Summary
Vi beskriver en kvalitativ analyse for å overvåke bakteriell konkurranse mediert av
Abstract
Type VI sekresjon systemer (T6SSs) er molekylære nanomachines tillater gramnegative bakterier for å transportere og injisere proteiner i et bredt utvalg av target-celler 1,2. Den T6SS består av 13 kjernekomponenter og viser strukturelle likheter med halen-røret av bakteriofager 3. Fagen bruker et rør og en punktering enhet å trenge celleveggen av målet bakterier og injisere DNA. Det foreslås at T6SS er en omvendt bakteriofag enhet skape en bestemt bane i den bakterielle celleveggen å drive effektorer og toksiner til overflaten. Prosessen kan bli tatt videre og T6SS enheten kunne gjennomhulle andre celler som bakterien er i kontakt, og dermed injisere effektorene i disse målene. Halen røret og punkteringsmønster enhet deler av T6SS er laget med HCP og VgrG proteiner, henholdsvis 4,5.
Allsidighet av T6SS er påvist gjennom studies ved hjelp av ulike bakterier. Vibrio cholerae T6SS kan remodel cytoskjelettet av eukaryote vertsceller ved å injisere en "utviklet" VgrG bærer en C-terminal actin kryssbinding domenet 6,7. Et annet slående eksempel ble nylig dokumentert Pseudomonas aeruginosa som er i stand til å målrette og drepe bakterier i en T6SS-avhengig måte, derfor fremme etablering av bakterier i bestemte mikrobielle nisjer og konkurransedyktig miljø 8,9,10.
I sistnevnte tilfelle, har tre T6SS-utskilte proteiner, nemlig Tse1, Tse2 og Tse3 blitt identifisert som giftstoffer injiseres i målet bakterier (Figur 1). Donor cellen er beskyttet fra den skadelige virkning av disse effektorer via en anti-toksin mekanisme, mediert av Tsi1, Tsi2 og Tsi3 immunitet proteiner 8,9,10. Dette antimikrobiell aktivitet kan overvåkes når T6SS-dyktige bakterier er co-dyrket på sOlid overflater i konkurranse med andre bakteriearter eller med T6SS-inaktive bakterier av samme art 8,11,12,13.
Tilgjengelige data vektlagt en numerisk tilnærming til bakteriell konkurranse analysen, inkludert tidkrevende CFU telling som avhenger mye av antibiotika beslutningstakere. I tilfelle av antibiotikaresistente stammer som P. aeruginosa, kan disse metodene være upassende. Dessuten, med identifikasjon av ca 200 forskjellige T6SS loci i mer enn 100 bakterielle genomer 14, er en praktisk screening verktøy meget ønskelig. Vi utviklet en metode som er enkel å bruke og krever standard laboratorie materiale og reagenser. Metoden byr en hurtig og kvalitativ teknikk for å overvåke T6SS-avhengige baktericid / bacteriostasis aktivitet ved hjelp av en reporter belastninger som et byttedyr (i dette tilfellet Escherichia coli DH5α) tillater en-komplementering av lacZ-genet. Totalt sett er denne metoden drueHIC og tillater rask identifisering av T6SS-relaterte fenotyper på agarplater. Denne eksperimentelle protokollen kan tilpasses for andre påkjenninger eller bakteriearter hensyntatt spesifikke tilstander som vekstmedier, temperatur eller tid for kontakt.
Protocol
1. Bakteriestammer og kulturer
- Ingeniør en Escherichia coli mottaker celle (Prey, P) ved å omforme (ved hjelp av standard CaCl 2 behandling eller electroporation) 15 E. coli DH5α celler med et plasmid som tillater a-komplementering av lacZ-genet (Tabell 1). Plate de transformerte cellene i Luria-Bertani agarplater (LBA, 1,5% agar) som inneholder 5-brom-4-klor-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal) ved 40 mg / ml endelig konsentrasjon og passende antibiotikum. Inkuber ved 37 ° C over natten og påfølgende morgen velger for blå transformanter (se § 1.3).
- Dyrke Pseudomonas aeruginosa donor celler som er T6SS-aktive (D +) eller T6SS-inaktiv (D-) (Tabell 1) på LBA natten ved 37 ° C. I eksempelet som presenteres her vi brukte en P. aeruginosa rets stamme besittelseen konstitutivt aktiv H1-T6SS 16 og en Isogene mutant med en sletting av H1-T6SS clusteret (Tabell 1).
