Summary
एक ribosomal शाही सेना (rRNA) रिक्तीकरण प्रोटोकॉल आरएनए - seq मच्छर पेट metatranscriptome के लिए दूत शाही सेना (mRNA) को समृद्ध करने के लिए विकसित किया गया था. नमूना विशिष्ट rRNA जांच, जो घटाव के माध्यम से rRNA निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया, मच्छर और उसके आंत रोगाणुओं से बनाया गया था. प्रोटोकॉल के प्रदर्शन rRNA का लगभग 90-99% के हटाने में परिणाम कर सकते हैं.
Abstract
मच्छर पेट कीट के जीवन चक्र के विभिन्न चरणों के पार गतिशील माइक्रोबियल समुदायों accommodates. आनुवंशिक और पेट समुदाय की क्षमता कार्यक्षमता की विशेषता मच्छर जीवन के लक्षण पर पेट microbiota के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. Metagenomic शाही सेना Seq एक माइक्रोबियल समुदाय में उपस्थित विभिन्न रोगाणुओं से transcriptomes का विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. दूत शाही सेना आमतौर पर केवल कुल शाही सेना का 1-3% शामिल हैं, जबकि rRNA लगभग 90% का गठन किया है. यह एक metagenomic माइक्रोबियल शाही सेना के नमूने से दूत शाही सेना को समृद्ध चुनौती दे रहा है, क्योंकि सबसे prokaryotic mRNA प्रजातियों स्थिर पाली (ए) की पूंछ की कमी. यह oligo घ (टी) मध्यस्थता mRNA अलगाव से बचाता है. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि व्युत्पन्न rRNA जांच पर कब्जा करने के लिए एक metagenomic कुल शाही सेना नमूना से rRNA हटाने नमूना रोजगार का वर्णन. शुरू करने के लिए, दोनों मच्छर और माइक्रोबियल छोटे और बड़े सबयूनिट rRNA टुकड़े एक metagenomic समुदाय डीएनए नमूने से परिलक्षित कर रहे हैं. फिर, समुदायसामुदायिक विशिष्ट biotinylated antisense ribosomal शाही सेना जांच T7 आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर इन विट्रो में संश्लेषित कर रहे हैं. biotinylated rRNA जांच कुल शाही सेना के लिए कर रहे hybridized. संकर streptavidin लिपटे मोतियों के द्वारा कब्जा कर रहे हैं और कुल शाही सेना से हटा दिया. कुशलतापूर्वक इस घटाव आधारित प्रोटोकॉल दोनों और माइक्रोबियल rRNA कुल शाही सेना नमूना से मच्छर को हटा. mRNA समृद्ध नमूना आगे आरएनए प्रवर्धन और आरएनए Seq के लिए कार्रवाई की है.
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी बहुत वर्गीकरण संबंधी संरचना और एक सूक्ष्म संयोजन के आनुवंशिक कार्यक्षमता का आकलन करने की अनुमति देकर metagenomics अध्ययन उन्नत. आरएनए (आरएनए Seq) अनुक्रमण 1 संस्कृति आधारित तरीकों को बायपास करने के लिए अलग अलग संदर्भों 2-5 में माइक्रोबियल metatranscriptomes की जांच कर सकते हैं. माइक्रोबियल आरएनए - seq के लिए एक प्रमुख बाधा समृद्ध बनाने के mRNA में कठिनाई है, के रूप में prokaryotic mRNA प्रजातियों stably polyadenylated नहीं कर रहे हैं. इसलिए, oligo घ (टी) मध्यस्थता दूत संवर्धन लागू नहीं है. प्रचुर मात्रा rRNA हटाने mRNA को समृद्ध करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है. Microexpress बैक्टीरियल mRNA संवर्धन किट (Ambion), RiboMinus Transcriptome अलगाव किट (बैक्टीरिया) (जीवन टेक्नोलॉजीज), और mRNA केवल prokaryotic mRNA अलगाव (Epicentre) किट कि preferentially एक exonuclease साथ rRNA degrades जैसे वाणिज्यिक rRNA रिक्तीकरण किट, इस्तेमाल किया गया है 6-8 rRNA को हटाने के लिए. हालांकि, Microexpress में कब्जा जांचया RiboMinus ठेठ ग्राम पॉजिटिव और ग्राम - निगेटिव बैक्टीरिया से ज्ञात rRNA (निर्माताओं विनिर्देशों देखें) को हटाने के लिए अच्छा है, लेकिन अज्ञात रोगाणुओं से कम rRNA के साथ संगत कर रहे हैं. नतीजतन, हटाने metagenomic नमूने 8-10 के लिए कम कुशल हो सकता है. इसके अलावा, mRNA बहुतायत निष्ठा संदिग्ध था जब exonuclease उपचार 11 में लागू किया गया था. कुल मिलाकर, घटाव आधारित rRNA रिक्तीकरण है कम पक्षपाती और अधिक metagenomic 10-13 सेटिंग्स में mRNA संवर्धन में प्रभावी था.
