Summary
En ribosomalt RNA (rRNA) uttømming protokollen ble utviklet for å berike messenger RNA (mRNA) for RNA-seq av mygg gut metatranscriptome. Sample spesifikke rRNA sonder, som ble brukt til å fjerne rRNA via subtraksjon, ble opprettet fra den mygg og dets gut mikrober. Ytelse av protokollen kan resultere i fjerning av ca 90-99% av rRNA.
Abstract
Mygg gut plass dynamiske mikrobielle samfunn på tvers av ulike stadier av insekter livssyklus. Karakterisering av genetisk kapasitet og funksjonalitet av tarmen samfunnet vil gi innsikt i virkningene av gut bakterieflora på mygg liv trekk. Metagenomic RNA-Seq har blitt et viktig verktøy for å analysere transcriptomes fra ulike mikrober til stede i en mikrobiell samfunnet. Messenger RNA omfatter vanligvis bare 1-3% av total RNA, mens rRNA utgjør ca 90%. Det er utfordrende å berike messenger RNA fra en metagenomic mikrobiell RNA prøve fordi de fleste prokaryote mRNA arter mangler stabile poly (A) haler. Dette forhindrer oligo d (T)-mediert mRNA isolasjon. Her beskriver vi en protokoll som sysselsetter prøven stammer rRNA fange sonder for å fjerne rRNA fra en metagenomic total RNA prøve. Til å begynne, er både mygg og mikrobielle små og store subenheten rRNA fragmenter forsterket fra en metagenomic samfunnet DNA-prøve. Deretter kommunikanity spesifikke biotinylerte antisens ribosomale RNA prober syntetisert in vitro med T7 RNA polymerase. De biotinylerte rRNA prober hybridisert til de totale RNA. Hybridene tilfaller streptavidin-belagte perler og fjernet fra den totale RNA. Dette subtraksjon-basert protokoll fjerner effektivt både mygg og mikrobiell rRNA fra total RNA prøven. MRNA beriket prøven videreforedles for RNA forsterkning og RNA-Seq.
Introduction
Neste generasjons sekvensering teknologi har sterkt avanserte metagenomikk studie ved at å vurdere taksonomisk sammensetning og genetisk funksjonaliteten til en mikrobiell samling. RNA-sekvensering (RNA-Seq) 1 kan omgå kultur-baserte metoder for å undersøke mikrobielle metatranscriptomes i ulike sammenhenger 2-5. En hovedhindring for mikrobiell RNA-seq er vanskeligheten i berikende mRNA, som prokaryote mRNA arter ikke blir stabilt polyadenylated. Derfor er oligo d (T)-mediert messenger berikelse ikke aktuelt. Fjerning av rikelig rRNA er en alternativ tilnærming til å berike mRNA. Kommersielle rRNA uttømming kits, eksempel Microexpress Bakteriell mRNA Enrichment kit (Ambion), RiboMinus transkriptom Isolation Kit (Bakterier) (Life Technologies), og mRNA-ONLY prokaryot mRNA Isolation Kit (Epicentre) som fortrinnsvis forringer rRNA med en eksonuklease, har blitt brukt for fjerning rRNA 6-8. Men den fange sonder i Microexpresseller RiboMinus er bra for å fjerne kjente rRNA fra typiske Gram-positive og Gram-negative bakterier (se produsentens spesifikasjoner), men mindre kompatibel med rRNA fra ukjente mikrober. Følgelig kan fjerning være mindre effektiv for metagenomic prøver 8-10. Dessuten var mRNA overflod fidelity tvilsom når eksonuklease behandlingen ble utført 11. Totalt var subtraksjon-baserte rRNA uttømming mindre partisk og mer effektive i mRNA berikelse i metagenomic innstillinger 10-13.
Mygg gut plass en dynamisk mikrobiell fellesskap 14. Vi er interessert i å karakterisere funksjon mygg gut microbiome Ved å bruke RNA-Seq. I en RNA prøve isolert fra mygg guts, både mygg og mikrobielle RNA er tilstede. Her beskriver vi en modifisert protokoll for å bruke samfunnet spesifikke rRNA sonder for å effektivt utarme mygg og mikrobiell rRNA av subtraktiv hybridisering. Den resulterende mRNAberiket prøver som er aktuelle for RNA-Seq. Den generelle arbeidsflyten er avbildet i figur 1..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyre
1. Mygg Rearing
- Bak mygg Anopheles gambiae G3 belastning i en insectary ved 27,5 ° C med 80% luftfuktighet og 12:12 hr syklus av lys / mørke.
