Summary
Generazione di un modello ortotopico murino di carcinoma anaplastico della tiroide è descritto qui. Questa tecnica impiega posizionamento chirurgico di cellule di cancro della tiroide anaplastico umani nella tiroide di topi immunodeficienti, creando così un ambiente più clinicamente rilevante per studiare la progressione della malattia, così come schermo interventi terapeutici innovativi.
Abstract
Sono stati creati vari tipi di modelli animali di tumori tiroidei umani, anche per via sottocutanea xenotrapianto e l'impianto ortotopico di cellule di cancro in topi immunodeficienti. Modelli sottocutaneo xenotrapianto è stato prezioso per lo screening e la valutazione di nuovi trattamenti terapeutici preclinico. Ci sono una serie di vantaggi di utilizzare un modello sottocutanea; 1) rapido, 2) riproducibile, e 3) stabilimento tumore, la crescita, e la risposta ad agenti terapeutici possono essere monitorate mediante ispezione visiva. Tuttavia, la prova consistente ha messo in luce le carenze del sottocutaneo modelli di xenotrapianto 1-3. Per esempio, i trattamenti medicinali che dimostrano proprietà curative in modelli di xenotrapianto sottocutaneo spesso non hanno alcun impatto notevole sulla malattia umana. Il microambiente del sito del trapianto xenographic o iniezione è al centro di questa dissomiglianza.
Ortotopici modelli di xenotrapianto di tumore forniscono una più Biolosicologicamente contesto rilevante in cui studiare la malattia. I vantaggi di impiantare le cellule malate o tessuti nel loro origine anatomica equivalente all'interno di un animale ospite comprende un sito adatto per le interazioni tumore-ospite, lo sviluppo di metastasi correlati alla malattia e la capacità di esaminare l'influenza site-specific sui rimedi terapeutici in fase di sperimentazione. Pertanto, modelli di xenotrapianto ortotopici harbor valore molto più clinico, perché strettamente riproducono la malattia umana. Per questi motivi, alcuni gruppi hanno sfruttato un modello di cancro della tiroide ortotopico come strumento di ricerca 4-7.
Qui, descriviamo un approccio che stabilisce un modello ortotopico per lo studio di carcinoma tiroideo anaplastico (ATC), che è altamente invasiva, resiste trattamento, ed è praticamente fatale in tutti i pazienti diagnosticati. ATC cellule in coltura sono preparati come sospensione cellulare dissociato in una soluzione contenente una matrice membrana basale. Un piccolo volume è lentamente injette in destra ghiandola tiroidea. Aspetto generale e la salute dei topi sono monitorati per assicurare minime complicanze post-operatorie e per valutare penetranza patologico del cancro. I topi vengono sacrificati a 4 settimane, ed il tessuto sono raccolti per l'analisi istologica. Gli animali possono essere prese al più tardi punti temporali di esaminare più da progressione avanzata della malattia. La produzione di questo modello ortotopico del mouse stabilisce una piattaforma che realizza due obiettivi: 1) ulteriormente la nostra comprensione di ATC patologia, e 2) dello schermo attuali e futuri agenti terapeutici per l'efficacia nella lotta contro l'ATC.
Protocol
1. Preparazione delle cellule
Note: 1) completo RPMI 1640 basata ricetta supporti cultura (500 ml) comprende 435 ml di RPMI 1640, 50 ml di FBS inattivato al calore, 5 ml aminoacidi non essenziali, 5 ml di piruvato di sodio, 5 ml di antibiotico-antimicotico; 2) posto matrigel a 4 ° C un giorno prima della raccolta delle cellule.
- Linea cellulare umana THJ ATC-11T 8 sono coltivati in 6 piastre di coltura e una volta raccolte e 80-90% confluenti.
- Cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare media e risospendere le cellule in RPMI 1640 supporti [2 ml / 6 pozzetti].
- Prendete un piccolo volume di sospensione cellulare, aggiungerlo a un volume di 0,4% tripano colorante blu e determinare la densità delle cellule utilizzando TC10 Automated Cella contatore.
- Calcolare il volume di sospensione cellulare necessaria per ottenere 5 x 10 5 cellule / topo volte il numero topi iniezione.
Nota: Per garantire annuncio equiparare sospensione cellulare iniettabile, preparare le cellule come se si inietta il doppio del numero di topi (ad esempio, se l'iniezione di 5 topi, quindi preparare sospensione cellulare come se si stesse iniettando 10 topi).
- Trasferire volume necessario di sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
- Cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare media e risospendere le cellule in RPMI 1640 supporti completi.
