Summary
Une méthode simple pour enregistrer les potentiels de champ extracellulaires dans le cerveau antérieur larvaire du poisson zèbre est décrite. La méthode fournit une robuste
Abstract
L'épilepsie touche près de 3 millions de personnes aux Etats-Unis et jusqu'à 50 millions de personnes à travers le monde. Définie comme la survenue de crises non provoquées spontanées, l'épilepsie peut être acquise à la suite d'une insulte au cerveau ou une mutation génétique. Les efforts de crises modèle chez l'animal ont principalement utilisé acquise insultes (médicaments anticonvulsivants, la stimulation ou une lésion cérébrale) et les manipulations génétiques (knockdown antisens, la recombinaison homologue ou transgénèse) chez les rongeurs. Le poisson zèbre constituent un système modèle vertébré 1-3 qui pourrait fournir une alternative intéressante aux rongeurs à base de recherche sur l'épilepsie. Le poisson zèbre sont largement utilisés dans l'étude de la génétique des vertébrés ou de développement, présentent un degré élevé de similitude génétique des mammifères et d'exprimer homologues pour environ 85% des mutations connues de l'homme épilepsie d'un seul gène. En raison de leur petite taille (4-6 mm de longueur), les larves de poisson zèbre peut être maintenu dans des volumes de fluide aussi bas que 100 pi au cours du développement précoce et arrayed en plaques multi-puits. Les réactifs peuvent être ajoutés directement à la solution dans laquelle les embryons se développent, ce qui simplifie l'administration du médicament et permettant une réaction rapide criblage in vivo de composés d'essai 4. Oligonucléotides synthétiques (morpholinos), mutagénèse, de zinc et de nucléases doigt approches transgéniques peut être utilisé pour générer rapidement démontable ou mutation du gène chez le poisson zèbre 5-7. Ces propriétés payer les études de poisson zèbre sans précédent avantage de pouvoir sur l'analyse statistique des rongeurs dans l'étude des troubles neurologiques comme l'épilepsie. Parce que le «gold standard» pour la recherche en épilepsie est de surveiller et d'analyser les rejets anormaux électriques qui prennent naissance dans une structure du cerveau central (c.-à-crises d'épilepsie), une méthode efficace pour enregistrer l'activité cérébrale chez les larves du poisson zèbre est décrite ici. Cette méthode est une adaptation de techniques classiques d'enregistrement extracellulaire et permet un fonctionnement stable à long terme de surveillance de l'activité cérébrale chez les larves de poisson zèbre intacte. Senregistrements amples sont présentés pour les crises aiguës induites par l'application de médicaments convulsivants bain et saisies spontanées enregistrées dans un poisson génétiquement modifié.
Protocol
1. Production d'oeufs et de Collection
- Le poisson zèbre élevage suit des procédures standard décrites précédemment 8. En bref, le poisson-zèbre adultes sont mis en place dans l'élevage de réservoirs avec des intercalaires en place. Lorsque les lumières dans la salle viennent le lendemain matin, les diviseurs sont retirés de l'élevage et les poissons des réservoirs sont autorisées environ 20 à 60 min de la période de reproduction sans être dérangé.
- Les oeufs de bassins d'élevage sont collectées dans une passoire et rincer à l'eau d'œuf. Les œufs sont ensuite transférés dans une boîte de Pétri avec de l'eau œuf. Les œufs non fécondés et les débris sont enlevés à l'aide d'une pipette de transfert.
- Lieu boîte de Petri contenant les œufs recueillis dans un incubateur (28-32 ° C). Après éclosion des œufs, environ deux jours après la fécondation (dpf), retirez chorion et tout autre débris avec une pipette de transfert.
- Le jour de votre choix après la fécondation (3 à 8 dpf) retirer boîte de Pétri contenant des larves nageant librement et placer sur paillasse à température ambiante.
- L'utilisation d'un extracteur micropipette, tirez de 1,2 mm de diamètre extérieur en verre de borosilicate capillaire dans deux aiguilles et les stocker dans un plat de Pétri de 150 mm ou une boîte vide pipette en posant sur des rampes Silly Putty. Aiguilles peut être tiré à l'avance. Différents OD capillaires en verre peuvent être utilisés en fonction du type de headstage amplificateur disponible.