मच्छर पेट एक गतिशील माइक्रोबियल समुदाय 14 accommodates. हम मच्छर आंत microbiome की शाही सेना Seq का उपयोग करके समारोह निस्र्पक में रुचि रखते हैं. एक शाही सेना मच्छर हिम्मत से अलग नमूने में, दोनों मच्छर और माइक्रोबियल शाही सेना मौजूद हैं. यहाँ, हम समुदाय विशिष्ट rRNA जांच का उपयोग करने के लिए कुशलतापूर्वक subtractive संकरण द्वारा मच्छर और माइक्रोबियल rRNA व्यय के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. परिणामी mRNAसमृद्ध नमूने शाही सेना Seq के लिए उपयुक्त हैं. समग्र कार्यप्रवाह चित्रा 1 में दर्शाया जाता है.
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Protocol
प्रक्रिया
1. मच्छर पालन
- 80% और प्रकाश / अंधेरे के 12:12 घंटा चक्र नमी के साथ 27.5 पर रियर मच्छर एनोफ़ेलीज़ gambiae एक कीटपालन - स्थल में G3 तनाव डिग्री सेल्सियस.
- जमीन 1:1 के अनुपात में शराब बनानेवाला है खमीर के साथ बिल्ली का खाना साथ लार्वा फ़ीड.
- चूहों रक्त पर 3 दिन अंडा उत्पादन के लिए के बाद उभरने में वयस्क मच्छरों खिलाओ.
2. मच्छर आंत विच्छेदन
- आटोक्लेव विच्छेदन उपकरण (स्लाइड और संदंश).
- 50 एक aspirator का उपयोग मच्छरों ले लीजिए और सीओ 2 प्रवाह बिस्तर (अंतिम Flypad) पर उन्हें जगह. तीन पेट्री मच्छर के शरीर की सतह को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल युक्त व्यंजनों में एक मच्छर नमूना sequentially कुल्ला.
- एक stereomicroscopy तहत एक गिलास स्लाइड पर नमूना रखें. पेट निकालें.
- हालत प्रति 50 हिम्मत metagenomic डीएनए अलगाव के लिए ले लीजिए. Metagenomic शाही सेना के अलगाव के लिए हालत प्रति 50 हिम्मत ले लीजिए. 3. Metagenomic डीएनए अलगाव
- 300 μl ते में 50 मच्छर हिम्मत रखें. 1 मिनट के लिए गति 2,000 rpm पर बर्फ पर जैव जनरल PRO200 homogenizer (प्रो वैज्ञानिक इंक, यूएसए) का उपयोग कर उन्हें homogenize.
- के 2 μl तैयार lyse Lysozyme समाधान और सेल निलंबन के लिए एक RNase 1 μl जोड़ें. मिक्स vortexing और सेते से 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए.
- मेटा lysis (2x) समाधान और ट्यूब को 1 proteinase कश्मीर के μl के 300 μl जोड़ें. Vortexing द्वारा मिक्स. संक्षेप ट्यूब पल्स अपकेंद्रित्र करने के लिए सुनिश्चित करें कि समाधान के सभी ट्यूब के नीचे है, और 15 मिनट, शांत करने के लिए कमरे के तापमान, फिर 3-5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- ट्यूब और मिश्रण करने के लिए 10 सेकंड के लिए सख्ती vortexing द्वारा MPC प्रोटीन वर्षा अभिकर्मक के 350 μl जोड़ें.
- गोली टी12,000 XG पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा मलबे में 4 डिग्री सेल्सियस
- एक साफ 2 मिलीलीटर ट्यूब तैरनेवाला स्थानांतरण, और गोली त्यागें.
