Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Summary

Eine einfache Methode, um extrazelluläre Feldpotentiale in der larvalen Zebrafisch Vorderhirn aufnehmen beschrieben. Das Verfahren bietet eine robuste

Abstract

Epilepsie betrifft fast 3 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und bis zu 50 Millionen Menschen weltweit. Definiert als das Auftreten von spontanen Anfällen unprovozierten kann Epilepsie als Folge einer Beleidigung zum Gehirn oder einer genetischen Mutation erworben werden. Die Bemühungen um Modell Anfälle bei Tieren haben vor allem genutzt Beleidigungen (convulsant Drogen, Stimulation oder Hirnverletzungen) und genetische Manipulationen (Antisense-knockdown, homologe Rekombination oder Transgenese) in Nagetieren erworben. Zebrafische sind ein Wirbeltier Modellsystem ^1-3, die eine wertvolle Alternative zur Nagetier-basierte Epilepsieforschung bieten könnte. Zebrafische sind ausführlich in der Studie von Wirbeltier Genetik oder Entwicklung verwendet werden, weisen einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit genetischen Säugetieren und exprimieren Homologe für ~ 85% der bekannten menschlichen monogene Epilepsie Mutationen. Aufgrund ihrer geringen Größe (4-6 mm lang), kann Zebrafischlarven in Fluidvolumen so niedrig wie 100 ul werden während der frühen Entwicklung und arra gepflegtlungsgehilfen Multi-Well-Platten. Reagenzien können direkt zu der Lösung in dem Embryonen entwickeln, die Vereinfachung Arzneimittelverabreichung und die eine rasche in-vivo-Screening von Testverbindungen ⁴ zugesetzt werden. Synthetische Oligonukleotide (Morpholinos), Mutagenese, Zink-Finger-Nuklease und transgene Ansätze können verwendet werden, um rasch zu einer Gen-knockdown oder Mutation im Zebrafisch ^5-7 werden. Diese Eigenschaften leisten Zebrafisch Studien eine beispiellose statistische Analyse Vorteil gegenüber Nagetieren in der Studie von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie. Da der "Goldstandard" für Epilepsie Forschung ist es, zu überwachen und zu analysieren abnorme elektrische Entladungen, die in einer zentralen Struktur des Gehirns (dh, Krampfanfälle), ein Verfahren zur effizienten Aufnahme Hirnaktivität in larvalen Zebrafisch stammen wird hier beschrieben. Diese Methode ist eine Anpassung der herkömmlichen extrazellulären Aufnahmetechniken und ermöglicht einen stabilen langfristigen Überwachung der Hirnaktivität in intakten Zebrafisch-Larven. Sreichlich Aufnahmen werden für akute Anfälle durch Bad Anwendung convulsant Drogen und spontane Anfälle in einem genetisch veränderten Fischen aufgenommen induzierte gezeigt.

Protocol

Ein. Ei-Produktion und Sammlung

1. Zebrafisch Tierhaltung folgt Standardverfahren beschrieben ^8. Kurz gesagt, werden erwachsene Zebrafisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Kraft gesetzt. Wenn die Lichter im Zimmer am nächsten Morgen kommen, sind Trennwände aus Zuchtbecken und Fisch etwa 20 bis 60 min von ungestörten Paarungszeit dürfen entfernt.
2. Eier aus Zuchtbecken werden in einem Sieb gesammelt und gespült mit Ei Wasser. Eier werden dann in eine Petrischale mit Ei Wasser übertragen. Unbefruchteten Eiern und Schmutz werden mit einem Transferpipette.
3. Ort Petrischale mit der gesammelten Eier in einem Inkubator (28-32 ° C). Nach Eiern schlüpfen etwa zwei Tage nach der Befruchtung (dpf), zu entfernen Chorion und andere Ablagerungen mit einer Pipette.
4. Am gewünschten Tag nach der Befruchtung (3 bis 8 dpf) entfernen Petrischale mit frei schwimmende Larven und Platz auf dem Labortisch bei Raumtemperatur.

1. Mit einem Feinpipettenziehvorrichtung, ziehen ein 1,2 mm OD Borosilikatglas in zwei Nadeln und an einem 150 mm Petrischale oder leere Pipette box Kapillare durch Verlegung über Silly Putty Rampen. Needles können im Voraus gezogen werden. Unterschiedliche OD Glaskapillaren kann je nach Art des Verstärkers Headstage verfügbar werden.
2. Tendieren, die Mikroelektrode mit extrazellulären Aufzeichnungslösung (2 M NaCl) unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer Nalgene Spritzenfilter (4-mm) und Microfil Filament (Warner Precision Instruments) befestigt ist. Schütteln oder tippen Sie den Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Luftblasen mehr vorhanden sind.

