Summary
Een ribosomaal RNA (rRNA) uitputting protocol werd ontwikkeld om messenger RNA (mRNA) voor RNA-seq van de mug darm metatranscriptome verrijken. Voorbeeld specifieke rRNA probes die werden gebruikt om rRNA verwijderen via aftrekcircuit werden gemaakt van de mug en gut microben. Uitvoering van het protocol kan resulteren in de verwijdering van ongeveer 90-99% van rRNA.
Abstract
De mug darm herbergt dynamische microbiële gemeenschappen in de verschillende stadia van het leven van het insect cyclus. Karakterisering van de genetische capaciteit en functionaliteit van de darm gemeenschap zal inzicht geven in de effecten van darmflora op muggen leven kenmerken. Metagenomic RNA-Seq is uitgegroeid tot een belangrijk instrument om transcriptomen analyseren van verschillende microben aanwezig zijn in een microbiële gemeenschap. Messenger RNA omvat gewoonlijk slechts 1-3% van de totale RNA, terwijl rRNA vormt ongeveer 90%. Het is een uitdaging om boodschapper-RNA verrijken van een metagenomic microbiële RNA-monster omdat de meeste prokaryote mRNA-soorten ontbreken stabiel poly (A) staarten. Dit voorkomt oligo d (T) gemedieerde mRNA isolatie. We beschrijven een protocol dat monster afkomstig rRNA invangprobes van rRNA uit een metagenomic totaal RNA monster werken. Om te beginnen, zijn beide mug en microbiële kleine en grote subeenheid rRNA fragmenten geamplificeerd uit een metagenomic gemeenschap DNA-monster. Vervolgens wordt de communicatieschap specifieke gebiotinyleerde antisense ribosomaal RNA probes worden gesynthetiseerd in vitro met T7 RNA polymerase. De gebiotinyleerde rRNA probes worden gehybridiseerd met het totale RNA. De hybriden worden gevangen door streptavidine-gecoate parels en uit het totale RNA. Deze aftrekken gebaseerd protocol verwijdert efficiënt zowel mug en microbiële rRNA van de totale RNA-monster. De mRNA verrijkte monster wordt verder verwerkt voor RNA amplificatie en RNA-Seq.
Introduction
Next-generation sequencing technologie is sterk gevorderd metagenomica studie door het mogelijk maakt om de taxonomische samenstelling en genetische functionaliteit van een microbiële assemblage te beoordelen. RNA-Sequencing (RNA-Seq) 1 kan omzeilen cultuur-gebaseerde methoden om de microbiële metatranscriptomes onderzoeken in verschillende contexten 2-5. Een belangrijk obstakel voor microbiële RNA-seq de moeilijkheid verrijken mRNA, de mRNA prokaryotische species niet stabiel gepolyadenyleerd. Daarom oligo d (T) gemedieerde messenger verrijking niet van toepassing. Het verwijderen van overvloedige rRNA is een alternatieve benadering om mRNA te verrijken. Commercieel rRNA uitputting kits zoals Microexpress Bacterial mRNA Enrichment kit (Ambion) RiboMinus Transcriptome Isolation Kit (Bacteria) (Life Technologies) en mRNA-ONLY Prokaryote mRNA Isolation kit (Epicentre) die bij voorkeur rRNA degradeert met een exonuclease, zijn gebruikt voor het verwijderen rRNA 6-8. De capture probes in Microexpressof RiboMinus zijn goed voor verwijderen van bekende rRNA van typische Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën (zie fabrikant specificatie), maar minder geschikt rRNA van onbekende microben. Bijgevolg kan de verwijdering minder efficiënt voor metagenomic monsters 8-10. Naast de mRNA overvloed fidelity twijfelachtig bij de exonuclease behandeling werd toegepast 11. Overall, aftrekken op basis van rRNA uitputting was minder bevooroordeeld en meer effectief in het mRNA verrijking in metagenomic instellingen 10-13.
De mug darm herbergt een dynamische microbiële gemeenschap 14. We geïnteresseerd in het karakteriseren van de functie van de mug darm microbiome met RNA-Seq. In een RNA-monster geïsoleerd van de mug lef, zowel mug en microbiële RNA aanwezig zijn. Hier beschrijven we een aangepast protocol om de gemeenschap specifieke rRNA sondes gebruiken om muggen en microbiële rRNA efficiënt uitputten door subtractieve hybridisatie. De resulterende mRNAverrijkte monsters geschikt zijn voor RNA-Seq. De algemene werkwijze wordt weergegeven in figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedure
1. Mosquito Opfok
- Achter mug Anopheles gambiae G3 stam in een insectary op 27,5 ° C met 80% luchtvochtigheid en 12:12 uur cyclus van licht / donker.
