Summary
हम बैक्टीरिया द्वारा मध्यस्थता प्रतियोगिता की निगरानी के लिए एक गुणात्मक परख का वर्णन
Protocol
1. जीवाणु उपभेदों और संस्कृति
- (मानक CACL 2 उपचार या electroporation का उपयोग) 15 ई. को बदलने के द्वारा एक Escherichia कोलाई प्राप्तकर्ता सेल इंजीनियर (शिकार, पी) lacZ जीन (1 टेबल) के एक complementation की अनुमति प्लाज्मिड साथ DH5α कोशिकाओं कोलाई. प्लेट Luria Bertani अगर प्लेटों पर तब्दील कोशिकाओं (LBA, अगर 1.5%) युक्त 5-ब्रोमो 4 - क्लोरो indolyl-β-D-galactopyranoside (एक्स - लड़की) 40 मिलीग्राम / मिलीलीटर अंतिम एकाग्रता और उचित एंटीबायोटिक. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात और निम्नलिखित सुबह नीले transformants के लिए चयन (1.3 § देखें) सेते हैं.
- Pseudomonas aeruginosa दाता कोशिकाओं कि T6SS सक्रिय हैं बढ़ने (डी +) या T6SS निष्क्रिय रातोंरात LBA (1 टेबल) 37 डिग्री (डी) सी. उदाहरण में यहाँ प्रस्तुत हम एक पी. aeruginosa retS रखने तनावएक constitutively सक्रिय H1 T6SS 16 और जीन H1-T6SS क्लस्टर (1 टेबल) के एक विलोपन के साथ एक isogenic उत्परिवर्ती.
- अगले दिन, वातित फ्लास्क में ई. के बीच एक चमकदार नीली क्लोन inoculating द्वारा एक रात में तरल संस्कृति तैयार थाली से कोलाई transformants (पी) 1.1 § में उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पूरक tryptic सोया शोरबा (TSB) के 5 मिलीलीटर में वर्णित है. 37 में आंदोलन के तहत विकसित ° सी. 1.2 § में वर्णित थाली से (डी) (डी +) और एक कॉलोनी के साथ समान रूप से आगे बढ़ें.
2. प्रतियोगिता परख
- अगले दिन प्रयोग के लिए LBA प्लेटें तैयार. यकीन है कि इन प्लेटों को ठीक से सूख रहे हैं (या तो लैम्प बर्नर के पास या लामिना का प्रवाह कैबिनेट में). (डी) उपभेदों (डी +), के लिए एक थाली "परख इनपुट" (A इनपुट) तैयार करने के लिए, और (P (डी - पी) और (डी + + पी). फूट डालो और प्लेटें तदनुसार लेबल.
- रातोंरात के विकास के बाद (1.3 § देखें), इनपुट जीवाणु संस्कृति (डी, डी + P) (600nm आयुध डिपो) के ऑप्टिकल घनत्व को मापने और प्रत्येक तनाव की 1 यूनिट आयुध डिपो 600nm एक सेल घनत्व बराबर प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना . प्रत्येक कोशिका "इनपुट" संस्कृति (डी, डी + पी) शुरू में एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में एकत्र.
- 13,000 rpm पर बैक्टीरिया के नमूने और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के दौरान अपकेंद्रित्र तैरनेवाला त्यागें.
- Resuspend विकास के छर्रों - डी ताजा TSB के 100 μl में + P, और संस्कृतियों, और कोमल pipetting द्वारा प्रत्येक corre की 10 मिलीलीटर टीका लगाना"एक इनपुट" प्लेट (2.1 § में तैयार) पर एक ही स्थान के रूप में तनाव sponding.
- "एक उत्पादन" प्लेट (2.1 § में तैयार) टीका लगाना. ज्यादा ठीक है, धीरे (डी +) के 30 μl मिश्रण 30 (पी) μl के 30 μl (डी) दो अलग Eppendorf ट्यूब (ध्यान दें है कि इस्तेमाल किया संस्कृतियों 2.4 § में वर्णित उन) में 30 मिलीलीटर (पी) के साथ . घोला जा सकता है (डी + पी /) के 20 μl टीका लगाना और (डी / पी) "एक उत्पादन" प्लेट पर अलग - अलग स्थानों के रूप में. स्पॉट पास एक लैम्प बर्नर सूखी और 37 डिग्री सेल्सियस पर समय का एक उचित अवधि के दौरान जो बैक्टीरियल हत्या जगह ले जा रहा है के लिए एक मशीन में थाली जगह की अनुमति दें. पी. के मामले में aeruginosa, एक कुशल बैक्टीरियल हत्या 5 घंटा ऊष्मायन के बाद जब एक एक T6SS दोषपूर्ण तनाव के साथ सक्रिय T6SS की तुलना में मनाया जाता है.