- Trasferire le cellule in una provetta da 1,6 ml, aggiungere 1 volume di matrigel e mescolare delicatamente con pipetta lentamente dentro e fuori.
Nota: ogni topo riceverà 10 ml di sospensione / matrigel cocktail cella. Dal 5 x 10 5 cellule sospese in un ml di volume iniettabile 10 sono stati utilizzati con successo in precedenti studi ATC ortotopici 9-10, abbiamo utilizzato i parametri in questo rapporto.
- Posizionare sospensione cellulare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Pulire la zona chirurgica, che include l'ambito dissezione e dintorni, strofinando tutte le superfici con il 70% di etanolo.
- Accendere lampade di riscaldamento / pad in cui gli animali saranno sottoposti a chirurgia.
- Somministrare 0,1 ml di ketamina / xylazina (cocktail di farmaci, comprendente ketamina 9 mg / ml e xylazina 1mg/ml) per 10 g di peso corporeo per via intraperitoneale con un 1 ml, 27G ½ "tubercolina siringa.
- Prep del mouse per la chirurgia: 1) la barba regione del collo del topo (dalla linea della mascella per cima dello sterno e fuori a braccia), 2) scrub area chirurgica tre volte con chorhexadine imbevuti quadrati di garza, 3) scrub finale fatto con betadine garza imbevuta, 4 ) applicare delicatamente pomate oftalmiche per evitare idratazione degli occhi.
- Controllare pedale riflesso per garantire il mouse sia adeguatamente sedato.
- Mettere animale in decubito dorsale su una barriera monouso campo sterile nell'ambito di applicazione dissezione e fissare l'animale in posizione con nastro di stoffa.
- Scrubs mani ed fingernails poi mettere su guanti chirurgici sterili.
- In modo sterile, chirurgia aperta imballare e organizzare strumenti.
- Posizionare telino sterile su animali, lasciando solo sito chirurgico esposto.
3. Chirurgico accesso al Tiroide e Cell iniezione
- Usando una sterile, monouso bisturi, fare un 1 a 1,5 centimetri incisione longitudinale lungo la linea mediana della gola.
Nota: La deviazione dalla linea mediana complica profondo taglio per accedere alla trachea. Abbastanza precisa incisione mediana permette di prendere in giro e tagliare il tessuto membranoso tenendo ghiandole salivari sinistro e destro insieme e riduce il rischio di intaccare o troncare grandi arterie.
- Eseguire una seconda incisione in muscoli cinghia circondano la trachea poi tirare il lato destro del muscolo incisa a lato per esporre destra ghiandola tiroidea.
- Hemostats possono essere usati a questo punto per trattenere lo strato muscolare unaparte per un facile accesso alla ghiandola tiroidea (Figura 1).
Nota: In alternativa, se procedura eseguita da due staff chirurgico, lo strato muscolare può essere semplicemente trattenuto con una pinza mentre una siringa iniettabile pronta viene consegnato al chirurgo da parte del personale di assistenza.
- Iniettare lentamente 10 ml di sospensione cellulare in destra ghiandola tiroidea utilizzando un 31G 5/16 "siringa insulina quindi rimuovere delicatamente ago.
4. Chiusura del sito chirurgico e di recupero del mouse
- Strato muscolare sutura con 6.0 materiale di sutura utilizzando uno stile di sutura continuo o interrotto.
- Stitch la pelle nello stesso modo.
- Applicare uno strato di triplo pomata antibiotica direttamente sul sito di incisione.
- Consentire all'animale di riprendersi in decubito dorsale sul caldo piastra elettrica. Una volta che animale può raggiungere decubito sternale senza assistenza, può essere riposto con altri topi.
- Controllare il sito di incisione e la salute generale dell'animale al giorno per una settimana dopo l'intervento, quindi controllare una volta alla settimana. Se i punti di sutura sono ancora intatti dopo 14 giorni, vengono rimossi.
Nota: Gli animali che presentano segni di declino della salute (ad esempio, la perdita di peso notevole, capelli arruffati, respiro affannoso) devono essere eutanasia e tessuti raccolti.
- Una volta che i topi hanno raggiunto un predeterminato post-operatorio time-point, amministrare ketamina / xylazina come descritto sopra per sedare.
- Perfusione intracardiaca animali e il raccolto della tiroide / trachea e altri tessuti di interesse (non descritto in dettaglio qui).