- Feed larven met gemalen kattenvoer met biergist in een verhouding 1:1.
- Feed volwassen muggen op muizen bloed op dag 3 na opkomst voor de eierproductie.
2. Mosquito Gut Dissection
- Autoclaaf dissectie-instrumenten (dia's en tang).
- Verzamel 50 muggen met behulp van een aspirator en leg ze op de CO 2-stroom bed (Ultimate Flypad). Sequentieel Spoel een mug model in drie petrischalen met 70% ethanol om de mug lichaamsoppervlak schoon te maken.
- Plaats het monster op een glasplaatje onder een stereomicroscopie. Verwijder de darm.
- Verzamel 50 lef per voorwaarde voor metagenomic DNA-isolatie. Verzamel 50 lef per voorwaarde voor metagenomic RNA-isolatie. 3. Metagenomic DNA Isolation
- Plaats 50 mug lef in 300 pi TE. Meng ze 1 min met Bio-Gen PRO200 homogenisator (PRO Scientific Inc, USA) op snelheid 2000 rpm op ijs.
- Voeg 2 pl Ready-Lyse lysozym-oplossing en 1 pl RNase A aan de celsuspensie. Door vortexen gemengd en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg 300 ul van Meta-Lysis Solution (2X) en 1 pl Proteinase K aan de buis. Meng door vortexen. Kort gecentrifugeerd pulse-buis zodat alle van de oplossing in de bodem van de buis en incubeer bij 65 ° C gedurende 15 minuten, afkoelen tot kamertemperatuur, daarna op ijs 3-5 min.
- Voeg 350 ul van MPC Protein Precipitation Reagent aan de buis en door vortexen gemengd vervolgens gedurende 10 sec.
- Pellet thij afval door centrifugatie gedurende 10 min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Breng het supernatant naar een schone 2 ml buisje en gooi de pellet.
- Voeg 570 ul isopropanol aan de supernatant. Meng door het buisje meerdere malen.
- Pellet het DNA door centrifugatie gedurende 10 min bij 12.000 xg bij 4 ° C. Verwijder de isopropanol zonder loskomen van de DNA-pellet.
- Voeg 500 pi van 75% ethanol om de pellet te wassen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 12.000 xg bij 4 ° C. Verwijder de ethanol zonder de DNA pellet. Droog de pellet bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Let op: Niet te droog het DNA pellet.
- Resuspendeer de DNA pellet in 50 ul TE-buffer.
- Valideer de grootte van het geïsoleerde DNA in vergelijking met de controle Fosmid DNA (40 kb, 100 ng / ul) in de kit, via gel elektroforese op een 1% agarose gel.
- Doe 50 mug guts in een 2 ml buisje met 500 ul TriPure Isolation Reagent. Meng gedurende 1 min bij 2000 rpm snelheid op ijs met een homogenisator. Laten zitten bij RT gedurende 5 minuten tot dissociatie van nucleoproteïne complexen mogelijk te maken.
- Voeg 100 pl chloroform en vortex gedurende 12 sec, en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de buis zonder storende gescheiden fasen.
- Breng waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 250 ul isopropanol, goed mengen, en zet bij -20 ° C gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te precipiteren RNA.
- Giet het supernatans zonder loskomen pellet. Was de pellet met 750 ul 75% ethanol.
- Pipetteer het supernatant zonder de pellet te verstoren. Eenir drogen de buis gedurende 2 minuten.
- Resuspendeer de RNA met 30 ul nuclease vrij water.
- Behandel het totale RNA met DNase bij 37 ° C gedurende 20 min, en vervolgens de DNase door incubatie bij 75 ° C geïnactiveerd gedurende 15 minuten. Neerslag RNA met ethanol en resuspendeer RNA in 30 ul nuclease vrij water.
- Wordt de hoeveelheid totaal RNA met een NanoDrop.
- PCR amplificatie van ribosomaal RNA genfragmenten
Deze stap creëert monsterspecifieke rRNA pools die wordt gebruikt als mal voor in vitro transcriptie anti-sense ribosomaal RNA (arRNA) probes die complementair zijn aan rRNA in het totale RNA monster.- Ontwerpen en synthetiseren voor primer sets rRNA PCR fragment (Tabel 1).