- Mate larver med bakken kattemat med ølgjær på forholdet 1:1.
- Mate voksne mygg på mus blod på dag 3 etter fremveksten for eggproduksjon.
2. Mygg Gut Dissection
- Autoclave Disseksjonsverktøyer (lysbilder og tang).
- Samle 50 mygg ved hjelp av en vifte og plassere dem på CO 2 flyt seng (Ultimate Flypad). Skyll en mygg eksemplar sekvensielt i tre petriskåler inneholdende 70% etanol for å rengjøre mygg kroppsoverflaten.
- Plasser prøven på et glass lysbilde under en stereomikroskopi. Fjern tarmen.
- Samle 50 guts per betingelse for metagenomic DNA isolering. Samle 50 guts per betingelse for metagenomic RNA isolering. 3. Metagenomic DNA Isolasjon
- Plasser 50 mygg guts i 300 ul TE. Homogenisere dem i 1 min ved hjelp av Bio-Gen PRO200 homogenisator (PRO Scientific Inc, USA) på hastighet 2000 rpm på is.
- Tilsett 2 pl av Ready-Lyse Lysozym Solution og 1 ul RNase A til cellesuspensjonen. Bland ved virvling og inkuber ved 37 ° C i 30 min.
- Legg 300 pl Meta-Lysis Solution (2x) og 1 ul proteinase K til røret. Bland med virvling. Kort puls-sentrifuger røret for å sikre at all oppløsningen er i bunnen av røret, og inkuber ved 65 ° C i 15 min, avkjøles til romtemperatur, deretter plassere på is i 3-5 min.
- Legg 350 pl MPC Protein Nedbør Reagent til røret og bland ved virvling kraftig i 10 sek.
- Pellet than rusk ved sentrifugering i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til en ren 2-ml rør, og kast pelleten.
- Legg 570 pl isopropanol til supernatanten. Bland ved å snu røret flere ganger.
- Pellet DNA ved sentrifugering i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C. Fjerne isopropanol uten løsner DNA pellet.
- Tilsett 500 ul av 75% etanol for å vaske pelleten. Sentrifuger i 5 minutter på 12000 xg ved 4 ° C. Fjerne etanol uten å forstyrre DNA pelleten. Lufttørke pelleten ved romtemperatur i 2 min. Merk: Ikke over-dry DNA pellet.
- Resuspender DNA pelleten i 50 ul TE-buffer.
- Valider størrelsen på isolerte DNA ved sammenligning til Fosmid kontroll DNA (40 kb; 100 ng / pl) i settet, via gelelektroforese på en 1% agarosegel.
- Sett 50 mygg guts i en 2-ml tube med 500 ul TriPure Isolation Reagens. Homogenisere i 1 min på hastighet 2000 rpm på isen ved hjelp av en homogenisator. La sitte ved RT i 5 min for å tillate dissosiasjon av nucleoprotein komplekser.
- Tilsett 100 ul kloroform og virvle i 12 sek, og la sitte ved RT i 2 min.
- Sentrifuger ved 10.000 xg i 10 min. Nøye ta ut røret uten å forstyrre atskilt faser.
- Overføre vandige fase til et nytt rør, tilsett 250 pl isopropanol, bland godt og satt ved -20 ° C i 20 min.
- Sentrifuger ved 12.000 xg i 10 min ved 4 ° C for å utfelle RNA.
- Kast supernatanten uten løsner pellet. Vask pelleten med 750 pl 75% etanol.
- Pipetter av supernatanten uten å forstyrre pelleten. Air tørke røret i 2 min.
- Resuspender RNA med 30 ul nuklease fritt vann.
- Behandle total RNA med DNase ved 37 ° C i 20 min, og deretter inaktivere DNase ved inkubering ved 75 ° C i 15 min. Utfelle RNA med etanol og resuspender RNA i 30 ul nuklease fritt vann.
- Bestemme mengden av total RNA ved hjelp av en NanoDrop.
- PCR forsterkning av ribosomale RNA genfragmenter
Dette trinnet oppretter sample-spesifikke rRNA bassenger, som vil bli benyttet som maler for in vitro transkripsjon å produsere anti-sense ribosomale RNA (arRNA) sonder som er inkludert for rRNA i total RNA prøven.- Design og syntetisere primer sett for rRNA fragment PCR (Tabell 1).
