Summary
Anaplastic थायराइड कार्सिनोमा के एक orthotopic माउस मॉडल की पीढ़ी यहाँ वर्णित है. इस तकनीक को इस प्रकार रोग प्रगति के साथ ही स्क्रीन नवीन उपचारात्मक उपायों का अध्ययन करने के लिए एक अधिक नैदानिक प्रासंगिक सेटिंग बनाने, immunodeficient चूहों की थायराइड में मानव anaplastic थायराइड कैंसर कोशिकाओं की शल्य नियुक्ति कार्यरत हैं.
Protocol
1. सेल तैयार
नोट:, 2) जगह Matrigel 1) पूर्ण 1640 RPMI आधारित संस्कृति मीडिया नुस्खा (500 मिलीलीटर) 435 मिलीलीटर 1640 RPMI, 50 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय FBS, 5 मिलीलीटर गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 5 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट, 5 मिलीग्राम एंटीबायोटिक कवकनाशी शामिल 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल फसल से पहले एक दिन.
- मानव एटीसी सेल लाइन THJ-11T 8 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में वृद्धि हुई है और 80-90% मिला हुआ एक बार काटा जाता है.
- कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
- 1640 RPMI मीडिया [2 मिलीग्राम / 6 अच्छी तरह से थाली] में मीडिया और resuspend कोशिकाओं महाप्राण.
- 0.4% trypan नीले डाई की एक मात्रा में जोड़ने और TC10 स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करते हुए सेल घनत्व निर्धारण, सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा लें.
- इंजेक्शन लगाने के 5 x 10 5 कोशिकाओं / माउस बार संख्या चूहों से प्राप्त की जरूरत सेल निलंबन की मात्रा की गणना.
नोट: विज्ञापन सुनिश्चित करने के लिए आप चूहों की डबल संख्या (उदाहरण के लिए 5 चूहों को इंजेक्शन अगर आप 10 चूहों को इंजेक्शन थे, तो सेल निलंबन तैयार) इंजेक्शन हैं यद्यपि के रूप में इंजेक्शन के लिए सेल निलंबन समानता, कोशिकाओं को तैयार करते हैं.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन की जरूरत मात्रा स्थानांतरण.
- कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
- पूर्ण 1640 RPMI मीडिया में मीडिया और resuspend कोशिकाओं महाप्राण.
- एक 1.6 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण, Matrigel की 1 मात्रा जोड़ने और धीरे धीरे में pipetting और बाहर से धीरे मिश्रण.
नोट: प्रत्येक माउस सेल निलंबन / Matrigel कॉकटेल के 10 μl प्राप्त होगा. एक 10 μl इंजेक्शन मात्रा में निलंबित 5 x 10 5 कोशिकाओं सफलतापूर्वक पिछले एटीसी orthotopic पढ़ाई 9-10 में इस्तेमाल किया गया है के बाद से, हम इस रिपोर्ट में उन मानकों का इस्तेमाल किया.
- उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें.
- 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों पोंछते द्वारा विदारक गुंजाइश और आसपास के क्षेत्र भी शामिल है, जो शल्य चिकित्सा क्षेत्र, साफ करें.
- जानवरों सर्जरी से ठीक किया जाएगा, जहां हीटिंग लैंप / पैड पर मुड़ें.
- एक 1 मिलीलीटर, 27G साढ़े "ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज का उपयोग कर 10 ग्राम शरीर के वजन intraperitoneally के प्रति 0.1 मिलीग्राम ketamine / xylazine (ketamine 9 मिलीग्राम / एमएल और xylazine 1mg/ml से मिलकर दवा कॉकटेल) प्रशासन.
- सर्जरी के लिए तैयारी माउस: 1) betadine लथपथ धुंध, 4 के साथ किया अंतिम रगडें) chorhexadine लथपथ धुंध वर्गों, 3 के साथ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में तीन बार हाथ धोने माउस की गर्दन क्षेत्र (जबड़े की रेखा से उरोस्थि और हथियारों के लिए बाहर के शीर्ष करने के लिए), 2) दाढ़ी ) धीरे सूखने से आंखों को रोकने के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं.
- माउस पर्याप्त रूप से बेहोश है यह सुनिश्चित करने के लिए पलटा पेडल की जाँच करें.
- विदारक गुंजाइश के तहत एक डिस्पोजेबल बाँझ क्षेत्र बैरियर पर पृष्ठीय लेटना में पशु रखें और कपड़ा टेप के साथ जगह में जानवर सुरक्षित.
- Scrubs हाथ और चingernails तो बाँझ सर्जिकल दस्ताने पर डाल दिया.
- एक बाँझ फैशन में, खुले सर्जरी पैक और उपकरणों की व्यवस्था.
- केवल शल्य साइट अवगत कराया जा, जानवर से अधिक बाँझ कपड़ा रखें.
3. थायराइड और सेल इंजेक्शन के लिए शल्य चिकित्सा का उपयोग
- एक बाँझ, डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग करना, गले के midline के साथ एक 1 से 1.5 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा बनाते हैं.