- PCR run in 50ul reactie met Taq DNA polymerase (Qiagen) met 50 ng DNA-matrijs, 1 x PCR buffer, 1,5 mM Mg 2 Cl, 0,2 uM primers met 35 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 10 sec, 15 sec gloeien bij 40 ° C bacteriële 23S amplicon en 50 ° C voor de andere amplicons, en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min (laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 min).
- Zie PCR producten op 1% agarose gel.
- Zuiver PCR producten met behulp van de QIAquick PCR purification kit met elutie in 50 pl elutiebuffer. Kwantificeren van de concentratie met behulp van NanoDrop.
- In vitro transcriptie van biotine-gelabelde anti-sense probes rRNA (arRNA). Opmerking: In deze stap sample probes van verschillende rRNA amplicons worden gesynthetiseerd met de MEGAscript T7 kit.
- Stel een 20 ul reactie voor elk monster bepaald rRNA amplicon door mengen van de onderstaande bestanddelen (Tabel 2). Incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Voeg 1 ul DNase I (in de kit) aan de reactie en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min om de DNA template te verwijderen.
- Voeg 100 ul 100% ethanol aan het reactiemengsel, centrifuge bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te precipiteren gesynthetiseerd arRNA. Gooi supernatant en was het pellet met 750 ul 75% ethanol. Resuspendeer RNA-probes in 50 ul nuclease vrij water.
- Kwantificeer RNA-concentratie met behulp van een NanoDrop. Store probes bij -80 ° C.
- Stel een 20 ul reactie voor elk monster bepaald rRNA amplicon door mengen van de onderstaande bestanddelen (Tabel 2). Incubeer overnacht bij 37 ° C.
- rRNA aftrekken met gebiotinyleerd arRNA. Opmerking: Deze stap maakt gebruik van het gebiotinyleerde arRNA te hybridiseren aan rRNA in het totale RNA monster. De rRNA-hybriden arRNA worden gevangen door streptavidine-gecoate magnetische korrels. De procedure is gebaseerd op het protocol beschreven in referentie 13 met kleine modificatie.
- Reagentia
- Bereid 0,1 N NaOH, 20X natrium chlooride-citraat (SSC) en 1 X SSC met 20% formamide.
- Hybridisatie
- Meng 1 ug totaal RNA met bacteriële 16S en 23S probes (0,75 ug elk), mug 18S en 28S probes (0,75 ug elk), 1 pi RNase inhibitor, 2,5 ui 20X SSC buffer, 10 pi 100% formamide in een 200 pi PCR tube , add nuclease-vrij water tot 50 ul.
- Plaats de reactiebuis in een thermal cycler en incubeer bij 70 ° C gedurende 5 minuten tot secundaire structuur openen en opvoeren tot 25 ° C met 5 ° C gedurende 1 min stappen per ° C voor de hybridisatie van rRNA en arRNA probes.
- Verwijdering van rRNA
- Breng 300 pi streptavidine gecoate kralen in een 1,7 ml buis. Plaats de buis op een magnetische scheidingsrek aan de korrels te immobiliseren. Verwijder supernatant. Resuspendeer de parels in 300 pl 0,1 N NaOH en mix goed. Plaats de buis om de magnetische rek en pipetteer het supernatant. Resuspendeer de kralen in 300 ul 1X SSC, meng goed, immobiliseren van de kralen en pipetteer het supernatant. Herhaal wassen met 300 pi 1X SSC een keer.
- Maak 3 aliquots van kralen, 100 ui elk in 1,7 ml buizen. Plaats de buis op de magnetische rek en verwijder het supernatant door pipetteren. Opmerking: De monsters van kralen worden gebruikt voor 3 rondes van het vastleggen van gebiotinyleerd rRNA-arRNA hybriden.
- Voeg 50 ul 1X SSC met 20% formamide in de hybridisatie 50 pl reactie. Breng de reactie in de eerste kraal aliquot buis, en meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min om de gebiotinyleerde probe-rRNA hybriden worden gevangen door streptavidine beads. Flick de buis elke 2 minuten te mengen tijdens de incubatie.
- Plaats de buis op de magnetische rek aan de parels te immobiliseren, Breng de bovenste de tweede aliquot van kralen, goed mengen en incuberen, zoals hierboven. Voeren de derde opname door de overdracht van supernatant in de derde buis van kralen. Meng en incubeer.
- Overdracht niet-rRNA supernatant naar een nieuwe buis en gedrag zuivering met behulp van RNeasy MinElute kit om formamide te verwijderen na de handleiding van de fabrikant.
- Controleer de rRNA uitputting efficiëntie door een Agilent 6000 RNA Pico chip kit een Bioanalyzer (figuur 4).
