Summary
Generering av en orthotopic mus modell av anaplastic thyroideakarsinom er beskrevet her. Denne teknikken benytter kirurgisk plassering av menneskelige anaplastisk kreft i skjoldbruskkjertelen celler i skjoldbruskkjertelen av immunsvikt mus, og dermed skape en mer klinisk relevant setting for å studere sykdomsutvikling så vel som skjermen innovative terapeutiske intervensjoner.
Abstract
Flere typer dyremodeller av menneskelig skjoldbruskkjertelen karsinomer er etablert, inkludert subkutan xenograft og orthotopic implantasjon av kreftceller i immunodeficient mus. Subkutane xenograft modeller har vært verdifull for prekliniske screening og evaluering av nye terapeutiske behandlinger. Det er flere fordeler ved å bruke en modell subkutan, 1) hurtig, 2) reproduserbar, og 3) svulst etablering, vekst og respons overfor terapeutiske midler kan overvåkes ved visuell inspeksjon. Imidlertid har betydelige bevis belyse kort comings av underhudsfett xenograft modeller 1-3. For eksempel, medisinske behandlinger som viser helbredende egenskaper i subkutane xenograft modeller har ofte ingen merkbar innvirkning på menneskelig sykdom. Den microenvironment av stedet for xenographic transplantasjon eller injeksjon ligger i hjertet av denne ulikheten.
Orthotopic tumor xenograft modellene gir et mer biologically relevant kontekst for å studere sykdommen. Fordelene med å implantere syke celler eller vev inn i sin anatomiske opprinnelse tilsvarende innen et vertsdyr omfatter et passende sted for tumor-vert interaksjoner, utvikling av sykdom-beslektede metastaser og evnen til å undersøke setespesifikk innflytelse på utprøvning i terapeutiske midler. Derfor orthotopic xenograft modeller havna langt mer klinisk verdi fordi de tett reprodusere sykdom hos mennesker. Av disse grunner, har en rekke grupper utnyttet en orthotopic kreft i skjoldbruskkjertelen modell som et analyseverktøy 4-7.
Her beskriver vi en tilnærming som etablerer en orthotopic modell for studiet av anaplastic skjoldbruskkjertelen karsinom (ATC), som er meget inngripende, motstår behandling, og er nesten dødelig i alle diagnostiserte pasienter. Dyrkede ATC celler er fremstilt som en dissosiert cellulær suspensjon i en oppløsning som inneholder en basalmembran matrise. Et lite volum er sakte injected inn i høyre skjoldbruskkjertelen. Helhetlige utseendet og helsen til musene blir overvåket for å sikre minimal postoperative komplikasjoner og å måle patologisk penetrans av kreft. Mus blir avlivet etter 4 uker, og vev blir samlet for histologisk analyse. Dyr kan tas på et senere tid-poeng å undersøke mer forhånd progresjon av sykdommen. Produksjon av denne orthotopic mus modell etablerer en plattform som oppnår to mål: 1) ytterligere vår forståelse av ATC patologi, og 2) skjerm nåværende og fremtidige terapeutiske midler for å ha effekt i bekjempelsen av ATC.
Protocol
1. Celleforberedelsen
Merknader: 1) fullstendig RPMI 1640 vekstmedium basert oppskrift (500 ml) omfatter 435 ml RPMI 1640, 50 ml varmeinaktivert FBS, 5 ml ikke-essensielle aminosyrer, 5 ml natrium-pyruvat, 5 ml antibiotisk-antimykotisk, 2) sted Matrigel ved 4 ° C en dag før høsting celle.
- Humant ATC cellelinje THJ-11T 8 er dyrket i 6 brønners dyrkings-plater høstet en gang 80-90% sammenflytende.
- Pellet-celler ved sentrifugering ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
- Sug media og resuspender celler i RPMI 1640 media [2 ml / 6 godt plate].
- Ta et lite volum av denne cellesuspensjon legge det til en volumdel 0.4% trypan blått fargestoff og bestemme celletetthet ved hjelp TC10 Automatisert celleteller.
- Beregn volumet av cellen suspensjon for å få 5 x 10 5 celler / mus ganger så mange mus sprøyterom.
Merk: For å sikre annonse likestille celle suspensjon for injeksjon, forberede celler som om du injiserer dobbelt så mange mus (f.eks hvis injisere fem mus, så forberede celle suspensjon som om du var å injisere 10 mus).
- Overfør nødvendig volum av cellesuspensjon i en 15 ml konisk rør.
- Pellet-celler ved sentrifugering ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
- Sug media og resuspender celler i fullstendig RPMI 1640 media.
- Overfør cellene til et 1,6 ml rør, tilsett 1 volum av Matrigel og bland forsiktig ved å pipettere langsomt inn og ut.