- Backloading la microélectrode avec une solution d'enregistrement extracellulaire (2 M de NaCl) à l'aide d'une seringue de 1 ml avec un filtre Nalgene seringue (4-mm) et Microfil filament (Warner Instruments de précision) ci-joint. Secouer ou tapoter le bol vers la pointe de l'aiguille jusqu'à ce qu'il n'y pas ou peu de bulles restantes.
3. Immobilisation en gélose
- Préparer une solution fraîche de 1,2% d'agar bas point de fusion dans l'eau d'œuf. Solution d'agar place dans un ensemble bain-marie à 37 ° C ~
- Préparer une lamelle de chambre d'enregistrement et mettez au congélateur (5-10 minutes). La chambre d'enregistrement doit MATCh celui utilisé sur la plate-forme d'électrophysiologie. Nous utilisons un profil bas chambre ouverte imagerie diamant bain de Warner Instruments (modèle RC-26GLP).
- L'utilisation d'un Pasteur ou une pipette de transfert, placez un poisson zèbre larvaire dans une petite goutte d'eau oeuf dans une boîte de Pétri plat propre. À cette gouttelette, ajouter une goutte de solution contenant un anesthésique (0,02% tricaïne) et de l'agent paralysant (1 mg / ml α-bungarotoxine).
- Surveiller le poisson zèbre pour la perte de mouvement (5 à 10 mn).
- Enlever les lamelles / chambre d'enregistrement du congélateur. Placez chambre sur la scène d'un stéréomicroscope. À l'aide d'une pipette de transfert, mélanger quelques millilitres de 1,2% d'agarose à bas point de fusion avec des gouttelettes et de la solution de transfert (avec poisson) à la chambre de lamelle / enregistrement.
- En utilisant une pointe de pipette ou l'aiguille fine mousse, les larves de position sous la loupe binoculaire de telle sorte que la face dorsale du poisson est exposé à la surface du gel d'agarose. Laisser durcir agarose (5-10 minutes), puis en utilisant une spatule plate transfert du b agarverrouiller à une chambre d'enregistrement mis en place sur une plate-forme d'électrophysiologie.
3. Field Recording extracellulaire
- Ajouter 2-5 ml de supports d'enregistrement de poisson zèbre à la chambre d'enregistrement. Si des modifications sont nécessaires drogues, chambre perfuse avec une solution d'enregistrement à une vitesse d'environ 1 ml / min. Pas d'oxygénation de la solution d'enregistrement est nécessaire.
- Insérer une microélectrode (environ 1 um diamètre de pointe, 2-7 MQ) dans la headstage amplificateur monté sur un micromanipulateur à trois dimensions. Vérifier que le micromanipulateur est dans une position appropriée pour permettre une amplitude de mouvement et d'ajustement. Apportez la pointe de microélectrodes dans le plan de vision du microscope, haut au-dessus de la scène, et en utilisant un réglage grossier inférieure à un point juste au-dessus et légèrement en avant de la tête du poisson-zèbre.
- Avec l'amplificateur en «courant-clamp" mode zéro de l'électrode.
- Utiliser un réglage grossier inférieure de la pointe de l'électrode de sorte qu'il touche à peine le surface du poisson zèbre, un peu en avant du cerveau antérieur.
- En utilisant des étapes de réglage fin avancer la pointe de l'électrode jusqu'à ce qu'elle perfore la peau du poisson zèbre. Laisser reposer, puis avancez l'électrode de quelques microns dans le cerveau antérieur.
- Enregistrer l'activité électrique dans le courant de serrage mode à l'aide du logiciel Axoscope. Les données sont acquises à un taux d'échantillonnage de 10 kHz.