नोट: midline से विचलन श्वासनली का उपयोग करने में गहरी काटने पेचीदा हो. काफी सटीक midline चीरा आप एक साथ छोड़ दिया और सही लार ग्रंथियों पकड़े झिल्लीदार ऊतक के माध्यम से तंग और कटौती करने की अनुमति देता है और बड़ी धमनियों nicking या विच्छेद का मौका कम कर देता है.
- ट्रेकिआ आसपास पट्टा की मांसपेशियों में एक दूसरे चीरा तो सही थायरॉयड ग्रंथि का पर्दाफाश करने के पक्ष को छिन्न पेशी के दाईं ओर खींच.
- Hemostats एक मांसपेशी परत धारण करने के लिए इस बिंदु पर इस्तेमाल किया जा सकता हैथायरॉयड ग्रंथि के लिए आसान पहुँच (चित्रा 1) के लिए भाग.
नोट: प्रक्रिया दो शल्य चिकित्सा कर्मचारियों द्वारा प्रदर्शन किया तो एक तैयार इंजेक्शन सिरिंज की सहायता कर्मचारियों द्वारा सर्जन को सौंप दिया है, जबकि वैकल्पिक रूप से, मांसपेशियों की परत बस संदंश के साथ वापस आयोजित किया जा सकता है.
- धीरे धीरे फिर धीरे से सुई को निकालने के एक 31G 5/16 "इंसुलिन सिरिंज का उपयोग सही थायरॉयड ग्रंथि में सेल निलंबन के 10 μl इंजेक्षन.
4. सर्जिकल साइट और माउस रिकवरी की क्लोजर
- या तो एक सतत या बाधित suturing शैली का उपयोग 6.0 suturing सामग्री के साथ सिवनी मांसपेशी परत.
- एक ही फैशन में सिलाई त्वचा.
- सीधे चीरा साइट पर ट्रिपल एंटीबायोटिक मलहम की एक परत लागू करें.
- गर्म हीटिंग पैड पर पृष्ठीय लेटना में ठीक करने के लिए जानवर की अनुमति दें. जानवरों की सहायता के बिना sternal अवलंबन प्राप्त कर सकते हैं एक बार, यह अन्य चूहों के साथ वापस रखा जा सकता है.
- सर्जरी के बाद एक सप्ताह के लिए दैनिक चीरा साइट और जानवर के समग्र स्वास्थ्य की जाँच करें, तो एक सप्ताह में एक बार की जाँच करें. टांके 14 दिनों के बाद अभी भी बरकरार हैं, तो उन्हें हटा दिया जाता है.
नोट: स्वास्थ्य में गिरावट (जैसे पर्याप्त वजन घटाने, मैला - कुचैला बाल, कृत्रिम श्वास) के लक्षण प्रदर्शित पशु euthanized किया जाना चाहिए और ऊतकों एकत्र.
- एक बार चूहों xylazine / ketamine शांत करने के लिए ऊपर का वर्णन के रूप में प्रशासन, एक पूर्व निर्धारित पोस्ट ऑपरेटिव समय बिंदु पर पहुंच गया है.
- Intracardially पशु छिड़कना और फसल थायराइड / ट्रेकिआ और हित के अन्य ऊतकों (यहाँ विस्तार से वर्णित नहीं).
Representative Results
हम 4 सप्ताह के बाद एटीसी कोशिकाओं को इंजेक्शन के साथ 20 चूहों की कुल से 19 आक्रामक थायराइड ट्यूमर का पता चला. चित्रा 2A में दिखाए गए उदाहरण में, संलग्न शर्तों के अधीन हो 5x10 5 एटीसी कोशिकाओं के एक orthotopic इंजेक्शन प्राप्त चूहों, 4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन द्वारा थायराइड में कैंसर कोशिकाओं के महत्वपूर्ण घुसपैठ दिखा रहे हैं. इओसिनोफिलिक cytoplasm और बड़े नाभिक के साथ एक विशेषता spindled कोशिकाओं और मध्यम से विशाल आकार की कोशिकाओं के साथ हमलावर एटीसी कोशिकाओं की प्रकृति hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला द्वारा सत्यापित किया गया था. तुलना के लिए, एक गैर इंजेक्शन नियंत्रण पशु से थायराइड और श्वासनली चित्रा 2B में दिखाया गया है. Uninjected पशु के रोम के एक करीबी, अभी तक ढीला, संघ को प्रदर्शित करने और अनिवार्य रूप से एक दौर आकारिकी है.