- Neste dag, utarbeide en overnatting væske kultur i karbonisert kolbe ved å inokulere en lys blå klone blant E. coli transformanter (P) fra platen som er beskrevet i § 1.1, i 5 ml tryptisk soyavekstmedium (TSB) supplert med passende antibiotikum. Vokse under omrøring ved 37 ° C. Fortsett likt med en enkelt koloni av (D +) og av (D -) fra platen som er beskrevet i § 1.2.
2. Konkurranse Assay
- Forbered LBA plater for neste dag eksperimentet. Sørg for at disse platene er riktig tørket (enten ved Bunsen brenner eller i laminær skap). Utarbeide en "analyse-inngang" (A-inngang) plate for stammer (D +), (D -), og (P (D - + P) og (D + + P). Splitt og merke platene tilsvarende.
- Etter over natten vekst (se § 1.3), måle den optiske tetthet (OD 600nm) av input bakteriekultur (D -, D + og P) og beregne volumet som kreves for å oppnå en celletetthet tilsvarer 1 enhet OD 600nm av hver stamme . Hver "input" cellekultur (D -, D + og P) er i utgangspunktet samlet i en steril 1,5 ml Eppendorf-rør.
- Sentrifuger bakterielle prøvene ved 13.000 rpm under 1 min ved romtemperatur og kast supernatanten.
- Resuspender pellets i D -, D + og P kulturer, i 100 ul av fersk TSB ved forsiktig pipettering og inokuler 10 ml av hver tilsvarersvarende belastninger som en enkelt flekk på "A-inngang" plate (utarbeidet i § 2.1).
- Inokulere "A-output" plate (utarbeidet i § 2.1). Mer presist, bland forsiktig 30 ul (D +) med 30 pl (P) og 30 pl av (D -) med 30 ml (P) i to separate Eppendorf-rør (merk at kulturene brukes er de som er beskrevet i § 2.4) . Inokuler 20 pl av den blandinger (D + / P) og (D - / P) som individuelle flekker på "A-output" plate. Tillat stedene tørke nærheten en Bunsen-brenner og plasser platen i en inkubator ved 37 ° C i en passende tidsperiode som bakteriell avliving pågår. I tilfelle av P. aeruginosa er en effektiv bakteriell drap observert etter 5 timers inkubasjon når man sammenligner en T6SS aktive med en T6SS defekt belastning.
3. Kvalitativ Observasjon av than Bakteriell Killing
- Forbered LBA plater inneholdende 40 ug / ml X-gal for avlesning av analysen. Platene vil bli kalt "Readout input" eller "R-input" å få øye isolerte bakterier eller "Readout utgang" eller "R-output" å få øye blandede bakteriekulturer og dermed lese drepe ytelse. Disse platene må også være riktig tørket. Dele plate i fire like deler på ryggen og kommentere disse delene 0, 10 -1, 10 -2 og 10 -3, utpeke de fortynninger av bakteriekultur å få øye på agarplater (se § 3.3). Fortynningen vil tillate en semi-kvantitativ evaluering av den blå / hvite bakterier ratio innenfor samme sted.
- Samle opp med en steril løkke de enkelte bakterielle flekker fra "A-inngang" plate (se § 2.4) og "A-output" plate (se § 2.5) og resuspender hver spot i forskjellige 1,5 ml Eppendorf rør som inneholder 1 ml TSB. Plasser i en Eppendorf shaker blokk under 30 min å resuspendere effektivtbakterier.
- Utarbeide en serie på 5 ganger 3 Eppendorf rør som inneholder 900 ul av TSB og fortsett for hver resuspenderte sted til ti fold seriefortynninger opptil 10 -3. Sørg for å endre pipettespisser og vortex 5 sekunder mellom hver fortynning trinn.
- Fortsett til fange av dine bakterielle fortynninger utarbeidet i § 3.3 på godt tørket LBA plater som inneholder 40 mikrogram / ml X-gal ved å starte med det mest utvannet til ufortynnet suspensjon, noe som gjør disse de "R-inngang" plater for "A -inngang "flekker og" R-utgang "plater for" A-utgang "flekker (figur 2). Vortex kort hver røret før du går videre til fange for å holde en homogen bakteriell suspensjon. For reproduserbarhet av resultatene, flekk 20 ul i triplikat i en kvadrant (figur 2). Den relative tørrhet av tallerkenen er viktig på dette stadiet ettersom stedene må forbli individuelt separert på plate og ikke gli mot hverandre.