3. टी के गुणात्मक अवलोकनवह बैक्टीरियल हत्या
- LBA 40 ग्राम / मिलीलीटर परख के readout के लिए एक्स - लड़की युक्त प्लेटें तैयार. प्लेटें "Readout इनपुट" या "आर इनपुट" पृथक बैक्टीरिया या "Readout उत्पादन" या "आर उत्पादन" मिश्रित बैक्टीरियल संस्कृतियों हाजिर करने के लिए और इस तरह की हत्या पढ़ने के प्रदर्शन हाजिर बुलाया जाएगा. इन प्लेटों को भी जरूरत है ठीक से सूख जाना. अपनी पीठ पर चार बराबर भागों में प्लेट फूट डालो और इन भागों व्याख्या 0, 10, 1, 10 -2 और 10 -3, जीवाणु संस्कृति की dilutions designating अगर प्लेटों पर हाजिर (3.3 § देखें). एक ही स्थान के कमजोर पड़ने के भीतर नीले / सफेद बैक्टीरिया अनुपात की एक अर्द्ध मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति होगी.
- "एक इनपुट" प्लेट (2.4 § देखें) से एक बाँझ पाश व्यक्ति बैक्टीरियल स्पॉट और "एक उत्पादन" प्लेट (2.5 § देखें) के साथ ले लीजिए और विशिष्ट 1.5 मिलीलीटर Eppendorf TSB के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में हर जगह resuspend. 30 मिनट के दौरान एक Eppendorf हिलनेवाला ब्लॉक में जगह के लिए कुशलतापूर्वक resuspendबैक्टीरिया.
- 5 बार 3 Eppendorf TSB के 900 μl युक्त ट्यूबों की एक श्रृंखला तैयार और दस दस -3 गुना धारावाहिक dilutions प्रत्येक resuspended जगह के लिए आगे बढ़ना. विंदुक युक्तियाँ बदलने के लिए और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कमजोर पड़ने के कदम के बीच 5 सेकंड भंवर.
- अपने बैक्टीरियल 3.3 § में अच्छी तरह से सूखे LBA सबसे पतला साथ undiluted निलंबन के लिए शुरू करने से 40 ग्राम / एमएल X-gal युक्त प्लेटों पर तैयार dilutions खोलना, "एक के लिए इन" आर - इनपुट "प्लेट बनाने के लिए आगे बढ़ें इनपुट स्पॉट "और" आर A-उत्पादन आउटपुट स्पॉट "(2 चित्रा)" के लिए प्लेट ". संक्षेप में एक समरूप बैक्टीरियल निलंबन रखने के लिए खोलना के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रत्येक ट्यूब भंवर. परिणाम, एक वृत्त का चतुर्थ भाग के भीतर जगह तीन प्रतियों में 20 μl (2 चित्रा) के reproducibility. अपनी थाली के रिश्तेदार सूखापन इस स्तर पर महत्वपूर्ण है क्योंकि स्थानों के लिए व्यक्तिगत प्लेट पर अलग रहते हैं और एक दूसरे की ओर फिसलना नहीं की जरूरत है.
प्रतियोगिता परख का एक मात्रा का ठहराव भी प्रयोग के इस स्तर पर संभव है. कदम के बाद 3.3, LBA 40 ग्राम / एक्स - लड़की मिलीलीटर युक्त प्लेटों पर कमजोर पड़ने 10 -3 की 100 μl फैल गया. परिणामों के reproducibility के लिए, हर जगह के लिए तीन प्रतियों में एक "एक उत्पादन" थाली से चढ़ाना करने के लिए आगे बढ़ना. एक डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर रातोंरात (16 घंटा ऊष्मायन इसी) 37 में कमजोर पड़ने प्लेटें प्लेस. नीले कालोनियों (पी कोशिकाओं है कि जीवित रह) की गणना करने के लिए आगे बढ़ें. ठेठ प्रतियोगिता के 5 घंटे के बाद प्राप्त परिणामों 3 चित्र में दिखाया जाता है. - थाली खुला (ढक्कन) एक बाँझ क्षेत्र के भीतर छोड़ हर जगह के भीतर अतिरिक्त में तरल के अवशोषण की अनुमति.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह रातोरात. इस ऊष्मायन समय के दौरान, हत्या अभी भी मिश्रण में होने वाली दोनों उपभेदों के संपर्क में अभी भी कर रहे हैं क्योंकि (डी + पी /).