Merk: Hver mus mottar 10 pl av cellesuspensjonen / Matrigel cocktail. Siden 5 x 10 5 celler suspendert i en 10 mL injeksjon volum har blitt brukt i tidligere ATC orthotopic studier 9-10, brukte vi disse parametrene i denne rapporten.
- Plasser celle suspensjon på is inntil den er klar til bruk.
- Rengjør kirurgisk sonen, som omfatter dissekere omfang og området rundt, ved å tørke alle overflater med 70% etanol.
- Slå på varmelamper / pads der dyr skal utvinne fra kirurgi.
- Administrer 0,1 ml ketamin / xylazin (narkotika cocktail bestående av ketamin 9 mg / ml og xylazin 1mg/ml) per 10 g kroppsvekt intraperitonealt med en 1 ml, 27 G ½ "Tuberculin sprøyte.
- Prep mus for kirurgi: 1) barbere nakkeregionen av mus (fra kjeven til toppen av brystbenet og ut til armene), 2) skrubbe kirurgisk område tre ganger med chorhexadine gjennomvåt gasbind firkanter, 3) endelig skrubb ferdig med betadine gjennomvåt gasbind, 4 ) forsiktig bruke øyesalve for å hindre øynene tørker.
- Sjekk pedal refleks for å sikre musen er tilstrekkelig bedøvet.
- Plasser dyret i dorsal recumbency på et sterilt felt barriere under dissekere omfang og sikre dyret på plass med klut tape.
- Scrubs hender og fingernails deretter satt på sterile operasjonshansker.
- I et sterilt mote, åpen kirurgi pakke og ordne instrumenter.
- Plasser sterile drapere over dyret, slik at bare kirurgiske området utsatt.
3. Kirurgisk Tilgang til Thyroid og Cell Injection
- Ved hjelp av en steril, disponibel skalpell, lage en en-til-1.5 cm langsgående snitt langs midtlinjen av halsen.
Merk: Avvik fra midtlinjen kompliserer dypere cutting å få tilgang til luftrøret. Ganske nøyaktig midtlinjesnitt lar deg erte og skjære gjennom membran vev holder venstre og høyre spyttkjertler sammen og reduserer sjansen for nicking eller kutte store arterier.
- Lag en andre snitt i stroppen musklene rundt luftrøret trekk deretter høyre side av radert muskelen til siden for å eksponere riktig skjoldbruskkjertelen.
- Hemostats kan brukes på dette punktet for å holde muskelen laget endel for enkel tilgang til skjoldbruskkjertelen (figur 1).
Merk: Alternativt, hvis prosedyren utføres av to kirurgiske personalet, kan muskelen laget rett og slett bli holdt tilbake med tang mens en klar injeksjon sprøyte er overlevert til kirurgen ved å bistå personalet.
- Sprøyt langsomt 10 ul celle-suspensjon i den høyre skjoldbruskkjertelen ved hjelp av en 31G 5/16 "insulinpenna deretter forsiktig fjerne nålen.
4. Nedleggelse av operasjonsstedet og mus Recovery
- Sutur muskel lag med 6,0 suturering materialet ved hjelp av enten en kontinuerlig eller avbrutt suturering stil.
- Stitch huden på samme måte.
- Påfør et lag med trippel antibiotisk salve direkte over snittet området.
- Tillate dyr å komme seg i dorsal recumbency på varmepute. Når dyret kan oppnå sternal recumbency uten hjelp, kan den plasseres tilbake med andre mus.
- Sjekk snittet området og generelle helsen til dyr daglig i en uke etter operasjonen, så sjekk en gang i uken. Hvis sting er fortsatt intakt etter 14 dager, blir de fjernet.
Merk: Dyr vist tegn på sviktende helse (for eksempel betydelig vekttap, rufsete hår, tung pust) bør avlives og vev samles.
- Når mus har nådd en forutbestemt postoperativ tids-punkt, administrere ketamin / xylazin som beskrevet ovenfor til sedat.
- Perfuse dyr intracardially og innhøsting skjoldbruskkjertelen / luftrøret og andre vev av interesse (ikke beskrevet i detalj her).
Representative Results
Vi oppdaget 19 invasive skjoldbruskkjertelen svulster fra totalt 20 mus injisert med ATC celler etter fire uker. I eksemplet vist i figur 2A, mus som fikk en orthotopic injeksjon av 5X10 5 ATC celler dyrket i henhold til vedlagte forhold, viser betydelig infiltrasjon av kreftceller i skjoldbruskkjertelen etter 4 uker etter injeksjon. Naturen av de invaderende ATC celler med en karakteristisk spindel celler og middels til gigantiske størrelse celler med eosinophilic cytoplasma og store kjerner ble verifisert av hematoxylin og eosin (H & E) farging. Til sammenligning er den skjoldbruskkjertelen og luftrør fra en ikke-injiserte kontrolldyr som vist i figur 2B. Follicles av uninjected dyret vise en nær, men likevel løs, forening og har egentlig en runde morfologi.