3. Immobilisierung in Agar

1. Eine frische Lösung von 1,2% niedrigen Schmelzpunkt Agar in Ei Wasser. Ort Agarlösung in einem Wasserbad set bei ~ 37 ° C.
2. Bereiten Sie eine Deckglas mit Aufnahme Kammer und im Gefrierschrank (5-10 min). Die Aufnahme Kammer sollte MATCh, dass auf der Elektrophysiologie rig verwendet. Wir verwenden eine low-profile offene Raute Bad Bildgebung Kammer von Warner Instruments (Modell RC-26GLP).
3. Mit einer Pasteur oder Transferpipette, Ort ein Larvenstadium Zebrafisch in einem kleinen Tropfen von Ei-Wasser in einem sauberen Petrischale Platte. Zu dieser Tröpfchen, einen Tropfen Lösung, die ein Anästhetikum (0,02% Tricain) und lähmenden Mittels (1 mg / ml α-Bungarotoxin).
4. Überwachen Zebrafisch für den Verlust der Bewegung (5 bis 10 min).
5. Entfernen Sie das Deckglas / Aufnahme Kammer aus dem Gefrierschrank. Zeigen Kammer auf der Bühne ein Stereomikroskop. Mit einer Pipette, mischen einige ml von 1,2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt mit Tropfen und Transfer-Lösung (mit Fisch) auf dem Deckglas / Aufnahme Kammer.
6. Mit einer Pipettenspitze oder feinen stumpfen Nadel, Position Larven unter dem Stereomikroskop, so dass die Dorsalseite der Fische zu dem Agarosegel Oberfläche ausgesetzt ist. Lassen Agarose zu härten (5-10 min), dann mit einem flachen Spatel Übertragung der Agar-bsperren, um eine Aufnahme Kammer auf einem elektrophysiologischen rig eingestellt.

3. Extrazellulären Feld Recording

1. Fügen Sie 2-5 ml Zebrafisch Speichermedien zur Aufnahme Kammer. Wenn Arzneimittel Änderungen notwendig, perfuse Kammer mit Aufzeichnungslösung mit einer Rate von etwa 1 ml / min. Kein Oxygenierung des Aufzeichnungs-Lösung erforderlich ist.
2. Einfügen einer Mikroelektrode (ca. 1 um Spitzendurchmesser, 2-7 MOhm) in den Verstärker Headstage auf einem dreidimensionalen Mikromanipulator montiert. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in der richtigen Position, um für eine Reihe von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringt die Mikroelektrode Spitze in der Sichtebene des Mikroskops, hoch über der Bühne und mit Grobeinstellung geringeren zu einem Punkt unmittelbar über und etwas vor dem Kopf des Zebrafisch.
3. Mit dem Verstärker in "Current-Clamp"-Modus Null die Elektrode.
4. Mit Grobeinstellung niedriger die Elektrodenspitze so dass es berührt nur die surface des Zebrafisches, leicht vor dem Vorderhirn.
5. Mit Feineinstellung Schritte voran die Elektrodenspitze bis er die Haut des Zebrafisch durchsticht. Absetzen lassen und dann voran die Elektrode mehreren Mikrometern in Vorderhirn.
6. Notieren elektrische Aktivität im Current-Clamp-Modus mit Axoscope Software. Daten werden mit einer Abtastrate von 10 kHz erfasst.

