Summary
外场电位记录在幼虫斑马鱼的前脑的一个简单的方法来描述。该方法提供了一个强大的
Abstract
癫痫会影响近3万人在美国和世界各地多达50万人。定义为发生自发的无端发作，癫痫，可以获取到大脑或基因突变的结果的一种侮辱。在动物模型癫痫发作的努力，主要用于收购侮辱（惊厥药，刺激或脑损伤）和遗传操作（反义击倒，同源重组或转基因）在啮齿类动物。斑马鱼是脊椎动物模型系统1-3，可以提供一个有价值的替代老鼠癫痫研究。斑马鱼被广泛应用于脊椎动物的遗传学研究或发展，对哺乳动物的遗传相似性，表现出高度表达的同系物〜85％的已知的人类单基因遗传性癫痫突变。由于它们的小尺寸（长4-6毫米），斑马鱼幼虫可以保持低的流体体积为100微升，在早期的发展和阿拉进行期间，在多井板。试剂可直接加入到该溶液中，在胚胎发育，简化给药，从而实现快速的在体内筛选试验化合物4。可用于合成寡核苷酸（吗啉代），致突变，锌指核酸酶和转基因方法，以迅速产生基因敲除或突变的斑马鱼5-7。这些属性提供了前所未有的斑马鱼研究的统计动力分析优势的研究啮齿动物的神经系统疾病，如癫痫。 ，因为癫痫研究的“金标准”是描述监测和分析的异常放电起源于一个中央的大脑结构（ 即癫痫发作），斑马鱼幼虫的大脑活动的方法，有效地记录在这里。该方法是一种适应传统的细胞外记录技术，并允许稳定的长期监测在完整的斑马鱼幼虫的大脑活动。小号充足的记录上所显示的急性发作引起的惊厥药和自发发作在转基因鱼浴应用。
Protocol
1。鸡蛋的生产和收集
- 斑马鱼的饲养标准程序，前面描述的8。简单地说，成年斑马鱼在养殖箱分频器的地方。第二天早上，在房间里的灯都分频器从坦克和鱼类育种允许不受干扰的交配时间约20至60分钟。
- 从繁殖罐的鸡蛋被收集在过滤器并和用鸡蛋水漂洗。卵，然后转移到陪替氏培养皿用鸡蛋水。用移液管未受精的卵子和碎片被删除。
- 将培养皿包含收集鸡蛋的培养箱中（28-32℃）。卵孵化后，大约2天受精后（DPF），去除绒毛和任何其他的碎片，用移液管。
- 所需的天受精后（3〜8 DPF）的培养皿中自由游动的幼虫和实验室的长椅上，在室温下删除。
- 用微拉马，拉1.2毫米外径硼硅玻璃毛细管橡皮泥斜坡铺设超过两针，并存储在一个150毫米的培养皿或空吸管盒。针可以预先拉出。取决于可用放大器探头类型，可以使用不同OD玻璃毛细管。
- 回程微电极与细胞外记录用的Nalgene针筒式过滤器（4毫米）和Microfil长丝（华纳精密仪器）连接用1ml注射器的溶液（2 M氯化钠）。摇动或敲击丸向针尖，直到有很少或根本没有气泡，剩余的。
3。琼脂中的固定化
- 准备一个新鲜的溶液中1.2％低熔点琼脂在蛋水。将琼脂溶液在约37℃下在水浴中集
- 准备盖玻片，在录音室和冷冻室（5-10分钟）。录音室MATC为h的电生理钻机上使用。我们使用一个低调的开放式钻石浴成像室，从华纳仪器（RC-26GLP型）。
- 使用巴斯德移液管，在一个干净的培养皿中板的小液滴的蛋水的地方之一幼虫的斑马鱼。这种液滴，添加含有麻醉剂（0.02％三卡因）和瘫痪剂（1毫克/毫升α-银环蛇毒素）的溶液的液滴。
- 监控斑马鱼的运动的损失（5〜10分钟）。
- 从冰箱中取出盖玻片/录音室。将腔体视显微镜的阶段。使用移液管，混合液滴和传输解决方案（鱼）的盖玻片/录音室几毫升1.2％的低熔点琼脂糖。
- 使用移液管尖的或细的钝针，在体视显微镜下，使背侧方面的鱼是暴露于琼脂糖凝胶表面的位置幼虫。允许琼脂糖硬化（5-10分钟），然后使用平面的锅铲传输琼脂b锁定到录音室成立于电钻机。
3。外场录制
- 添加2-5毫升斑马鱼的记录介质的录音室。如果药物的改变是必要的，在约1毫升/分钟的速率与记录溶液的灌注腔室。无氧化的录音解决方案是必要的。
- 将微小电极（尖端直径约为1微米，2-7MΩ）到放大器探头安装在一个三维的微操纵器。检查，显微操作器是在一个适当的位置，以允许的范围内的移动和调整。把微电极尖端平面的显微镜，走下舞台，和使用下一个点正上方和前面的斑马鱼的头稍微粗调。