- तैरनेवाला isopropanol के 570 μl जोड़ें. Inverting ट्यूब कई बार द्वारा मिक्स.
- Centrifugation द्वारा 12,000 XG पर 10 मिनट के लिए 4 बजे ° डीएनए सी. गोली डीएनए गोली dislodging के बिना isopropanol निकालें.
- 75% इथेनॉल के 500 μl जोड़ें गोली धो लो. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डीएनए गोली को परेशान करने के बिना इथेनॉल निकालें. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली एयर सूखी. नोट: डीएनए गोली पर सूखी नहीं क्या.
- ते बफर के 50 μl में डीएनए गोली Resuspend.
- किट में दिए गए एक 1% agarose जेल पर जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से, पृथक डीएनए के आकार, Fosmid नियंत्रण (100 एनजी / μl 40 केबी) डीएनए की तुलना द्वारा मान्य है.
- 500 μl TriPure अलगाव अभिकर्मक के साथ एक 2-मिलीलीटर ट्यूब में 50 मच्छर हिम्मत रखो. गति 2,000 rpm पर 1 मिनट के लिए एक homogenizer का उपयोग कर बर्फ पर homogenize. आरटी में 5 मिनट के लिए बैठने के लिए nucleoprotein परिसरों की हदबंदी की अनुमति.
- 100 μl और 12 सेकंड के लिए क्लोरोफॉर्म भंवर जोड़ें, और दो आरटी पर बैठने के 2 मिनट के लिए.
- 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र. सावधानी से परेशान अलग चरणों के बिना ट्यूब ले.
- एक नया ट्यूब स्थानांतरण जलीय चरण, 250 μl isopropanol जोड़ने के लिए, अच्छी तरह से मिश्रण, और 20 मिनट के लिए ° सी -20 में डाल दिया.
- 4 पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र ° C तलछट शाही सेना के लिए.
- गोली dislodging बिना तैरनेवाला त्यागें. 750 μl 75% इथेनॉल के साथ गोली धो लें.
- गोली को परेशान करने के बिना तैरनेवाला विंदुक. एकआईआर 2 मिनट के लिए ट्यूब सूखी.
- 30 μl nuclease मुफ्त पानी के साथ शाही सेना Resuspend.
- DNase के साथ कुल शाही सेना को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इलाज के लिए और फिर 75 में incubating द्वारा DNase निष्क्रिय ° सी 15 मिनट के लिए. पेंदी में बैठ जाना और 30 μl nuclease मुफ्त पानी में इथेनॉल resuspend शाही सेना के साथ शाही सेना.
- एक NanoDrop का उपयोग करते हुए कुल शाही सेना की मात्रा का निर्धारण करते हैं.
- Ribosomal शाही सेना जीन टुकड़े के पीसीआर प्रवर्धन
यह कदम नमूना विशिष्ट rRNA पूल है, जो के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा विरोधी भावना ribosomal शाही सेना (arRNA) जांच है कि कुल शाही सेना के नमूने में rRNA मानार्थ हैं उपज पैदा करता है.- डिजाइन और rRNA टुकड़ा पीसीआर (1 टेबल) के लिए प्राइमर सेट synthesize.
- 50 में पीसीआर भागोμl 50 डीएनए टेम्पलेट एनजी, 1 x पीसीआर बफर, 1.5mm 2 मिलीग्राम के साथ Taq डीएनए पोलीमरेज़ (Qiagen) का उपयोग कर प्रतिक्रिया सीएल, 94 पर denaturing के 35 चक्र के साथ 0.2 सुक्ष्ममापी प्राइमरों डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड के लिए, 40 में 15 सेकंड annealing डिग्री सेल्सियस के लिए बैक्टीरियल 23S amplicon, और 50 ° C ° अन्य amplicons, और 72 में विस्तार के लिए 1 मिनट (72 पर अंतिम विस्तार ° 5 मिनट के लिए सी) के लिए सी.
- 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों देखें.
- पीसीआर 50 μl क्षालन बफर में क्षालन के साथ QIAquick पीसीआर किट का उपयोग कर शुद्धीकरण उत्पादों शुद्ध. यों एकाग्रता NanoDrop का उपयोग कर.
- बायोटिन लेबल विरोधी भावना rRNA जांच (arRNA) विट्रो प्रतिलेखन में. नोट: इस चरण में, विभिन्न rRNA amplicons से नमूना विशिष्ट जांच MEGAscript T7 किट का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं.