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Representative Results
Des exemples de saisie de type électrographique décharge enregistrée dans le cerveau antérieur de l'agar-noyé poisson zèbre est représenté sur la figure 1. Grande amplitude de décharge éclatement multi-pic dans ces échantillons a été évoqué par l'application de bain d'un médicament anticonvulsivant, 40 mM de pilocarpine (en A; 6 dpf) ou 1 mM picrotoxine (en B, 8 dpf). Dans ces enregistrements, immobilisé et l'agar-intégrés poisson zèbre sont surveillés en permanence jusqu'à 90 min. Les poissons restent viables dans ces conditions d'enregistrement pour un maximum de 24 heures. Médicaments sont ajoutés au milieu de baignade et diffuse normalement dans la gélose pour provoquer l'activité dans le cerveau antérieur larvaire poisson zèbre dans les 30 à 45 min. Cette méthode peut être utilisée avec des volumes relativement faibles de solution médicamenteuse (2-5 ml) sous forme de larves n'ont pas besoin d'une perfusion continue et peuvent être enregistrés dans une configuration bain statique si nécessaire. Dans le panneau C, une décharge spontanée rafale est indiqué pour un poisson zèbre génétiquement modifié à 3 dpf; enregistrement a été réalisé chez le poisson zèbredes supports d'enregistrement. Morpholino oligonucléotides injection au stade de la cellule 1-2 a été utilisé pour l'expression d'un gène knockdown pour la sclérose tubéreuse complexe (tsc1a), une forme pédiatrique de l'épilepsie associée à des convulsions et l'autisme. Enregistrements extracellulaires peuvent également être obtenus à partir du toit optique. Pour des exemples, voir Baraban et al. (2005) 9 ou Baraban et al. (2007) 10. Comme indiqué ici, les phénomènes électriques peuvent varier en forme d'onde et la durée selon le mécanisme d'action utilisé pour obtenir l'activité épileptique.
Enregistrements Figure 1. Champ extracellulaires de l'activité éclatement décharge anormale enregistrées dans le cerveau antérieur des larves de poisson zèbre immobilisé et l'agar-embedded. Électrodes d'enregistrement sont placés sous visuelleobservation sur un Olympus BX50 microscope droit. Dans des enregistrements (A) et (B) ont été entrepris environ 40 à 45 minutes après l'application du médicament. (A) Multi-pic enregistré en décharge pilocarpine, un antagoniste de l'acétylcholine récepteurs muscariniques. (B) les rejets en rafale enregistrée dans la picrotoxine, un antagoniste du récepteur GABA-A récepteur. (C) Une décharge seule rafale multi-pointes enregistrées à partir d'un poisson zèbre 3 dpf injecté avec un morpholino contre tsc1a.
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Discussion
La méthode d'enregistrement extracellulaire présentée ici permet une analyse très sensible et rapide de l'activité cérébrale. Ces enregistrements sont analogues à électroencéphalographique (EEG) de surveillance couramment utilisé pour évaluer la présence de décharges électriques anormales (par exemple, la saisie) dans des modèles rongeurs d'épilepsie 11 et les patients de 12. Enregistrements extracellulaires peuvent être combinés avec des manipulations pharmacologiques, comme indiqué ici. Ces types d'enregistrements peuvent également être utilisées pour évaluer le potentiel des phénotypes épileptiques chez le poisson zèbre génétiquement modifié. Le poisson-zèbre mutantes sont couramment disponibles pour de nombreuses mutations génétiques identifiés dans les écrans de mutagénèse ENU (voir le poisson-zèbre International Resource Center, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) ou par le biais émergents Tol2 transgénique 7 et doigt de zinc nucléotides 13 techniques. Comme démontré ici, inactivation génique rapide à l'aideoligonucléotides morpholino puis un suivi électrophysiologique dès le 3 dpf fournit une méthode supplémentaire pour évaluer les anomalies génétiques induisant la saisie. L'électrode d'enregistrement peut facilement être placé dans n'importe quelle structure le poisson-zèbre, y compris le tectum optique ou du cervelet, et plusieurs électrodes d'enregistrement peut être utilisé si nécessaire. Une limitation de ces enregistrements, c'est qu'il est difficile d'évaluer l'emplacement précis de la pointe de l'électrode d'enregistrement par rapport à noyaux spécifiques du cerveau. La disponibilité du poisson zèbre portant rapporteurs fluorescents dans les noyaux spécifiques ou des types de cellules permettra d'atténuer cette limitation.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
L'auteur tient à remercier Peter Castro et Matthew Dinday pour leurs premiers efforts pour mettre en place le poisson zèbre dans le laboratoire. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health EUREKA subvention (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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