- Reagentia
Opmerking: Metagenomic DNA wordt geïsoleerd met het Meta-G-Nome DNA Isolation Kit (Epicentre Biotechnologies) met de modificatie hieronder beschreven.
4. Total RNA Isolation
Opmerking: Reinig het werkgebiedmet RNaseZap om RNase besmetting te minimaliseren. Metagenomic RNA werd geïsoleerd uit mug gut specimens met het TriPure Isolation Reagent (Roche) met een kleine modificatie.
5. Ribosomaal RNA Uitputting
Opmerking: Het protocol is ontwikkeld op basis van eerder beschreven methoden 12,13,15.
Opmerking: De rRNA verarmd RNA monsters zijn onderworpen aan versterking mRNA, indien nodig 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol bestaat uit drie onderdelen: (1) de voorbereiding van metagenomic DNA templates voor rRNA PCR, (2) creatie van het monster specifieke capture rRNA probes; (3) uitputting van rRNA uit totaal RNA door subtractieve hybridisatie. Isolatie van hoge kwaliteit metagenomic DNA en RNA essentieel is voor het gehele proces. De gemodificeerde Meta-G-Nome DNA isolatie protocol levert hoogwaardige metagenomic DNA van mug darmen, zoals weergegeven in figuur 2. Het kan een uitdaging zijn om kwalitatief hoogwaardige totaal RNA te isoleren van muggen lef. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van verschillende enzymen, waaronder RNase, in mug ingewanden. We vergeleken de totale RNA-extractie prestaties van Qiagen RNA isolatie kit aan Roche TriPure. Elektroferogram van Agilent Bioanalyzer analyse bleek dat het totale RNA geïsoleerd met behulp van TriPure duidelijk rRNA pieken (figuur 3), wat niet gezien in de RNA verkregen met de Qiagen kit bevat. Misschien mug-afgeleide RNase is doeltreffend worden geïnactiveerdd door de fenol in TriPure. Typisch, 50 mosquito guts opbrengst ca. 20 ug totaal RNA. De ideale hoeveelheid van totaal RNA input voor de huidige rRNA uitputting taak is ~ 1 ug, hetgeen het rendement van rRNA aftrekken en opbrengsten ~ 150 ng gezuiverd RNA optimaliseert. Figuur 4 toont de vergelijking van RNA elektroferogrammen voor en na aftrekken rRNA. De rRNA efficiënt verwijderd, terwijl de niet-rRNA species zijn sterk verrijkt in de resterende RNA. De aanwezigheid van grote omvang RNA (> 2.000 bp) geeft een goede kwaliteit van verrijkte mRNA (Figuur 4B). Het protocol kan worden opgeschaald naar grotere ingang van RNA voor verwerking geschikt. Meestal 5 ug RNA is vereist voor de RNA-seq proces. Daarom gebruikten we MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit om een voldoende hoeveelheid rRNA verarmd RNA voor RNA-Seq genereren. Wij raden u aan 150 ng of meer gezuiverd RNA voor de RNA-amplificatie om de trouw van versterking te garanderen. Dit protocol is applgekopieerd naar een mug darm RNA-Seq-project. De rRNA depletie werd effectief bereikt door dat afkomstig invangingsprobes. Tabel 3 vermeldt het percentage rRNA leest de RNA-Seq uitgang van vier monsters. Twee suiker-fed en twee bloed-fed darm monsters werden verwerkt voor uitputting en RNA-Seq. De Illumina sequencing gegenereerde 23-24M leest voor elk monster. De rRNA aftrekken effectief verwijderd 90-99% rRNA zowel mug weefsel en microben in de darmen monsters. Depletie bijna volledig in de suiker-fed gut samples en 6.12-10.98% rRNA bleef in het bloed gevoede monsters (Tabel 3).
| Amplicon | Forward 5'-3 ' | Reverse 5'-3 ' |
| Bacteriële 16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| Bacteriële 23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| Mosquito 18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| Mosquito 28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
Tabel 1. Primer sets voor rRNA fragment amplificatie bacteriële 16S en 23 primers zijn ontworpen op basis van 20,19. T7 promoter sequenties zijn vet gedrukt.
| 2 pi | |
| PCR producten (0,5-1 ug) | 1,5 pl |
| ATP (75mm) | 2 pi |
| GTP (75mm) | 2 pi |
| CTP (75mm) | 1,5 pl |
| UTP (75mm) | 1,5 pl |
| Biotine-11-CTP (10 mM) | 3,75 ul |
| Biotine-16-UTP (10 mM) | 3,75 ul |
| T7 RNA polymerase | 2 pi |
Tabel 2. Componenten van in vitro synthese van rRNA probes.