- नीचे सामग्री (2 तालिका) के मिश्रण से प्रत्येक नमूना विशिष्ट rRNA amplicon के लिए एक 20 μl प्रतिक्रिया सेट. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- प्रतिक्रिया और डीएनए टेम्पलेट को दूर करने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 1 μl DNase मैं किट में शामिल जोड़ें.
- 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर 4 में 100 μl 100% की प्रतिक्रिया के लिए इथेनॉल, अपकेंद्रित्र जोड़ें ° C पेंदी में बैठ जाना arRNA संश्लेषित. तैरनेवाला त्यागें और 750 μl 75% इथेनॉल के साथ गोली धो लो. Resuspend 50 μl nuclease मुफ्त पानी में शाही सेना जांच.
- आरएनए एकाग्रता का उपयोग कर एक NanoDrop यों. -80 पर स्टोर जांच डिग्री सेल्सियस
- नीचे सामग्री (2 तालिका) के मिश्रण से प्रत्येक नमूना विशिष्ट rRNA amplicon के लिए एक 20 μl प्रतिक्रिया सेट. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- rRNA घटाव biotinylated arRNA के साथ. नोट: यह कदम biotinylated कुल शाही सेना के नमूने में rRNA संकरण arRNA कार्यरत हैं. rRNA arRNA संकर streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों द्वारा कब्जा कर रहे हैं. प्रक्रिया मामूली संशोधन के साथ 13 के संदर्भ में वर्णित प्रोटोकॉल पर आधारित है.
- अभिकर्मकों
- 0.1 एन NaOH, 20X सोडियम chlor तैयार(एसएससी) ide-साइट्रेट और 1 एक्स एसएससी 20% Formamide के साथ.
- संकरण
- बैक्टीरियल 16S और 23S जांच (0.75 ग्राम प्रत्येक), मच्छर 18S और 28S जांच (0.75 ग्राम प्रत्येक) के साथ मिश्रण 1 ग्राम कुल शाही सेना, 1 μl RNase अवरोध करनेवाला, 2.5 μl 20X एसएससी बफर, एक 200 μl पीसीआर ट्यूब में 10 μl 100% Formamide , ऐड nuclease मुक्त 50 μl पानी.
- एक थर्मल और 70 में cycler सेते में प्रतिक्रिया ट्यूब रखें डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट माध्यमिक संरचना को खोलने के लिए और 25 से नीचे रैंप ° C 1 मिनट प्रत्येक डिग्री सेल्सियस के लिए 5 डिग्री सेल्सियस वेतन वृद्धि का उपयोग करने के लिए rRNA और arRNA जांच के संकरण की अनुमति है.
- RRNA का हटाया जाना
- एक 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में 300 μl streptavidin लिपटे मोतियों के स्थानांतरण. ट्यूब को एक चुंबकीय जुदाई को मोती स्थिर रैक पर रखें. तैरनेवाला निकालें. 300 μl में 0.1N NaOH और मील के मोती Resuspendअच्छी तरह से एक्स. ट्यूब वापस चुंबकीय रैक प्लेस और तैरनेवाला विंदुक. 1X एसएससी के 300 μl में मोती Resuspend, अच्छी तरह से मिश्रण, मोती स्थिर और बंद तैरनेवाला विंदुक. 1X एसएससी एक और अधिक समय की 300 μl के साथ धो दोहराएँ.
- मोतियों की 3 aliquots, 100 μl प्रत्येक, 1.7 मिलीलीटर ट्यूबों में. चुंबकीय रैक पर ट्यूब प्लेस, और pipetting द्वारा तैरनेवाला हटा. नोट: मोतियों की aliquots biotinylated rRNA arRNA संकर कैप्चरिंग के 3 दौर के लिए उपयोग किया जाता है.
- 50 μl संकरण प्रतिक्रिया में 20% Formamide के साथ 50 μl 1X एसएससी जोड़ें. स्थानांतरण 1 मनका अशेष भाजक ट्यूब में प्रतिक्रिया, और अच्छी तरह से मिश्रण. आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते biotinylated जांच rRNA संकर streptavidin मोती द्वारा कब्जा करने के लिए अनुमति देते हैं. ट्यूब हर 2 मिनट ऊष्मायन के दौरान मिश्रण झटका.