Representative Results
Abbiamo rilevato 19 tumori della tiroide invasivi da un totale di 20 topi iniettati con le cellule ATC dopo 4 settimane. Nell'esempio mostrato in Figura 2A, i topi ricevono una iniezione ortotopico di 5X10 5 celle ATC cresciute in condizioni allegate, mostrano significativa infiltrazione di cellule tumorali nella tiroide dopo 4 settimane dopo l'iniezione. La natura degli invasori cellule ATC con un caratteristico cellule affusolato e cellule medio-gigante-dimensioni con citoplasma eosinofilo e grandi nuclei è stata verificata mediante ematossilina ed eosina (H & E) colorazione. Per confronto, la tiroide e trachea da un animale di controllo non per iniezione è mostrata in Figura 2B. I follicoli dell'animale uninjected visualizzare un vicino, eppure sciolto, di associazione e hanno essenzialmente una morfologia rotonda.
A causa delle piccole dimensioni della tiroide e utilizzo di consegna iniettabili, possono sorgere esiti non intenzionali. Figura 3A illustra lapiù comunemente osservata, che è lo sviluppo di una massa tumorale al di fuori di, ma non comprende, la tiroide. Questo è più che probabile causa di penetrazione dell'ago attraverso e oltre la tiroide quando le cellule vengono espulsi. Occasionalmente, i topi presentavano alcuna crescita tumorale, sia grossolanamente e istologicamente, vengono rilevati come mostrato in figura 3B. Assenza di sviluppo del tumore rilevabile può essere causato da espulsione della sospensione cellulare dal sito di iniezione e la diffusione nei tessuti circostanti e cavità.
Figura 1. Esponendo la tiroide. Etichette indicano destra e sinistra tiroide fiancheggianti la trachea.
Figura 2. Esame istologico di crescita tumorale e nellaI campioni di tessuto vasion dopo l'iniezione della tiroide successo. stati sezionati lungo il piano coronale. A) Immagine scattata a 200X di topo esibendo la crescita tumorale sostanziale con le cellule caratteristici affusolato e cellule medio-gigante-dimensioni con citoplasma eosinofilo e grandi nuclei in ematossilina ed eosina ( H & E) macchiano Tu indica la lesione primaria da cui le cellule tumorali invadono la tiroide B) trachea e tiroide da animali di controllo (immagine presa a 100X) Tu, tumori,... S, muscolo liscio, Tr, trachea, venga il tuo, la ghiandola tiroidea.
Figura 3. Esiti non intenzionali di iniezione ortotopico. Campioni di tessuto sono stati sezionati lungo il piano coronale. A) la crescita del tumore periferico senza crescita evidente nel thyroid. B) Mancanza di individuazione del tumore al momento lordo (non mostrato) o istologici esame (freccia nera, immagine scattata a 100X) (immagine presa a 50X). Thy, ghiandola tiroidea.
Discussion
Nel nostro modello, gli animali hanno dimostrato tiroide metastasi tumorali e malattia legate distress respiratorio cachessia e dopo 4 settimane dopo l'iniezione. Come con la maggior parte degli altri modelli ortotopici utilizzando consegna iniettabile di una sospensione cellulare, l'iniezione nei tessuti circostanti e di dispersione post-iniezione che si diffonde al di là del bersaglio sono possibili. Con questo detto, uno sconosciuto potenziale riconoscibile prodotto da questa procedura è l'effetto di fuori esposizione obiettivo di metastasi non relative malattie o complicazioni. Questo è un problema generale con la maggior parte trapianti xenographic, indipendentemente dalla malattia indagato. Tuttavia, le conseguenze non intenzionali di metastasi possono essere minimizzati in modo significativo, garantendo l'intero smussatura del ago è penetrato la membrana perfettamente sovrapponendo la ghiandola tiroide e lentamente espellendo la sospensione cellulare. Se si osservano perdite durante o dopo l'iniezione, gli animali possono essere omesse dallo studio.
In questo rapporto descriviamo crescita locale e l'invasione di tumore della tiroide avanzato dopo iniezione ortotopico di cellule ATC. ATC metastasi può essere studiato analizzando preparati istologici di altri tessuti utilizzando macchie istologiche standard, come ematossilina ed eosina, o mediante immunoistochimica utilizzando marcatori cellula o patologia pertinenti. Questo sistema può essere ulteriormente sviluppato genetically modificando le cellule del cancro della tiroide con i giornalisti di fluorescenza in modo che l'imaging dal vivo può essere utilizzato per monitorare le metastasi e l'efficacia dei trattamenti terapeutici.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Drs. Wenjun Li e Daniel Kreisel (Washington University School of Medicine di St. Louis) per la loro assistenza nella formazione chirurgia. RYL è supportato dal National Institutes of Health di Grant R01 DK068057 e Fondo di ricerca del Presidente della Saint Louis University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
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