- एक तस्वीर ले लोया उत्पादन विश्लेषण (2 चित्रा) के लिए अपनी प्लेट स्कैन. जहां स्पॉट काफी हद तक नीले रहते हैं यह इंगित करता है कि ई. कोलाई पी. द्वारा नहीं मारा है aeruginosa. यह मामला जब ई. कोलाई एक T6SS दोषपूर्ण पी. के साथ मिलाया जाता है aeruginosa तनाव (डी) (2 चित्रा, नीचे सही पर थाली).
Representative Results
विशिष्ट परिणाम चित्रा 1 में उपभेदों और अभिकर्मकों तालिका 1 में वर्णित के साथ दिखाया जाता है. इस आंकड़े में दिखाया प्लेटें एक रात में ऊष्मायन के बाद स्कैन किया गया. "Readout इनपुट" प्लेटें इस परख में इस्तेमाल उपभेदों के लिए एक धारावाहिक कमजोर पड़ने पैटर्न दिखा. जैसी कि उम्मीद थी, ई. कोली (पी) स्पॉट overexpressing lacZ जीन एक्स - लड़की के साथ पूरक मीडिया पर नीले रंग दिखाई देते हैं शिकार है, जबकि दाता पी. aeruginosa उपभेदों (डी +, T6SS सक्रिय) और (डी -, T6SS निष्क्रिय) सफेद रहते हैं. "Readout उत्पादन" प्लेटें शिकार और एक T6SS सक्रिय तनाव (डी + पी /) के बीच जिस पर नीले रंग के लापता होने के मिश्रण दिखाने के लिए देखा गया है इस प्रकार का संकेत शिकार यह मार डाला गया है. यह दाता की क्षमता के लिए शिकार outcompete दर्शाता है. पर (नीले रंग की दृढ़ताडी पी /) थाली नीले शिकार को मारने के लिए एक निष्क्रिय T6SS दाता की अक्षमता को दर्शाता है.
चित्रा 1. ई. की हत्या T6SS प्रवीण पी. द्वारा कोलाई aeruginosa पी. aeruginosa ई. में जहर injects कोलाई तरीके में T6SS निर्भर लक्ष्य सेल (सफेद तीर द्वारा दिखाया गया है). दो Tse1 और Tse3 विषाक्त पदार्थों (नारंगी और लाल हलकों) ई. में इंजेक्ट कर रहे हैं कोलाई periplasm और पेप्टीडोग्लायकन 9 नीचा. Tse2 विष (पीला सर्कल) ई. में इंजेक्ट किया जाता है cytoplasm कोलाई और एक बैक्टीरियोस्टेटिक गतिविधि है 8,10 है. विषाक्त पदार्थों की संयुक्त कार्रवाई लक्ष्य कोशिकाओं (बिजली और खोपड़ी के फ्लैश) को मारता है. लक्ष्य कोशिकाओं के अस्तित्व का उत्पादन β-galactosidase की गतिविधि की निगरानी (यह भी देखें चित्रा 2) द्वारा पाया जा सकता पी.. एकeruginosa उन्मुक्ति Tsi2 Tsi1, और Tsi3 (नारंगी, पीले और लाल वर्गों, क्रमशः) 8,9,10 प्रोटीन से विषाक्त पदार्थों की गतिविधि के खिलाफ की रक्षा की है.
चित्रा 2. अगर प्लेट T6SS निर्भर परख बैक्टीरियल हत्या पर नजर रखने के लिए इस आंकड़े में ऊपरी भाग "Readout इनपुट" डी के धारावाहिक dilutions से मिलकर प्लेटों पर दिखाया जाता है, डी, और पी इनपुट कोशिकाओं. पी इनपुट कोशिकाओं नीले lacZ जीन की α complementation के कारण कर रहे हैं और इस प्रकार उत्पादित β galactosidase cleaves एक्स - लड़की है कि. "Readout आउटपुट" निचले हिस्से में एक सक्रिय (डी / पी) के बीच जीवाणु मिश्रण के धारावाहिक dilutions की मिलकर प्लेटें दिखाया गया है (डी / पी), T6SS दाता पी. ई. साथ aeruginosa तनाव कोलाई शिकार करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. ई. की हत्या की मात्रा पी. द्वारा कोलाई 5 घंटा ऊष्मायन के बाद aeruginosa. ग्राफ ई. के CFU गिनती प्रस्तुत कोलाई 3.4 चरण में वर्णित है. परिणाम यहाँ प्रस्तुत + T6SS और T6SS उपभेदों 3 गुना के बीच एक अंतर दिखाने के लिए सुझाव है कि हत्या के सबसे अधिक 5 संपर्क के शुरुआती घंटों के दौरान जगह ले जा रहा है.