| Monster | Totaal leest | Mosquito rRNAleest (%) | Microbiële 16S leest (%) | Microbiële 23S leest (%) | Totaal% van rRNA maal gelezen * |
| SM1 | 24341850 | 121,987 (0.50) | 3,717 (0.02) | 6,810 (0.03) | 0,54 |
| SM2 | 23487202 | 114,430 (0.49) | 30,271 (0.13) | 38,261 (0.16) | 0,78 |
| BM1 | 23438304 | 265,433 (1.13) | 2,054,777 (8.77) | 253,051 (1.08) | 10,98 |
| BM2 | 24212240 | 110,240 (0.46) | 1,186,423 (4.90) | 185,074 (0.76) | 6,12 |
Tabel 3. Statken van rRNA leest in RNA-seq-uitgang. SM: suiker gevoed darm; BM: bloed gevoed gut. *: De som van de percentages van mug rRNA en microbiële rRNA leest.
Figuur 1. Stroomdiagram de processtappen van metagenomic DNA en RNA isolatie, rRNA capture probe synthese, hybridisatie en vastleggen kralen gebaseerde uitputting.
Figuur 2. Metagenomic DNA isolatie. DNA monsters werden gescheiden op 1% agarose gel. 1, Fosmid DNA (40kb), 2, Mosquito darm metagenomic DNA.
Figuur 3.Vergelijking van twee totaal RNA isolatie reagentia voor hun efficiëntie in het extraheren van een kwaliteit RNA uit mug darm. Overlay van elektroferogrammen blijkt dat de totale RNA van TriPure isolatie (in het blauw) rRNA pieken en brede RNA verspreiding had, terwijl dat van Qiagen isolatie (in het rood) had geen duidelijke rRNA pieken.
Figuur 4. Efficiëntie van rRNA uitputting. Elektroferogrammen tonen het totaal RNA vóór (A) en na (B) rRNA uitputting. De rRNA pieken werden efficiënt verwijderd. RNA groter dan 4 kB blijft in rRNA uitgeputte monster. De RNA concentratie was 107,6 ng / ul in (A) en 8,6 ng / ul in (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een complexe microbiële gemeenschap leeft in de mug darm ecosysteem 14,16,17. Metatranscriptomic sequencing (RNA-seq) kan onthullen contextafhankelijk functionele informatie door het ondervragen van de gehele microbiële transcriptoom 4,18. Technisch oligo-d (T) gemedieerde verrijking van mRNA prokaryotische niet toepasbaar omdat de afwezigheid van stabiele poly (A) staarten van de boodschappers. Alternatief is rRNA depletie gebruikt voor mRNA verrijking. Hier hebben we een aftrekking-gebaseerd protocol om rRNA afbrekende met rRNA-probes gemaakt van de eigen metagenomic DNA in de mug darm microbiële gemeenschap. De efficiëntie van de verwijdering rRNA afhankelijk van de dekking van het rRNA capture probes die worden gegenereerd door de rRNA PCR. De gloeien efficiëntie van verschillende primer sets gericht geconserveerde gebieden varieert over verschillende taxa 19. Daarom raden wij proberen verschillende combinaties van primers op metagenomic monsters, en vervolgens bundelen derRNA producten om de dekking te maximaliseren. In onze procedure maken we capture probes door combinatie rRNA PCR producten van twee vooruit en twee reverse primers die kunnen vormen 4 combinaties van primer sets (tabel 1). Bovendien rRNA beoogt een secundaire structuur. Vergeleken met volledige lengte als probes rRNA 13 kleinere rRNA fragmenten een lagere neiging tot secundaire structuur te vormen die de hybridisatie van capture probes kan vergemakkelijken het monster rRNA. De gebiotinyleerde probes hybridiseren aan rRNA efficiënt in het totale RNA monster en de hybriden worden verwijderd door het vastleggen met streptavidine gecoate parels. De procedure verwijdert de meeste rRNA (figuur 4). In de vier monsters Wij hebben, werd 90-99% van rRNA daadwerkelijk leeg is (Tabel 3). Deze procedure kan verder worden gemodificeerd voor verschillende insecten-geassocieerde microbiome studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie 1SC2GM092789-01A1, en MS was een onderzoek geleerde van NMSU Howard Hughes Medical Institution Undergraduate Research Programma's. De video werd geregisseerd en geproduceerd door Amy Lanasa en gecoördineerd door dr. Philip Lewis met de Creative Media Instituut in NMSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
