Summary
ゼブラフィッシュ幼生前脳における細胞外電場電位を記録するためのシンプルな方法が記載されている。方法は、堅牢を提供
Abstract
てんかんは、米国では約300万人、最大50万人が世界中に影響を与えます。自発的ないわれのない発作の発生として定義され、てんかんは、脳や遺伝子変異に対する侮辱の結果として取得することができる。動物でのモデル発作への取り組みは、主にげっ歯類で取得侮辱（痙攣薬、刺激や脳損傷）と遺伝子操作（アンチノックダウン、相同組換えや遺伝子組み換え）を利用してきました。ゼブラフィッシュは、げっ歯類ベースのてんかんの研究に貴重な代替手段を提供することができる脊椎動物モデル系1〜3アール。ゼブラフィッシュは脊椎動物遺伝学や開発の研究で広く使用され、哺乳動物への遺伝的類似性の高度を示し、既知のヒト単一遺伝子てんかん変異の約85％のために同族を表現しています。その小さなサイズ（長さ4〜6 mm）のため、ゼブラフィッシュの幼虫を早期に開発し、ARRA中に100μlのできるだけ低い流体ボリュームで維持することができるマルチウェルプレートでyed。試薬は、薬物投与を簡素化し、試験化合物4 の in vivoスクリーニングで急速可能胚が開発した溶液に直接添加することができる。合成オリゴヌクレオチド（モルホリノ）、突然変異誘発、ジンクフィンガーヌクレアーゼとトランスジェニックアプローチが急速に5月7日 、ゼブラフィッシュの遺伝子ノックダウンや変異を生成するために使用することができます。これらのプロパティは、ゼブラフィッシュの研究にてんかんなどの神経疾患の研究では、げっ歯類の上前例のない統計的検出力分析の利点を与える。てんかん研究のための"ゴールドスタンダード"は、中央脳構造（ すなわち 、発作）、効率的に幼虫のゼブラフィッシュの脳活動を記録する方法に由来する異常な放電を監視し、分析することであるため、ここで説明されます。この方法は、従来の細胞外記録技術を適応したものです、無傷のゼブラフィッシュの幼虫の脳活動の長期安定的な監視が可能となります。 S十分な録音が痙攣薬、遺伝子組み換え魚に記録されている自発的な発作の浴アプリケーションによる急性発作のために示されている。
Protocol
1。卵の生産とコレクション
- ゼブラフィッシュの飼育は、以前8に記載の標準的な手順に従います。簡単に言えば、成人ゼブラフィッシュは、所定の位置に仕切りとタンク繁殖に設定されています。部屋の明かりは、次の朝に来るとき、分周器は繁殖水槽や魚から削除され邪魔されずに、相手の時間の約20〜60分を許可されています。
- 繁殖タンクから卵がストレーナに集められ、卵水で洗浄する。卵は、その後、卵を水でペトリ皿に移しています。未受精卵とデブリはホールピペットを用いて除去される。
- インキュベーター（28から32℃）に収集卵を含む場所シャーレ。卵が孵化した後、受精後（DPF）を2日程度、ホールピペットで絨毛膜および他の残骸を削除します。
- 希望する曜日受精後（3〜8 DPF）に室温で実験台の上で自由に泳いで幼虫と場所を含むペトリ皿を取り外します。
- マイクロピペットプラーを使用して、1.2ミリメートルODホウケイ酸ガラスは、愚かなパテのランプの上に敷設して150ミリメートルペトリ皿または空ピペットボックス内の2本の針や店舗へのキャピラリ引っ張る。針は事前にプルアップすることができます。異なる径ガラスキャピラリーは、使用可能なアンプヘッドステージの種類に応じて使用することができます。
- ナルゲンシリンジフィルター（4 mm）とMicrofilフィラメント（ワーナー精密機器）を添付して1ミリリットルのシリンジを用いて、細胞外記録溶液（2M NaCl）で荷物を積み込む微小電極。残りのほとんどまたは全く泡がなくなるまで、針の先端に向かってボーラスを振ったり、タップします。
3。寒天で固定化
- 卵の水の1.2％低融点寒天の新鮮な溶液を調製します。 〜37℃の水浴セットに置き寒天溶液
- 冷凍庫内の記録室及び場所（5〜10分）でカバースリップを準備します。記録室はMATCべき電気生理学リグで使用する時間。私たちは、ワーナー·インスツルメンツ（モデル、RC-26GLP）からロープロファイルのオープンダイヤモンド風呂イメージングチャンバーを使用しています。
- パスツールピペットまたは転送、場所きれいなペトリ皿プレートの卵の水の小滴中1幼虫のゼブラフィッシュを用いた。この液滴に、麻酔（0.02％tricaine）と麻痺剤（1 mg / mlのα-ブンガロトキシン）を含む溶液の液滴を追加します。
- 運動の損失（5〜10分）のためにゼブラフィッシュを監視します。
- 冷凍庫からカバーガラス/記録チャンバーを取り外します。実体顕微鏡のステージ上でチャンバーを置きます。ピペットを使用して、液滴とカバースリップ/記録室へ転送ソリューション（魚付き）、1.2％低融点アガロースの数mlを混ぜる。
- ピペットチップまたは微鈍針、魚の背側面をアガロースゲル表面に露出されるように、実体顕微鏡下で位置の幼虫を用いた。次に平らなへら転送を寒天bを用い、硬化（5-10分）にアガロースを許可電気生理学リグ上で設定記録チャンバーにロックします。
3。細胞外のフィールド録音
- 録音室にゼブラ記録媒体の2-5 mlを加える。薬の変更は、約1ml /分の速度で記録液で灌流チャンバー必要な場合。記録のソリューションも、酸素は必要ありません。