En kvantifisering av konkurransen analysen er også mulig på dette stadiet av eksperimentet. Etter trinn 3,3, spredt 100fil av fortynningen 10 -3 på LBA skåler inneholdende 40 pg / ml X-gal. For reproduserbarhet av resultatene, går du videre til en plating i tre eksemplarer for hver spot fra "A-output" plate. Plasser fortynning platene i en 37 ° C inkubator over natten (tilsvarende 16 timers inkubasjon). Fortsett til telling av de blå kolonier (P celler som forble i live). Typiske resultater oppnådd etter 5 hr av konkurranse er vist i figur 3.. - Forlate platen åpen (uten lokk) innenfor et sterilt sone for å tillate absorpsjon av væsken i overkant innenfor hvert område.
- Sett platen i en 37 ° C inkubator over natten. I løpet av denne inkubasjonstid, drepingen fremdeles skjer i blandingen (D + / P) siden begge stammer er fortsatt i kontakt.
- Ta et bildeeller skanne platene for output analyse (Figur 2). Hvor flekker fortsatt i stor grad blå, betyr det at E. coli har ikke blitt drept av P. aeruginosa. Det er tilfellet når E. coli er blandet med en T6SS-defekt P. aeruginosa stamme (D-) (figur 2, plate nederst til høyre).
Representative Results
Typiske resultater er vist i figur 1 med de spenninger og reagenser som er beskrevet i tabell 1. Platene vist i denne figuren er skannet etter en inkubering over natten. De "Readout-Input" platene viser en seriell fortynning mønster for stammene som ble brukt i denne analysen. Som forventet, E. coli byttedyr flekker (P) overekspresjon lacZ genet vises blå på medier supplert med X-gal, mens donor P. aeruginosa stammer (D +, T6SS aktiv) og (D -, T6SS inaktiv) forblir hvit. De "Readout-utgang" platene som miksen mellom byttedyr og en T6SS aktiv belastning (D + / P) har blitt oppdaget vise forsvinningen av den blå byttedyr og dermed indikerer det har blitt drept. Dette viser evnen til donor å utkonkurrere byttet. Utholdenhet av den blå fargen på (D - / P) plate demonstrerer manglende evne av en inaktiv T6SS donor å drepe den blå byttedyr.
Figur 1. Drap av E. coli ved T6SS-dyktig P. aeruginosa. P. aeruginosa injiserer giftstoffer i E. coli målcellen i en T6SS-avhengig måte (vist med en hvit pil). To giftstoffer Tse1 og Tse3 (oransje og røde sirkler) som injiseres i E. coli periplasm og svekke peptidoglycan 9. Den Tse2 toksin (gul sirkel) blir injisert i E. coli cytoplasma og har en bakteriostatisk aktivitet 8,10. Den kombinerte virkningen av giftstoffer dreper målcellene (lyn og skallen). Overlevelsen av målceller kan påvises ved å overvåke aktiviteten av det produserte β-galaktosidase (se også figur 2). P. eneruginosa er beskyttet mot aktiviteten av giftstoffer ved immunitet proteiner Tsi1, Tsi2 og Tsi3 (oransje, gule og røde firkanter, henholdsvis) 8,9,10.
Figur 2. Agarplate analysen for å overvåke T6SS avhengig bakteriell drap I denne figuren er vist på den øvre delen av "Readout-Input" platene består av de serielle fortynninger av D -., D + og P innsettingscellene. Den p innsettingscellene er blå grunnet α-komplementering av lacZ-genet og således fremstilte β-galaktosidase som kløyver X-gal. I den nedre delen er vist "Readout utganger" platene bestående av serielle fortynninger av den bakterielle blanding mellom en aktiv (D + / p) (D - / P), T6SS donor P. aeruginosa stamme med E. coli byttedyr. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Kvantifisering av drapet på E. coli ved P. aeruginosa etter 5 timers inkubasjon. Grafen presenterer CFU telling av E. coli beskrevet i 3,4 trinn. Resultatene som presenteres her viser en 3-gangers forskjell mellom T6SS + og T6SS-stammer, noe som tyder på at det meste av drepingen finner sted under de 5 første timer med kontakt.