- Kjøre PCR i 50ul reaksjon bruker Taq DNA-polymerase (Qiagen) med 50 ng DNA-templat, 1 x PCR-buffer, 1,5 mm Mg 2 Cl 0,2 uM primere med 35 sykluser av denaturerende på 94 ° C i 10 sek, annealing 15 sek ved 40 ° C for bakteriell 23S amplikon, og 50 ° C for de andre, og som strekker seg amplikonene ved 72 ° C i 1 min (endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 min).
- Vis PCR produktene på 1% agarosegel.
- Rens PCR produkter ved hjelp av QIAquick PCR rensing kit med eluering i 50 pl elueringsbuffer. Kvantifisere konsentrasjonen ved hjelp av NanoDrop.
- In vitro transkripsjon av biotin-merket anti-sense rRNA prober (arRNA). Merk: I dette trinnet, blir eksempler spesifikke prober fra ulike rRNA amplikonene syntetisert ved hjelp av MEGAscript T7 kit.
- Sette opp en 20 ul reaksjon for hver prøve spesifikk rRNA amplikon ved å blande de nedenfor ingredienser (tabell 2). Inkuber over natten ved 37 ° C.
- Tilsett 1 pl DNase I (inkludert i settet) til reaksjonsblandingen og inkuber ved 37 ° C i 20 min for å fjerne DNA-templat.
- Tilsett 100 pl 100% etanol til reaksjonsblandingen, sentrifuger ved 12 000 xg i 10 min ved 4 ° C for å utfelle syntetisert arRNA. Kast supernatanten og vask pelleten med 750 pl 75% etanol. Resuspender RNA sonder i 50 ul nuklease fritt vann.
- Kvantifisere RNA konsentrasjon ved hjelp av en NanoDrop. Oppbevar prober ved -80 ° C.
- Sette opp en 20 ul reaksjon for hver prøve spesifikk rRNA amplikon ved å blande de nedenfor ingredienser (tabell 2). Inkuber over natten ved 37 ° C.
- rRNA subtraksjon med biotinylert arRNA. Merk: Dette trinnet benytter biotinylerte arRNA å hybridisere til rRNA i total RNA prøven. De rRNA-arRNA hybrider er fanget av streptavidin-belagte magnetiske kuler. Prosedyren er basert på protokollen beskrevet i referanseeksempel 13 med mindre modifikasjoner.
- Reagenser
- Forbered 0,1 N NaOH, 20X natrium kloride-citrat (SSC) og 1 x SSC med 20% formamid.
- Hybridisering
- Bland 1 ug total RNA med bakterielle 16S og 23S sonder (0,75 ug hver), mygg 18S og 28S sonder (0,75 ug hver), 1 pl RNase inhibitor, 2,5 pl 20X SSC buffer, 10 pl 100% formamid i en 200 pl PCR rør , add nuklease-fritt vann til 50 ul.
- Plasser reaksjonsrøret i en termosykler og inkuber ved 70 ° C i 5 minutter til å åpne sekundære struktur og rampen ned til 25 ° C ved hjelp av 5 ° C-trinn i 1 min hver ° C for å tillate hybridisering av rRNA og arRNA prober.
- Fjerning av rRNA
- Overfør 300 ul streptavidin belagt perler i en 1,7 ml tube. Plasser røret på en magnetisk Skillegitter å immobilisere perlene. Fjern supernatant. Resuspender perlene i 300 ul 0,1 N NaOH og mix godt. Plasser røret tilbake til det magnetiske rack og pipetteres av supernatanten. Resuspender perlene i 300 ul 1X SSC, bland godt, immobilisere kulene og pipetteres av supernatanten. Gjenta vask med 300 ul 1X SSC en gang til.
- Lag 3 alikvoter av perler, 100 ul hver, i 1,7 ml rør. Plasser røret på den magnetiske rack, og fjern supernatanten med pipettering. Merk: alikvoter av perlene er brukt i 3 runder med å fange biotinylerte rRNA-arRNA hybrider.
- Tilsett 50 pl 1X SSC med 20% formamid i 50 ul hybridiseringsreaksjon. Overfør reaksjonsblandingen inn i den første vulsten delmengde tube, og bland godt. Inkuber ved RT i 10 min for å tillate de biotinylerte probe-rRNA hybrider å bli fanget av streptavidin perler. Flick røret hver 2 minutter for å blande under inkubering.
- Plasser røret på magnetiske stativet å immobilisere perlene, overføre supernatanten til den andre aliqUOT av perler, bland godt og inkuber som ovenfor. Gjennomføre den tredje fangst ved å overføre supernatant i den tredje tube perler. Bland og inkuber.
- Overføre ikke-rRNA supernatant til et nytt rør og atferd rensing ved hjelp RNeasy MinElute kit for å fjerne formamid etter produsentens manual.
