Summary
애벌레의 zebrafish forebrain에서 세포 필드 잠재력을 기록하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 강력한를 제공합니다
Abstract
간질은 미국에서 3 백만 명에 이르는 사람들과 최대 50,000,000명 전 세계적으로 영향을 미칩니다. 자연 부당한 발작의 발생으로 정의, 간질은 뇌 또는 유전자 변이에 대한 모욕의 결과로 획득 할 수 있습니다. 동물 모델 압류에 대한 노력은 주로 활용 설치류의 모욕 (convulsant 약물, 자극 또는 뇌 손상)과 유전자 조작을 (안티센스 최저, 상동 재조합 또는 transgenesis) 획득했습니다. Zebrafish는 쥐 기반 간질 연구에 귀중한 대안을 제공 할 수 척추 모델 시스템 1~3아르. Zebrafish는 척추 동물의 유전자 또는 개발 연구에서 널리 사용되며, 포유 동물에 대한 유전 적 유사성의 높은 학위를 전시 및 알려진 인간 단일 유전자 간질 변이 ~ 85 %를 homologs을 표현한다. 때문에 자신의 작은 크기 (길이 4~6mm)로, zebrafish의 유충은 초기 개발 및 arra 동안 100 μl의 낮은 유체 볼륨에 유지 할 수 있습니다멀티 잘 접시에 yed. 시약은 배아는 약물 관리를 단순화하고 테스트 화합물 4 생체 검사에서 빠른 있도록 개발 된 솔루션에 직접 추가 할 수 있습니다. 합성 oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, 아연 손가락 nuclease와 유전자 변형 접근 방식은 빠른 속도로 5-7 zebrafish의 유전자 최저 또는 돌연변이를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 속성은 zebrafish 연구 한테 그런 간질과 같은 신경 질환의 연구에서 동물에 비해 전례없는 통계 전력 분석 이점을 여유. 간질 연구를위한 "금 표준"중앙 뇌 구조 (즉, 발작), 효율적으로 애벌레의 zebrafish의 뇌 활동을 기록하는 방법에 발생한 이상 전기 방전을 감시하고 분석하는 것입니다 때문에 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 기존의 세포 녹화 기술의 적응이며, 그대로 zebrafish 애벌레의 뇌 활동의 안정적인 장기 모니터링 할 수 있습니다. 에스충분한 녹음은 유전자 변형 물고기에 기록 convulsant 마약과 자연 발작의 목욕 응용 프로그램에 의해 유도 급성 발작에 표시됩니다.
Protocol
1. 계란 생산 및 수집
- Zebrafish 축산는 이전 8 설명한 표준 절차를 따릅니다. 간단히, 성인 zebrafish는 장소에 디바이더와 탱크를 사육에 자리 잡고 있습니다. 방에 불이 다음 아침에 왔을 때, 디바이더는 탱크와 생선이 방해받지 결합 시간의 약 20-60 분 수 있습니다 사육에서 제거됩니다.
- 번식 탱크에서 달걀은 스트레이너에 수집 달걀 물에 헹구어 있습니다. 달걀은 다음 달걀 물과 페트리 접시으로 전송됩니다. Unfertilized 달걀과 잔해가 전송 피펫을 사용하여 제거됩니다.
- 보육에 수집 된 계란 (28-32 ° C)를 포함하는 장소 페트리 접시. 계란 이틀 후 수정을 (dpf) 주변, 부화 후, 전송 피펫과 융모막 및 기타 이물질을 제거합니다.
- 원하는 일에 후 수정을 (3-8 dpf)는 실온에서 실험실 벤치에서 자유롭게 수영 유충과 장소를 포함하는 페트리 접시를 제거합니다.
- micropipette의 풀러를 사용하여 1.2 mm OD 붕규산 유리는 바보 퍼티 램프 위에 누워하여 150mm 페트리 접시 또는 빈 피펫 상자에 두 개의 바늘과 가게에 모세관 당긴다. 바늘 사전에 당겨 수 있습니다. 다른 OD 유리 모세 혈관이 가능한 앰프 headstage의 종류에 따라 사용할 수 있습니다.
- Nalgene 주사기 필터 (4 mm)과 Microfil 필라멘트 (워너 정밀 계측기) 첨부와 1 ML의 주사기를 사용하여 세포 녹화 솔루션 (2 M NaCl)과 Backload microelectrode. 남은 몇 또는 전혀 거품이 될 때까지 바늘 끝 방향으로 bolus를 흔들어하거나 누릅니다.
3. 한천의 고정
- 계란 물에 1.2 % 낮은 녹는 점 한천의 새로운 솔루션을 준비합니다. ~ 37 ° C.에서 물 목욕 세트의 장소 한천 솔루션
- 냉장고에 기록 챔버 및 장소 (5-10 분)와 coverslip을 준비합니다. 녹음 챔버 matc해야합니다H는하는 전기 생리학의 장비에 사용됩니다. 우리는 워너 악기 (모델 RC-26GLP)에서 로우 프로파일 공개 다이아몬드 목욕 이미징 챔버를 사용합니다.
