريباسي التوليف التحقيق القبض، التهجين، والتقاط حبات استنفاد القائمة.
الشكل 2. تم فصل Metagenomic عزل الحمض النووي. عينات من الحمض النووي على 1٪ الاغاروز هلام. 1، Fosmid DNA (40KB)، 2، البعوض DNA metagenomic الأمعاء.
الشكل 3.مقارنة اثنين من مجموع الكواشف العزلة RNA لكفاءتها في استخراج الحمض النووي الريبي الجودة من القناة الهضمية البعوض. تراكب من electropherograms تبين أن الحمض النووي الريبي مجموع من العزلة TriPure (باللون الأزرق) كان قمم الرنا الريباسي واسعة توزيع RNA، في حين أن من العزلة QIAGEN (باللون الأحمر) لم يكن قمم الرنا الريباسي واضحة.
الشكل 4. كفاءة Electropherograms نضوب. الرنا الريباسي الحمض النووي الريبي مجموع تظهر قبل (A) وبعد استنفاد الرنا الريباسي (B). تمت إزالة بكفاءة القمم الرنا الريباسي. الحمض النووي الريبي أكبر من 4KB في بقايا عينة المنضب الرنا الريباسي. كان تركيز RNA 107،6 نانوغرام / ميكرولتر في (A) و 8.6. نانوغرام / ميكرولتر في (B)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A المجتمع الميكروبية المعقدة تكمن في النظام البيئي الأمعاء البعوض 14،16،17. يمكن Metatranscriptomic التسلسل (RNA-يليها) تكشف عن المعلومات الفنية التي تعتمد السياق استجواب من قبل الجراثيم كامل transcriptome 4،18. من الناحية الفنية، بنسبة ضئيلة من د (T) تخصيب بوساطة من بروكاريوتيك مرنا غير قابل للتطبيق نظرا لعدم وجود بولي مستقرة (A) ذيول للرسل. بدلا من ذلك، تم استخدام الرنا الريباسي استنزاف لتخصيب مرنا. هنا، وضعنا بروتوكولا الطرح القائم على استنزاف الرنا الريباسي باستخدام مجسات الرنا الريباسي مصنوعة من الحمض النووي للmetagenomic الخاصة جدا في المجتمع الأمعاء الميكروبي البعوض. كفاءة إزالة الرنا الريباسي تعتمد على تغطية للتحقيقات القبض الرنا الريباسي التي يتم إنشاؤها من قبل الرنا الريباسي PCR. كفاءة الصلب من التمهيدي مجموعات مختلفة تستهدف المناطق المحمية يتفاوت بين الأصناف المختلفة 19. ولذلك، فإننا نوصي تحاول مجموعات مختلفة من الاشعال على عينات metagenomic، وتجميع ثممنتجات الرنا الريباسي لتحقيق أقصى قدر من التغطية. في إجراءاتنا، ونحن خلق من خلال الجمع بين تحقيقات القبض الرنا الريباسي المنتجات PCR من اثنين الى الامام واثنين من عكس الاشعال، والتي يمكن في النموذج 4 مجموعات من مجموعات التمهيدي (الجدول 1). وبالإضافة إلى ذلك، تعتزم الرنا الريباسي لتشكيل هيكل الثانوي. مقارنة الرنا الريباسي طول كامل كما تحقيقات 13، شظايا أصغر الرنا الريباسي يقل لديهم ميل لتشكيل هيكل الثانوي، والذي قد يسهل من التهجين تحقيقات القبض على الرنا الريباسي العينة. التحقيقات المعقدة البيروكسيديز هجن بكفاءة لالرنا الريباسي في العينة RNA الكلي ويتم إزالة الهجينة من خلال التقاط حبات المغلفة مع streptavidin. الإجراء يزيل معظم الرنا الريباسي (الشكل 4). في عينات الأربعة التي تناقشنا معالجتها، وفي الوقت نفسه تقلصت بشكل فعال 90-99٪ من الرنا الريباسي (الجدول 3). يمكن تعديل هذا الإجراء أخرى لمجموعة متنوعة من الدراسات microbiome الحشرات المرتبطة بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1SC2GM092789-01A1، وكان MS باحث هيوز الطبي NMSU هوارد برامج مؤسسة بحوث الجامعية. كان موجها الفيديو والتي تنتجها لاناسا ايمي وبتنسيق من الدكتور فيليب لويس مع معهد الإعلام الإبداعي في NMSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