- Sjekk rRNA uttømming effektivitet ved hjelp en Agilent RNA 6000 Pico chip kit på en Bioanalyzer (Figur 4).
- Reagenser
Merk: Metagenomic DNA isoleres ved hjelp av meta-G-Nome DNA Isolation Kit (Epicentre Bioteknologi) med modifikasjonen beskrevet nedenfor.
4. Total RNA Isolation
Merk: Rengjør arbeidsområdemed RNaseZap å minimere RNase forurensning. Metagenomic RNA ble isolert fra mygg gut prøver ved hjelp TriPure Isolation Reagent (Roche) med en mindre modifikasjon.
5. Ribosomal RNA Nedbryting
Merk: Protokollen ble utviklet basert på tidligere beskrevet metoder 12,13,15.
Merk: rRNA utarmet RNA prøvene er underlagt mRNA forsterkning om nødvendig 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen inneholder tre deler: (1) utarbeidelse av metagenomic DNA maler for rRNA PCR, (2) etableringen av prøven spesifikke fange rRNA sonder, (3) reduksjon av rRNA fra total RNA fra subtraktiv hybridisering. Isolering av høykvalitets metagenomic DNA og RNA er essensielt for hele prosessen. Den modifiserte Meta-G-Nome DNA isolering protokollen gir høykvalitets metagenomic DNA fra mygg innvoller, som vist i figur 2. Det kan være utfordrende å isolere høy kvalitet total RNA fra mygg guts. Dette er sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av ulike enzymer, inkludert RNase, i mygg guts. Vi sammenlignet den totale RNA utvinning ytelsen Qiagen RNA isolering kit til Roche TriPure. Electropherogram av Agilent Bioanalyzer analyse viste at de totale RNA isolert med TriPure inneholder klare rRNA toppene (figur 3), som ikke er sett i RNA innhentet ved hjelp av Qiagen kit. Kanskje mygg-avledet RNase er inaktivere effektivtd ved fenol i TriPure. Vanligvis, 50 mygg guts utbytte ~ 20 pg total RNA. Den ideelle mengden av total RNA inngang for gjeldende rRNA uttømming prosessen er ~ 1 pg, som optimaliserer effektiviteten av rRNA subtraksjon og utbytter ~ 150 ng renset RNA. Fig. 4 viser sammenligning av RNA electropherograms før og etter rRNA subtraksjon. RRNA var effektivt fjernet mens de ikke-rRNA arter ble sterkt anriket i de gjenværende RNA. Tilstedeværelsen av store størrelsen RNA (> 2000 bp) indikerer en god kvalitet av anriket mRNA (figur 4B). Protokollen kan skaleres opp til å betjene en større inngang av RNA for behandling. Vanligvis 5 ug RNA nødvendig for RNA-seq prosess. Derfor brukte vi MessageAmp II-Bakterier RNA Amplification Kit til å generere en tilstrekkelig mengde av rRNA utarmet RNA for RNA-Seq. Vi anbefaler å bruke 150 ng eller mer renset RNA for RNA forsterkning for å sikre kvaliteten til forsterkning. Denne protokollen har vært ApplIED til en mygg gut RNA-Seq prosjektet. RRNA uttømming ble effektivt oppnås ved hjelp av sample avledet capture sonder. Tabell 3 lister andelen rRNA leser i RNA-Seq utgang av fire prøver. To sukker-matet og to blod-matet gut prøvene ble behandlet for tømming og RNA-Seq. Den Illumina sekvensering generert 23-24M leser for hver prøve. RRNA subtraksjon effektivt fjernet 90-99% rRNA fra både mygg vev og mikrober i tarmen prøvene. Nedbryting var nesten ferdig i sukker-matet gut prøver, og 6.12 til 10.98% rRNA forble i blodet-matet prøver (Tabell 3).
| Fragment | Forover 5'-3 ' | Revers 5'-3 ' |
| Bakterielle 16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| Bakterielle 23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| Mosquito 18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGG CAAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| Mosquito 28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
Tabell 1. Primer sett for rRNA fragment forsterkning Bakterielle 16S og 23 primere er designet basert på 20,19. T7 promoter sekvenser er i fet skrift.
| 2 ul | |
| PCR-produkter (0,5-1 mg) | 1,5 pl |
| ATP (75mm) | 2 ul |
| GTP (75mm) | 2 ul |
| CTP (75mm) | 1,5 pl |
| UTP (75mm) | 1,5 pl |
| Biotin-11-CTP (10mm) | 3,75 ul |
| Biotin-16-UTP (10 mM) | 3,75 ul |
| T7 RNA polymerase | 2 ul |
Tabell 2. Komponenter av in vitro syntese av rRNA sonder.