Discussion
Metoden som presenteres i denne artikkelen tillater en visuell observasjon av T6SS-mediert baktericid / bacteriostasis aktivitet. Analysen utføres på overflaten av en agarplate. Det har tidligere vært vist at T6SS-avhengig dreping assay utført med blandet bakteriell væskekultur er ikke effektiv, sannsynligvis på grunn av mangel på jevn kontakt mellom de to bakteriene 8. Den T6SS antas å operere med en mekanisme beslektet med den som brukes av bakteriofager å injisere DNA i målcellene 17. I flytende kultur, kan den rør-lignende struktur av T6SS brekke lettere, kan inter-bakteriell kontakt tapt, og giftstoffer blir ikke effektivt levert.
I form av inkubasjonstider, de 5 første timer med kontakt som vi beskriver mellom giver belastning og byttet er tilstrekkelig til å observere bakteriell drap mellom P. aeruginosa og E. coli, som illustrert i Figur 3
Siden denne metoden er en farge basert teknikk kan output resultatene bli kompromittert av pigmentering av donor belastningen. For eksempel, i tilfelle av P. aeruginosa, noen stammer produsere høye nivåer av fargede pigmenter som pyocyanin og pyoverdine, som kan interferere med analysen utlesning, noe som gjør skillet fra byttedyr relativt vanskelig. Andre kromogene β-galaktosidaseaktivitet substrater, som for eksempel den magenta-gal eller rød-gal, kan brukes i stedet for X-gal (Tabell 1).
Konkurransen Analysen kan gjøre bruk av andre reporter gener for avlesning. For eksempel har lignende analyse også blitt utført ved hjelp av grønt fluorescerende protein-merket preys 12.
Vår analyse, mens ikke kvantitativ, gir en god indikasjonav T6SS aktivitet siden den er basert på overlevelsen eller drapet av en reporter byttedyr. Denne teknikken presenterer fordelen av å være enkel og praktisk å evaluere baktericide / bacteriostasis aktiviteten T6SSs fra eventuelle bakteriearter. Så langt har aktiviteten av T6SS vist mot Gram-negative bakterier og ingen klart eksempel på T6SS-sensitive grampositive bakterier er rapportert ennå 12. Det er også åpenbart at inkompatibilitet i kulturen i de ulike bakteriearter å teste (f.eks vekst temperatur, oksygenering, bestemte medier) skal vurderes.
Vår Målingen kan også brukes til å vurdere hvilke T6SS komponentene er helt avgjørende, siden selv spor av et utskilt toksin kan være tilstrekkelig til å drepe byttet. Selv svak aktivitet av T6SS kunne så klart påvises ved analysen vår som sammenlignet med standard prosedyre testing T6SS-avhengig sekresjon bruke kultur supernatant og Western blotanalyse. Imidlertid, er en riktig koloni-dannende enhet (CFU) opptelling fortsatt nødvendig for nøyaktig kvantifisering av denne T6SS aktivitet.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Trust stipend WT091939MA. Alain Filloux støttes av Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D-)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3', and 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3'. The Down fragment primers : 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3', 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
|||
References
- Filloux, A., et al. The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).
- Cascales, E., Cambillau, C. Structural biology of type VI secretion systems. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).
- Leiman, P. G., et al. Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers. Virol. J. 7, 355 (2010).
- Ballister, E. R., et al. In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).
- Leiman, P. G., et al. Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).
- Pukatzki, S., et al. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).
- Ma, A. T., et al. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).
- Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).
- Russell, A. B., et al. Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells. Nature. 475 (7356), 343 (2011).
- Li, M., et al. Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein. PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).
- Zheng, J., et al. Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae. PLoS One. 6 (8), (2011).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).
- Murdoch, S. L., et al. The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors. J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).
- Boyer, F., et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources? BMC Genomics. 10, 104 (2009).
- Maniatis, T., et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).
- Mougous, J. D., et al. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus. Science. 312 (5779), 1526 (2006).
- Records, A. R., et al. The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery. Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).
- Hachani, A., et al. Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins. J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).