På grunn av den lille størrelsen av skjoldbruskkjertelen og bruk av injiserbare levering kan oppstå utilsiktede utfall. Figur 3A illustrererhyppigst observerte, som er utvikling av en tumormasse utsiden av, men ikke omfatter, skjoldbruskkjertelen. Dette er mer enn sannsynlig på grunn av nålkraft gjennom og utover skjoldbruskkjertelen når cellene blir utvist. Av og mus presentere uten tumorvekst, både grovt og histologisk, oppdages som vist i Figur 3B. Fravær av detekterbar tumorutvikling kan være forårsaket av frigivelse av cellesuspensjonen fra injeksjonsstedet og spredning inn i tilgrensende vev og hulrom.
Figur 1. Utsette skjoldbruskkjertelen. Etiketter indikerer høyre og venstre skjoldbruskkjertelen flankerer luftrøret.
Figur 2. Histologisk undersøkelse av tumorvekst og ivasion etter vellykket skjoldbruskkjertelen injeksjon. Vevsprøver var delt langs den koronale flyet. A) Bilde tatt på 200X av mus viser betydelig tumorvekst med karakteristiske spindel celler og middels til gigantiske størrelse celler med eosinophilic cytoplasma og store kjerner i hematoxylin og eosin ( H & E) beis Tu indikerer primær lesjon som kreftceller invaderer skjoldbruskkjertelen B) luftrøret og skjoldbruskkjertelen fra kontroll dyr (bildet tatt på 100X) Tu, Svulster;... S, glatt muskulatur, Tr, luftrør, Thy, skjoldbruskkjertelen.
Figur 3. Utilsiktede utfall av orthotopic injeksjon. Vevsprøver var delt langs den koronale flyet. A) Peripheral tumorvekst med ingen vekst tydelig i thyroid (svart pil, bilde tatt på 100X). B) Mangel på svulstdeteksjon på brutto (ikke vist) eller histologisk undersøkelse (bildet tatt på 50X). Thy, skjoldbruskkjertelen.
Discussion
I vår modell viste dyr skjoldbruskkjertelen tumor metastasering og sykdom relatert kakeksi og åndenød etter 4 uker etter injeksjon. Som med de fleste andre orthotopic modeller benytte injiserbare levering av en cellesuspensjon, injeksjon inn i omliggende vev og etter injeksjonen lekkasje som sprer utover målet er mulige. Med det blir sagt, er en gjenkjennelig potensial ukjent produsert av denne prosedyren effekten av off target eksponering for ikke sykdomsrelaterte metastaser eller komplikasjoner. Dette er et generelt problem med de fleste xenographic transplantasjoner, uavhengig av sykdommen som undersøkes. Likevel kan utilsiktede konsekvenser av metastaser bli betydelig minimeres ved å sikre hele bevel av nålespissen har trengt membranen tett overliggende skjoldbruskkjertelen og sakte utvise den cellulære suspensjon. Dersom lekkasje observeres under eller etter injeksjon, kan disse dyrene utelates fra studien.
I denne rapporten beskriver vi lokal vekst og invasjon av avansert skjoldbruskkjertelen tumor etter orthotopic injeksjon av ATC celler. ATC metastase kan bli undersøkt ved å analysere histologiske preparater av andre vev ved hjelp av standard histologiske flekker, slik som hematoxylin og eosin, eller ved hjelp av immunohistokjemi celle eller patologi relevante kriterier. Dette systemet kan videreutvikles ved genetically modifisere thyroid kreft celler med fluorescens reportere, slik at direkte avbildning kan anvendes for å overvåke metastasering og effekten av terapeutiske behandlinger.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke legene. Wenjun Li og Daniel Kreisel (Washington University School of Medicine i St. Louis) for deres hjelp i kirurgi trening. RYL er støttet av National Institutes of Health Grant R01 DK068057 og presidentens Research Fund of Saint Louis University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 cell culture media | Mediatech | 10-041-CV | Media and additives used depend on cell line |
| TC10 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Disposable scalpel, No. 15 | Feather | 2975#15 | |
| Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylon black monofilament suture | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Heating Pad, reusable, 8" x 12" | |||
| Cloth tape, 1" X 10 yds | Medline | MIINON260101 | For restraining anesthetized mouse |
| Peanut Clipper/Trimmer | Wahl | 8655 | For removing hair from surgical site |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gauze, 12-ply | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterile Field, Barrier, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Drapes (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½" needle | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| 31G 5/16" needle | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution | |||
| Triple antibiotic ointment |
References
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