| Eksempel | Total leser | Mosquito rRNAleser (%) | Mikrobielle 16S leser (%) | Mikrobiell 23S leser (%) | Totalt% av rRNA lesninger * |
| SM1 | 24341850 | 121,987 (0.50) | 3,717 (0.02) | 6,810 (0.03) | 0,54 |
| SM2 | 23487202 | 114,430 (0.49) | 30,271 (0.13) | 38,261 (0.16) | 0,78 |
| BM1 | 23438304 | 265,433 (1.13) | 2.054.777 (8,77) | 253,051 (1.08) | 10.98 |
| BM2 | 24212240 | 110,240 (0.46) | 1,186,423 (4.90) | 185,074 (0.76) | 6,12 |
Tabell 3. Statistics av rRNA leser i RNA-seq utgang. SM: sukker matet gut, BM: blod matet gut. *: Summen av prosenter av mygg rRNA og mikrobiell rRNA leser.
Figur 1. Flytdiagram som viser de prosedyresteg av metagenomic DNA og RNA isolering, rRNA fangst probe syntese, hybridisering og fange perler baserte trykkavlastning.
Figur 2. Metagenomic DNA isolering. DNA prøver ble separert på 1% agarosegel. 1, Fosmid DNA (40KB), 2, Mosquito gut metagenomic DNA.
Figur 3.Sammenligning av to totale RNA isolering reagenser for deres effektivitet i å trekke ut en kvalitet RNA fra mygg gut. Overlegg av electropherograms viser at total RNA fra TriPure isolasjon (i blått) hadde rRNA topper og bred RNA distribusjon, mens det fra Qiagen isolasjon (i rødt) hadde ingen klare rRNA topper.
Figur 4. Effektivitet av rRNA uttømming. Electropherograms viser det samlede RNA før (A) og etter (B) rRNA trykkavlastning. RRNA topper ble effektivt fjernet. RNA større enn 4KB forblir i rRNA utladet prøve. RNA-konsentrasjonen var 107,6 ng / ul i (A) og 8,6 ng / ul i (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kompleks mikrobiell samfunnet ligger i myggen gut økosystemet 14,16,17. Metatranscriptomic sekvensering (RNA-seq) kan avsløre kontekstavhengig funksjonell informasjon ved avhør hele mikrobielle transkriptom 4,18. Teknisk sett er oligo-d (T)-mediert anrikning av prokaryot mRNA ikke anvendelig på grunn av fravær av stabile poly (A) haler av budbringere. Alternativt har rRNA uttømming blitt brukt for mRNA berikelse. Her har vi utviklet et subtraksjon-basert protokoll for å utarme rRNA hjelp rRNA sonder laget av egen metagenomic DNA i mygg gut mikrobiell samfunnet. Effektiviteten av rRNA fjerning avhenger av dekningen av rRNA fangst sonder som er generert av rRNA PCR. Annealing effektiviteten av ulike primer setter rettet bevarte områder varierer på tvers av ulike taxa 19. Derfor anbefaler vi at du prøver ulike kombinasjoner av primere på metagenomic prøver, og deretter samle denrRNA produkter for å maksimere dekningen. I prosedyren vår, skaper vi fange prober ved å kombinere rRNA PCR produktene av to foran og to revers primere, som kan danne fire kombinasjoner av primer sett (tabell 1). I tillegg, har til hensikt rRNA til danne en sekundær struktur. Sammenlignet med full lengde rRNA som prober 13, mindre rRNA fragmenter har en lavere tendens til å danne sekundære struktur, noe som kan forenkle hybridisering av fangst prober til prøven rRNA. De biotinylerte prober effektivt hybridisere til rRNA i total RNA prøven og hybridene fjernes ved å fange med streptavidin belagte perler. Prosedyren fjerner det meste av rRNA (figur 4). I de fire prøvene vi har behandlet, ble 90-99% av rRNA effektivt utarmet (Tabell 3). Denne prosedyren kan bli ytterligere modifisert for en rekke insekt-assosierte microbiome studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend 1SC2GM092789-01A1, og MS var en stipendiat av NMSU Howard Hughes Medical Institution Undergraduate forskningsprogrammer. Videoen ble regissert og produsert av Amy Lanasa og koordinert av Dr. Philip Lewis med Creative Media Institute ved NMSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