- चुंबकीय रैक पर ट्यूब प्लेस को मोती को स्थिर करने के लिए, 2 aliq तैरनेवाला स्थानांतरणमोतियों की uot, मिश्रण अच्छी तरह से और इसके बाद के संस्करण के रूप में सेते हैं. मोतियों की 3 ट्यूब में तैरनेवाला स्थानांतरित द्वारा 3 पर कब्जा आचरण. मिश्रण और सेते हैं.
- एक नया ट्यूब और आचरण शुद्धि RNeasy MinElute किट का उपयोग करने के लिए निर्माता की पुस्तिका के बाद Formamide को दूर में गैर rRNA तैरनेवाला स्थानांतरण.
- RRNA रिक्तीकरण एक Bioanalyzer (4 चित्रा) पर एक Agilent आरएनए 6000 पिको चिप किट का उपयोग करके दक्षता की जाँच करें.
- अभिकर्मकों
नोट: Metagenomic डीएनए नीचे वर्णित संशोधन के साथ मेटा जी नोम डीएनए अलगाव किट (Epicentre जैव प्रौद्योगिकी) का उपयोग अलग है.
4. कुल शाही सेना अलगाव
नोट: साफ कार्य क्षेत्रRNase संदूषण को कम RNaseZap के साथ. मच्छर पेट एक मामूली संशोधन के साथ TriPure अलगाव अभिकर्मक (Roche) का उपयोग करते हुए नमूनों से Metagenomic शाही सेना पृथक किया गया.
5. Ribosomal शाही सेना रिक्तीकरण
नोट: पहले से वर्णित 12,13,15 तरीकों पर आधारित प्रोटोकॉल विकसित किया गया था.
नोट: rRNA समाप्त शाही सेना के नमूने प्रवर्धन mRNA यदि आवश्यक 8 के अधीन हैं.
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Representative Results
, (2) नमूना विशिष्ट कब्जा rRNA जांच के निर्माण, (3) rRNA की कमी subtractive संकरण द्वारा कुल शाही सेना से rRNA के लिए पीसीआर metagenomic डीएनए टेम्पलेट्स की तैयारी (1): प्रोटोकॉल तीन वर्गों में शामिल हैं. उच्च गुणवत्ता metagenomic डीएनए और आरएनए के अलगाव पूरी प्रक्रिया के लिए आवश्यक है. संशोधित मेटा जी नोम डीएनए अलगाव प्रोटोकॉल पैदावार उच्च गुणवत्ता वाले मच्छर हिम्मत से metagenomic डीएनए के रूप में चित्रा 2 में दिखाया. यह मच्छर हिम्मत से उच्च गुणवत्ता वाले कुल शाही सेना को अलग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यह संभावना है मच्छर हिम्मत में RNase, सहित विभिन्न एंजाइमों, की उपस्थिति की वजह से है. हम Qiagen शाही सेना अलगाव Roche TriPure के लिए किट की कुल शाही सेना निष्कर्षण प्रदर्शन की तुलना में. Agilent Bioanalyzer विश्लेषण के Electropherogram से पता चला है कि कुल पृथक शाही सेना TriPure का उपयोग स्पष्ट rRNA (3 चित्रा) चोटियों, जो शाही सेना में प्राप्त नहीं देखा है Qiagen किट का उपयोग होता है. शायद मच्छर व्युत्पन्न RNase प्रभावी रूप से निष्क्रिय हैTriPure में phenol द्वारा घ. आमतौर पर, 50 मच्छर हिम्मत ~ उपज 20 ग्राम कुल शाही सेना. वर्तमान rRNA कमी की प्रक्रिया के लिए कुल शाही सेना इनपुट के आदर्श राशि ~ 1 ग्राम, जो rRNA घटाव और पैदावार ~ 150 एनजी शुद्ध शाही सेना की दक्षता का अनुकूलन है चित्रा 4 rRNA घटाव पहले और बाद में शाही सेना electropherograms की तुलना से पता चलता है. rRNA कुशलता से हटा दिया गया था जबकि गैर rRNA प्रजातियों बहुत शेष शाही सेना में समृद्ध थे. बड़े आकार के शाही सेना (> २००० बीपी) की उपस्थिति समृद्ध mRNA (4B चित्रा) की एक अच्छी गुणवत्ता को इंगित करता है. प्रोटोकॉल को बढ़ाया जा सकता है प्रसंस्करण के लिए