इंजेक्शन प्रसव के थायराइड और उपयोग में छोटे आकार के कारण, बिना किसी खास उद्देश्य के परिणामों में उत्पन्न हो सकती है. चित्रा 3 दिखाता हैसबसे अधिक मनाया, जिसमें से बाहर एक ट्यूमर जन का विकास है, लेकिन, थायराइड को शामिल नहीं. कोशिकाओं को निष्कासित कर दिया गया है जब यह माध्यम से और थायराइड परे सुई प्रवेश करने की संभावना से भी अधिक होने के कारण है. चित्रा 3 बी में दिखाया के रूप में कभी कभी, कोई ट्यूमर के विकास के साथ पेश चूहों, दोनों निहायत और Histologically, पता चला रहे हैं. पता लगाने योग्य ट्यूमर के विकास के अभाव पड़ोसी ऊतकों और cavities में इंजेक्शन साइट और प्रसार से सेल निलंबन के निष्कासन की वजह से हो सकता है.
चित्रा 1. थायराइड उजागर. लेबल श्वासनली flanking दाएं और बाएं थायरॉयड ग्रंथि का संकेत मिलता है.
चित्रा 2. ट्यूमर के विकास की और में ऊतकीय परीक्षासफल थायराइड इंजेक्शन के बाद vasion. ऊतक नमूनों राज्याभिषेक विमान के साथ sectioned थे. इओसिनोफिलिक cytoplasm और hematoxylin और eosin में बड़े नाभिक (साथ विशेषता spindled कोशिकाओं और मध्यम से विशाल आकार की कोशिकाओं के साथ पर्याप्त ट्यूमर के विकास का प्रदर्शन माउस का 200X पर लिया ए) छवि एच एंड ई) दाग तू ट्यूमर कोशिकाओं थायराइड आक्रमण, जहां से प्राथमिक घाव इंगित करता है बी) ट्रेकिआ और नियंत्रण पशु से थायराइड (100X पर लिया छवि) मं, ट्यूमर,... एस, चिकनी पेशी, टोबैगो, श्वासनली, तेरा, थायरॉयड ग्रंथि.
चित्रा 3. Orthotopic इंजेक्शन के बिना किसी खास उद्देश्य के परिणामों. ऊतक नमूनों राज्याभिषेक विमान के साथ sectioned थे. ए) परिधीय ट्यूमर के विकास thyroi में स्पष्ट नहीं वृद्धि के साथघ (काला तीर, 100X पर लिया छवि). बी) सकल पर ट्यूमर का पता लगाने की कमी () नहीं दिखाया या ऊतकीय परीक्षा (50X में लिया छवि). तेरा, थायरॉयड ग्रंथि.
Discussion
हमारे मॉडल में, जानवरों के 4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन द्वारा कैचेक्सिया और श्वसन संकट संबंधित थायराइड ट्यूमर मेटास्टेसिस और रोग का प्रदर्शन किया. अधिकांश अन्य orthotopic मॉडल लक्ष्य से परे फैलता है कि आसपास के ऊतकों और बाद इंजेक्शन रिसाव में एक सेल निलंबन के इंजेक्शन वितरण, इंजेक्शन के उपयोग के साथ के रूप में संभव हो रहे हैं. कि कहा जा रहा है, इस प्रक्रिया द्वारा उत्पादित एक पहचानने योग्य संभावित अज्ञात गैर रोग संबंधित मेटास्टेसिस या जटिलताओं को दूर लक्ष्य जोखिम के प्रभाव है. यह भले ही रोग जांच की जा रही है, सबसे Xenographic प्रत्यारोपण के साथ एक आम चिंता का विषय है. बहरहाल, मेटास्टेसिस से अनजाने में परिणाम काफी फिट थायरॉयड ग्रंथि overlaying झिल्ली प्रवेश कर गया है सुई की नोक के पूरे उठाव सुनिश्चित करने और धीरे धीरे सेलुलर निलंबन को खदेड़ने के द्वारा कम किया जा सकता है. रिसाव इंजेक्शन के दौरान या बाद में मनाया जाता है, उन जानवरों के अध्ययन से हटाया जा सकता है.
इस रिपोर्ट में हम एटीसी कोशिकाओं की orthotopic इंजेक्शन के बाद उन्नत थायराइड ट्यूमर के स्थानीय विकास और आक्रमण का वर्णन है. एटीसी मेटास्टेसिस ऐसे hematoxylin और eosin के रूप में मानक ऊतकीय दाग, का उपयोग अन्य ऊतकों के ऊतकीय तैयारियों का विश्लेषण करके, या immunohistochemistry सेल या विकृति प्रासंगिक मार्कर का उपयोग करके जांच की जा सकती है. इस प्रणाली के आगे जी द्वारा विकसित किया जा सकता हैरहते इमेजिंग मेटास्टेसिस और चिकित्सीय उपचार के प्रभाव पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि enetically प्रतिदीप्ति पत्रकारों के साथ थायराइड कैंसर की कोशिकाओं को संशोधित.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों डीआरएस को धन्यवाद देना चाहूंगा. सर्जरी के प्रशिक्षण में उनकी सहायता के लिए वेंजुन ली और डैनियल Kreisel (सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के मेडिसिन स्कूल). RYL स्वास्थ्य अनुदान R01 DK068057 के राष्ट्रीय संस्थान और सेंट लुइस विश्वविद्यालय के अध्यक्ष के रिसर्च फंड द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