- 随着“电流钳”模式零的电极中的放大器。
- 使用较低的粗调，使电极尖刚好接触的Surface的斑马鱼，稍前方的前脑。
- 使用精细调整步骤推进电极头，直到它穿刺皮肤的斑马鱼。允许沉降，然后提前几微米到前脑的电极。
- 记录电活动在电流钳模式使用Axoscope软件的。采集数据的采样速率为10 kHz。
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Representative Results
在图1中所示的实施例的电子照相记录的前脑琼脂嵌入的斑马鱼幼虫的癫痫样放电。在这些样本中的大振幅的多穗型脉冲放电引起的惊厥药浴应用，40毫米毛果芸香碱（A; 6 DPF）或1毫米印防己毒素（B; 8 DPF）。在这些记录中，固定，和琼脂嵌入式斑马鱼的连续监测90分钟。鱼这些记录的条件下继续生存24小时。药物添加到泳季介质和通常扩散到琼脂在30至45分钟之内引出在幼虫斑马鱼前脑的活动。此方法可以使用相对小的体积的药物溶液（2-5毫升），幼虫不需要连续灌注和可被记录在静态浴如有必要的结构。在面板C，一个自发的爆发放电的转基因斑马鱼在3 DPF记录是在斑马鱼记录介质。吗啉代寡核苷酸注射液在1-2细胞阶段的结节性硬化症（tsc1a），小儿癫痫与癫痫和自闭症的基因敲除表达。细胞外记录也可以得到从视顶盖。示例，请参见Baraban医师等人（2005年）9 Baraban医师等人 （2007）10。如这里所示，电气事件，可以在不同的波形和持续时间取决于用于诱发癫痫发作活性的作用机制。
图1。脉冲放电活动异常外的现场录音记录中的前脑，固定和琼脂嵌入式斑马鱼幼虫。记录电极置于下视觉在Olympus BX50正置显微镜的观察。录音（A）和（B）发起约40至45分钟后，药物的应用。 （A）多穗型放电记录在毛果芸香碱，毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂。 （B）突发的排放记录在印防己毒素，GABA-A受体拮抗剂。 （C）一个单一的多穗型脉冲放电记录从3 DPF斑马鱼幼虫注射用吗啉对tsc1a。
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Discussion
这里介绍的方法使细胞外记录大脑活动的一个非常敏感和快速的分析。这些录音是类似的脑电图（EEG）监测常用的评估存在的异常放电（ 即癫痫发作）在啮齿类动物模型癫痫11和患者12。细胞外记录可以结合药理的操作，如下所示。也可用于这些类型的记录，以评估潜在的癫痫表型的转基因斑马鱼。确定，在ENU的突变屏幕（见斑马鱼资源中心， http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ），或通过7和新兴TOL2转基因锌指核酸13技术的许多基因突变，突变的斑马鱼是常见的。这里展示的，快速的基因敲除吗啉代寡核苷酸的电生理监测，早在3 DPF提供了一个额外的方法来评估癫痫发作诱导基因缺陷。的记录电极可以容易地放置在任何斑马鱼结构包括视顶盖或小脑，并且如果需要的话，可以使用多个记录电极。这些录音的一个限制是，它是难以评估记录电极头相对于特定脑核的精确位置。斑马鱼进行荧光记者，在特定的细胞核或细胞类型的可用性将减轻此限制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想，感谢他们及早建立斑马鱼在实验室的彼得·卡斯特罗和马修Dinday。这项工作是由美国国立卫生EUREKA（＃R01NS079214-01）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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