Representative Results

Beispiele für elektrografische anfallsähnliche Entladung im Vorderhirn eines Agar-embedded Zebrafischlarven aufgezeichnet sind in Abbildung 1 gezeigt. Oder 1 mM Picrotoxin (in B; 8 dpf); großer Amplitude Multi-Impuls-Burst-Entladung in diesen Proben wurde durch Anwendung eines Bades Konvulsivum Wirkstoff, 40 mM Pilocarpin (6 dpf in A) hervorgerufen. In diesen Aufnahmen, immobilisiert und Agar-Zebrafisch eingebettet werden kontinuierlich für bis zu 90 min verfolgt. Fisch bleibt unter diesen Aufnahmebedingungen lebensfähigen für bis zu 24 Stunden. Drogen sind in die Bade-Medium und in der Regel in den Agar diffundieren, um die Aktivität in der larvalen Zebrafisch Vorderhirn innerhalb von 30 bis 45 min zu entlocken aufgenommen. Dieses Verfahren kann mit relativ kleinen Volumina Medikamentenlösungsbehälter (2-5 ml) als Larven eingesetzt werden erfordern keine kontinuierliche Perfusion und kann in einem statischen Bad Konfiguration ggf. aufzuzeichnen. In Abbildung C ist eine spontane Entladung Burst für einen genetisch modifizierten Zebrafisch bei 3 dpf gezeigt; Aufzeichnung wurde auf Zebrafisch gemachtAufzeichnungsmedien. Morpholino-Oligonukleotid Injektion an der 1-2 Zellstadium wurde Knockdown Expression eines Gens für tuberöser Sklerose (tsc1a), einem pädiatrischen Form von Epilepsie mit Krampfanfällen und Autismus assoziiert verwendet. Extrazellulären Aufzeichnungen können auch von der Optik tectum erhalten werden. Beispiele finden Baraban et al. (2005) ⁹ oder Baraban et al. (2007) ^10. Wie hier gezeigt, können die elektrischen Ereignisse in Wellenform und Dauer abhängig von der Wirkmechanismus zur epileptischer Aktivität auslösen variieren.

Abbildung 1. Extrazelluläre field recordings von abnormalen Burst Entladung Aktivität im Vorderhirn von immobilisierten und Agar-embedded Zebrafischlarven aufgezeichnet. Recording Elektroden unter visueller positioniertBeobachtung auf einem Olympus BX50 aufrechten Mikroskop. Aufnahmen in (A) und (B) wurden etwa 40 bis 45 min nach Drogen-Anwendung initiiert. (A) Multi-Spike Entladung in Pilocarpin erfasst, ein Muscarin-Acetylcholin-Rezeptor-Antagonist. (B) Burst Entladungen aufgezeichnet Picrotoxin, ein GABA-A-Rezeptor-Antagonist. (C) Ein einziges Multi-Spike Burst Entladung aus einem 3 dpf Zebrafischlarven aufgezeichnet mit einer Morpholino gegen tsc1a injiziert.

Discussion

Die extrazelluläre Aufzeichnung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sehr sensitive und schnelle Analyse der Hirnaktivität. Diese Aufnahmen sind analog zu elektroenzephalographischen (EEG) Überwachen häufig verwendet, um das Vorhandensein von anormalen elektrischen Entladung (dh Anfall) in Nagetier-Modellen von Epilepsie ¹¹ und ¹² Patienten auszuwerten. Extrazelluläre Aufnahmen können mit pharmakologischen Manipulationen kombiniert werden, wie hier gezeigt. Diese Arten von Aufzeichnungen können auch verwendet werden, um potentielle epileptischen Phänotypen in gentechnisch veränderten Zebrafisch auszuwerten. Mutant Zebrafisch sind allgemein verfügbar für viele Genmutationen in ENU Mutagenese (siehe Zebrafisch International Resource Center, identifiziert http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) oder durch Schwellenländer Tol2 transgenen ⁷ und Zink-Finger-Nukleotid ¹³ Techniken. Wie hier gezeigt, schnelle Gen knockdown mitMorpholino Oligonukleotide durch elektrophysiologische Überwachung so früh wie 3 dpf gefolgt sieht eine zusätzliche Methode der Beschlagnahme induzierende Gen-Defekte zu beurteilen. Die Aufzeichnungselektrode kann leicht in jeder Zebrafisch Struktur einschließlich der optischen Tectums oder Kleinhirn platziert werden, und mehrere Aufzeichnungs-Elektroden können bei Bedarf verwendet werden. Eine Einschränkung bei diesen Aufnahmen ist, dass es schwierig ist, die genaue Position der Aufnahme Elektrodenspitze relativ zu spezifischen Gehirnkernen beurteilen. Die Verfügbarkeit von Zebrafisch Durchführung fluoreszierenden Reporter in bestimmten Kernen oder Zelltypen zu mildern diese Einschränkung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low melting	Fisher-Scientific	BP1360-100	Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0.02%
α-bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 mg/ml
Capillary glass tubing	Warner Instruments	G120TF-3	Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier	Warner Instruments	PC-505B	We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Filter/amplifier	Cygnus Technology	FLA-01	We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Axon A/D board and Axoscope software	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2	Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions.
Egg water	Instant Ocean		3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water