एक शाही सेना के अधिक से अधिक निवेश को समायोजित. आमतौर पर 5 ग्राम शाही सेना शाही सेना seq प्रक्रिया के लिए आवश्यक है. इसलिए, हम MessageAmp द्वितीय बैक्टीरिया आरएनए प्रवर्धन किट का इस्तेमाल करने के लिए शाही सेना Seq के लिए एक rRNA समाप्त आरएनए की पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न. हम 150 एनजी का उपयोग कर अधिक या शाही सेना के प्रवर्धन के लिए शाही सेना शुद्ध प्रवर्धन की निष्ठा सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं. इस प्रोटोकॉल appl किया गया हैएक मच्छर पेट परियोजना शाही सेना Seq ied. rRNA रिक्तीकरण नमूना व्युत्पन्न कब्जा जांच का उपयोग करके प्रभावी ढंग से हासिल की थी 3 सूचियों टेबल. rRNA का प्रतिशत चार नमूनों की शाही सेना Seq उत्पादन में पढ़ता है. दो चीनी खिलाया और दो रक्त खिलाया पेट नमूने के रिक्तीकरण और आरएनए Seq लिए प्रोसेस किया गया. Illumina 23-24M उत्पन्न अनुक्रमण प्रत्येक नमूने के लिए पढ़ता है. rRNA घटाव प्रभावी रूप से दोनों मच्छर और पेट के नमूनों में ऊतक रोगाणुओं से 90-99% rRNA हटा दिया. रिक्तीकरण चीनी खिलाया पेट के नमूनों में लगभग पूरा हो गया था, और 6.12-10.98% rRNA रक्त सिंचित नमूने (3 तालिका) में बने रहे.
| Amplicon | फॉरवर्ड 5'-3 ' | 5'-3 उल्टा ' |
| बैक्टीरियल 16S | 27F | 803R_T7 |
| आगाGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| बैक्टीरियल 23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| मच्छर 18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| मच्छर 28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC सीएसी AGG टीएसी GGA सीसी | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
तालिका 1. RRNA टुकड़ा प्रवर्धन बैक्टीरियल 16S और 23 प्राइमरों के लिए प्राइमर सेट 20,19 के आधार पर डिजाइन किए हैं. T7 प्रमोटर दृश्यों बोल्ड में हैं.
| 2 μl | |
| पीसीआर उत्पादों (0.5-1 ग्राम) | 1.5 μl |
| एटीपी (75mm) | 2 μl |
| GTP (75mm) | 2 μl |
| CTP (75mm) | 1.5 μl |
| UTP (75mm) | 1.5 μl |
| बायोटिन-11-CTP (10mM) | 3.75 μl |
| बायोटिन-16-UTP (10mM) | 3.75 μl |
| T7 आरएनए पोलीमरेज़ | 2 μl |
तालिका 2 rRNA जांच के इन विट्रो संश्लेषण में घटक.
| नमूना | कुल पढ़ता | मच्छर rRNAपढ़ता (%) | माइक्रोबियल 16S पढ़ता (%) | माइक्रोबियल 23S पढ़ता (%) | RRNA पढ़ता की कुल% * |
| SM1 | 24,341,850 | १,२१,९८७ (०.५०) | ३७१७ (0.०२) | +६८१० (.०३) | 0.54 |
| SM2 | 23,487,202 | १,१४,४३० (०.४९) | +३०,२७१ (.13) | ३८२६१ (.१६) | 0.78 |
| BM1 | 23,438,304 | +२,६५,४३३ (1.13) | 2.054.777 (8,77) | +२५३०५१ (१.०८) | 10.98 |
| BM2 | 24,212,240 | ११०२४० (0.४६) | ११,८६,४२३ (4.90) | १,८५,०७४ (०.७६) | 6.12 |
3 टेबल स्टेट.rRNA के istics आरएनए - seq उत्पादन में पढ़ता है. चीनी खिलाया पेट, बी.एम.: एस.एम. खून खिलाया पेट. *: मच्छर rRNA और माइक्रोबियल rRNA प्रतिशत का योग पढ़ता है.
चित्रा 1. फ्लो चार्ट metagenomic डीएनए और आरएनए अलगाव के प्रक्रियात्मक कदम दिखा, rRNA पर कब्जा जांच संश्लेषण, संकरण, और मोती आधारित रिक्तीकरण पर कब्जा.