Discussion
इस लेख में प्रस्तुत विधि T6SS की मध्यस्थता जीवाणुनाशक / बैक्टीरियोस्टेसिस गतिविधि एक दृश्य अवलोकन की अनुमति देता है. परख एक अगर थाली की सतह पर किया जाता है. यह पहले से दिखाया गया है कि T6SS निर्भर हत्या मिश्रित जीवाणु तरल संस्कृति के साथ प्रदर्शन परख कुशल, संभावना दो 8 बैक्टीरिया के बीच नियमित संपर्क की कमी की वजह से नहीं है. T6SS एक bacteriophages द्वारा इस्तेमाल के लिए लक्ष्य 17 कोशिकाओं में डीएनए इंजेक्षन एक जैसा तंत्र के साथ काम करने के लिए माना जाता है. तरल संस्कृति में, ट्यूब की तरह T6SS की संरचना और अधिक आसानी से तोड़ सकते हैं, अंतर - बैक्टीरियल संपर्क खो दिया जा सकता है और विषाक्त पदार्थों को कुशलता से नहीं दिया जाता है.
ऊष्मायन बार के संदर्भ में, संपर्क के 5 प्रारंभिक घंटे कि हम दाता तनाव और शिकार के बीच वर्णन पी. के बीच बैक्टीरियल हत्या का पालन करने के लिए पर्याप्त हैं aeruginosa और ई. कोलाई, के रूप में 3 चित्र में सचित्र
चूंकि इस पद्धति एक रंग आधारित तकनीक है, उत्पादन परिणाम दाता तनाव के pigmentation द्वारा समझौता किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, पी. के मामले में aeruginosa, कुछ उपभेदों ऐसे pyocyanin और pyoverdine के रूप में रंग pigments के उच्च स्तर जो परख readout के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं उत्पादन, शिकार से भेद अपेक्षाकृत मुश्किल बना रही है. मैजंटा लड़की या लड़की लाल के रूप में इस तरह के अन्य वर्णजनीय β galactosidase substrates, एक्स लड़की (1 टेबल) के बजाय प्रयोग किया जा सकता है.
प्रतियोगिता परख readout के लिए अन्य रिपोर्टर जीन का उपयोग कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, इसी तरह की परख भी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल 12 preys का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया है.
हमारी परख, मात्रात्मक नहीं है, जबकि एक अच्छा संकेत देता हैबाद से T6SS गतिविधि के अस्तित्व या एक संवाददाता शिकार की हत्या पर आधारित है. इस तकनीक आसान है और किसी भी बैक्टीरियल प्रजातियों से T6SSs की जीवाणुनाशक / बैक्टीरियोस्टेसिस गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए सुविधाजनक होने का लाभ प्रस्तुत करता है. अब तक, T6SS की गतिविधि ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और T6SS के प्रति संवेदनशील ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया का कोई स्पष्ट उदाहरण के खिलाफ दिखाया गया है अभी तक 12 बताया गया है. यह भी स्पष्ट है कि परीक्षण करने के लिए अलग बैक्टीरियल प्रजातियों के संस्कृति में असंगति (जैसे तापमान, विकास oxygenation, विशिष्ट मीडिया) को माना जा रहा है.
हमारी परख भी मूल्यांकन T6SS घटकों के जो बिल्कुल आवश्यक हैं क्योंकि एक secreted विष के भी निशान शिकार को मारने के लिए पर्याप्त हो सकता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तो स्पष्ट रूप से यहां तक कि T6SS की कमजोर गतिविधि हमारे परख द्वारा पता लगाया जा सकता है के रूप में मानक प्रक्रिया परीक्षण T6SS निर्भर संस्कृति तैरनेवाला और वेस्टर्न ब्लॉट का उपयोग स्राव तुलनाविश्लेषण. हालांकि, एक उचित इकाई कॉलोनी के गठन गिनती (CFU) अभी भी इस T6SS गतिविधि के सटीक मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम वेलकम ट्रस्ट अनुदान WT091939MA द्वारा वित्त पोषित किया गया था. Alain Filloux रॉयल सोसाइटी द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D-)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3', and 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3'. The Down fragment primers : 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3', 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
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| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
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References
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