- 三次元マニピュレーターにマウントアンプヘッドステージに微小電極（約1μmの先端径、MΩの2-7）を挿入します。マニピュレーターは、動きと調整の範囲を可能にするために適切な位置にあることを確認します。オフステージの高い、顕微鏡の視野の面に微小電極の先端を持って来て、すぐ上と若干ゼブラフィッシュの頭の前のポイントに低い粗調整を使用しています。
- "電流クランプ"モードゼロ電極でアンプ付き。
- それだけでsを触れるように下部電極の先端を粗調整を使用して少し前脳の前のゼブラフィッシュのurface、。
- それはゼブラフィッシュの皮膚を穿刺するまで微調整の手順を使用すると、電極先端を進める。前脳に数ミクロンを解決してから電極を前進させることができます。
- Axoscopeソフトウェアを使用して、電流クランプ·モード内の電気的活動を記録します。データは、10kHzのサンプリングレートで取得されています。
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Representative Results
寒天包埋したゼブラフィッシュ幼生の前脳に記録されている電子写真発作のような放電の例を図1に示す。または1mMのピクロトキシン（Bの、8 DPF）、これらの試料中の大振幅マルチスパイクバースト放電が痙攣薬浴のアプリケーション、40mMのピロカルピン（6 DPFにおける）によって誘発された。これらの録音では、固定化され、寒天包埋したゼブラフィッシュを連続最大90分まで監視されています。魚には、最大24時間にするためには、これらの記録条件生き続ける。薬は入浴を培地に添加し、30から45分以内に幼虫ゼブラフィッシュ前脳での活性を誘発する寒天に正常に拡散されています。幼虫は連続灌流を必要とせず、必要に応じて静的風呂の設定で記録することができますので、この方法は、薬液の比較的小容量（2-5 ml）で使用することができます。パネルCでは、自発的なバースト放電は3 DPFにおける遺伝的に修飾されたゼブラフィッシュのために示されていると、記録は、ゼブラフィッシュで行われました記録媒体。 1から2細胞期モルホリノオリゴ注入は結節性硬化症複合体（tsc1a）、発作、自閉症に関連てんかんの小児フォームのための遺伝子のノックダウン式に使用されていました。細胞外の録音はまた視蓋から入手することができます。例については、Baraban らを参照してください（2005年）9またはBaraban ら （2007）10。ここに示されているように、電気のイベントは発作活動を誘発するために使用作用機序に応じて波形とデュレーションが異なる場合があります。
図1固定化され、寒天包埋ゼブラフィッシュ幼生の前脳に記録異常バースト放電活性の細胞外フィールドレコーディング。記録電極は、ビジュアルの下に配置されているオリンパスBX50正立顕微鏡で観察。録音中に（A）と（B）は、薬剤塗布後約40〜45分を開始した。 （A）はマルチスパイク放電がピロカルピン、ムスカリン性アセチルコリン受容体拮抗薬に記録されます。 （B）はバースト放電は、ピクロトキシンのGABA-A受容体拮抗薬を記録した。 tsc1aに対するモルホリノを注射3 DPFのゼブラフィッシュの幼虫から記録された（C）は、単一のマルチスパイクバースト放電。
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Discussion
ここに提示された細胞外記録法は、脳活動の非常に高感度で迅速な分析を可能にします。これらの録音は、一般的にてんかん患者11と12のげっ歯類モデルにおける異常放電（ すなわち 、発作）の存在を評価するために使用する脳波計（EEG）の監視に類似しています。ここに示されているように外の録音は、薬理学的操作と組み合わせることができます。録音のこれらの種類は遺伝的に修飾されたゼブラフィッシュにおける潜在てんかんの表現型を評価するために用いることができる。変異体ゼブラフィッシュは、ENUミュータジェネシス画面で特定された多くの遺伝子変異のために一般的に利用可能である（ゼブラフィッシュ国際リソースセンターを参照してくださいhttp://zebrafish.org/zirc/home/guide.phpを ）または新興Tol2のトランスジェニック7とジンクフィンガーヌクレオチド13技術を通して。使用して、ここで示したように、急速な遺伝子ノックダウン3 DPF早けれ電気生理学的モニタリング続いモルホリノオリゴヌクレオチドは、発作を誘発する遺伝子の欠陥を評価するための追加のメソッドを提供します。記録電極は簡単に視蓋や小脳を含む任意のゼブラフィッシュ構造に配置することができ、必要に応じて、複数の記録電極を使用することができます。これらの録音の制限は、特定の脳核からの相対記録電極先端の正確な位置を評価することは困難であるということです。特定の核または細胞型で蛍光レポーターを運ぶゼブラフィッシュの可用性は、この制限を緩和します。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、実験室でゼブラフィッシュを確立するために彼らの初期の努力のためにピーター·カストロとマシューDindayに感謝したいと思います。この作品は、健康EUREKAの助成金（＃R01NS079214-01）の国立研究所によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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