चित्रा 2. Metagenomic डीएनए अलगाव डीएनए नमूनों 1% agarose जेल पर अलग हो गए थे. 1, Fosmid (40kb) डीएनए, 2, मच्छर पेट metagenomic डीएनए.
चित्रा 3.दो मच्छर पेट से एक गुणवत्ता शाही सेना को निकालने में कुल शाही सेना उनकी दक्षता के लिए अलगाव अभिकर्मकों की तुलना करें. Electropherograms की ओवरले से पता चलता है कि (नीला) TriPure अलगाव से कुल शाही सेना rRNA चोटियों और व्यापक आरएनए वितरण किया था, जबकि Qiagen अलगाव (लाल) से कोई स्पष्ट rRNA चोटियों था.
चित्रा 4. RRNA कमी. Electropherograms की क्षमता (ए) और (बी) के बाद rRNA रिक्तीकरण से पहले कुल शाही सेना दिखाते हैं. rRNA चोटियों कुशलता से हटाया गया. RRNA समाप्त नमूना में 4kb से अधिक बनी हुई है शाही सेना. आरएनए एकाग्रता 107.6 एनजी / μl (ए) और 8.6 (बी) में एनजी / μl.
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Discussion
एक जटिल माइक्रोबियल समुदाय मच्छर पेट 14,16,17 पारिस्थितिकी तंत्र में रहता है. Metatranscriptomic अनुक्रमण (आरएनए - seq) पूरे माइक्रोबियल transcriptome 4,18 पूछताछ संदर्भ निर्भर कार्यात्मक जानकारी प्रकट कर सकते हैं. तकनीकी तौर पर, oligo घ (टी) prokaryotic mRNA की मध्यस्थता संवर्धन स्थिर दूतों के पूंछ (ए) पाली अभाव की वजह से लागू नहीं है. वैकल्पिक रूप से, rRNA कमी mRNA संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम एक घटाव आधारित प्रोटोकॉल विकसित rRNA खलाना rRNA मच्छर पेट माइक्रोबियल समुदाय में बहुत ही metagenomic डीएनए से बनाई गई जांच का उपयोग कर. rRNA हटाने के दक्षता कि rRNA पीसीआर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं rRNA कब्जा जांच के कवरेज पर निर्भर करता है. अलग प्राइमर का annealing दक्षता संरक्षित क्षेत्रों में विभिन्न 19 taxa भर में बदलता है लक्ष्यीकरण सेट. इसलिए, हम metagenomic नमूनों पर प्राइमरों के विभिन्न संयोजनों की कोशिश करने की सलाह देते हैं, और फिर poolingrRNA उत्पादों कवरेज को अधिकतम करने के लिए. हमारी प्रक्रिया में, हम दो आगे और दो रिवर्स प्राइमरों, जो प्राइमर सेट के 4 संयोजन (1 टेबल) के रूप में कर सकते हैं rRNA पीसीआर उत्पादों के संयोजन के द्वारा कब्जा जांच बनाते हैं. इसके अलावा, rRNA एक माध्यमिक संरचना के रूप में करने का इरादा रखता है. 13 जांच के रूप में पूरी लंबाई rRNA की तुलना में, छोटे rRNA टुकड़े एक कम माध्यमिक संरचना बनाने की प्रवृत्ति है, जो नमूना rRNA कब्जा जांच के संकरण की सुविधा हो सकती है. biotinylated जांच कुशलता से कुल शाही सेना के नमूने में rRNA संकरण और संकर streptavidin लिपटे मोतियों के साथ कब्जा करने से हटा रहे हैं. प्रक्रिया rRNA (4 चित्रा) की सबसे को हटा. चार नमूने हम संसाधित है, rRNA के 90-99% को प्रभावी ढंग से समाप्त हो गया था (3 तालिका). इस प्रक्रिया को आगे कीट से जुड़े microbiome के अध्ययन की एक किस्म के लिए संशोधित किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
यह काम NIH 1SC2GM092789 01A1 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और एमएस हावर्ड NMSU ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूशन अंडर अनुसंधान कार्यक्रम के एक अनुसंधान विद्वान था. वीडियो का निर्देशन किया है और उत्पादन किया गया था और एमी Lanasa द्वारा क्रिएटिव मीडिया संस्थान के साथ NMSU में डॉ. फिलिप लुईस द्वारा समन्वित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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