- 파스퇴르 또는 전송 피펫, 깨끗한 페트리 접시 판에 달걀 물을 작은 물방울에 놓으 애벌레의 zebrafish을 사용합니다. 이 비말에, 마취 (0.02 % tricaine)과 전신 마비 에이전트 (1 MG / ML α-bungarotoxin)를 포함하는 솔루션의 비말을 추가합니다.
- 운동의 손실 (5-10 분)에 대한 zebrafish를 모니터링합니다.
- 냉동실에서 coverslip / 녹음 챔버를 제거합니다. stereomicroscope의 무대에 챔버를 놓습니다. 전송 피펫 사용 비말과 coverslip / 녹음 챔버로 전송 솔루션 (물고기)에 1.2 % 낮은 녹는 점 아가로 오스의 여러 ML을 섞는다.
- 피펫 팁 또는 고급 무딘 바늘, 물고기의 등 부분은 아가로 오스 겔 표면에 노출 될 수 있도록 stereomicroscope 아래에 위치 애벌레을 사용합니다. 다음 평면 주걱 전송에게 한천 B를 사용하여 강화 (5-10 분)에 아가로 오스 허용전기 생리학의 유정에서 설정 기록 챔버에 고정.
3. 세포 필드 레코딩
- 녹음 챔버에 zebrafish 기록 매체 2-5 ML을 추가합니다. 약물 변경 사항은 약 1 ML / 분의 속도로 레코딩 솔루션을 필요 perfuse 챔버 경우. 녹화 솔루션의 어떠한 산소가 필요하지 않습니다.
- 3 차원 micromanipulator에 장착 증폭기 headstage에 microelectrode를 (약 1 μm 팁 직경 MΩ 2-7)를 넣습니다. micromanipulator은 움직임과 조정의 범위를 허용 할 수있는 적절한 위치에 있는지 확인합니다. 무대에서 내려 높은 현미경의 전망의 비행기, 그리고 위하고 약간 zebrafish의 머리 앞의 지점으로 낮은 정밀 조정을 사용하여에 microelectrode 팁을 가져와.
- "전류 클램프"모드 제로 전극의 앰프를 갖추고 있습니다.
- 그냥 s를 만지고 있도록 정밀 조정 할 낮은 전극 팁을 사용하여약간 forebrain 앞의 zebrafish의 urface.
- 이 zebrafish의 피부를 구멍까지 미세 조정 단계를 사용하면 전극 팁을 부활 시켰습니다. forebrain에 몇 미크론를 해결 한 후 전극을 향상 할 수 있도록 허용합니다.
- Axoscope 소프트웨어를 사용하여 전류 클램프 모드에서 전기 활동을 기록합니다. 데이터는 10 kHz에서의 샘플링 속도에서 획득됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
한천 - 임베디드 zebrafish 애벌레의 forebrain에 기록 electrographic 발작과 같은 방전의 예는 그림 1에 표시됩니다. 또는 1 밀리미터 picrotoxin (B에, 8 dpf),이 샘플에서 큰 진폭 멀티 스파이크 버스트 방전은 convulsant 약의 목욕 응용 프로그램을, 40 밀리미터 pilocarpine (6 dpf의)에 의해 evoked했다. 이 음반에 고정하고 한천 - 임베디드 zebrafish는 지속적으로 90 분에에 모니터링하고 있습니다. 물고기는 최대 24 시간까지에 대해 이러한 녹음 조건 하에서 가능한 상태로 유지됩니다. 약물은 입욕 매체와 30-45 분 이내에 애벌레의 zebrafish forebrain 활동을 유도 할 수있는 한천로 일반적으로 확산에 추가됩니다. 이 방법은 애벌레로 약물 솔루션의 비교적 작은 볼륨 (2-5 ML)와 함께 사용할 수는 지속적으로 살포를 필요로하지 않고 정적 목욕 구성 필요한 경우에 기록 할 수 있습니다. 패널 C에서 자발적 버스트 방전은 3 dpf에서 유전자 변형 zebrafish에 표시되며 녹음 zebrafish에되었다기록 미디어. 1-2 세포 단계에서 Morpholino oligonucleotide 주입은 결절 경화증 복합 (tsc1a), 발작과 자폐증과 관련된 간질의 소아 양식에 대한 유전자의 최저 표현하는 데 사용되었습니다. 세포 녹음도 광 tectum에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어, Baraban 외를 참조하십시오. (2005) 9 Baraban 외. (2007) 10. 여기에 도시 된 바와 같이, 전기 이벤트가 파형과 발작 활동을 유도하는 데 사용되는 작업의 메커니즘에 따라 기간에 다를 수 있습니다.
이상 버스트 배출 활동의 그림 1. 세포 필드 레코딩 고정 및 한천 - 임베디드 zebrafish 애벌레의 forebrain에 기록. 녹화 전극은 시각에 따라 위치가 결정됩니다올림푸스 BX50 수직 현미경에서 관찰. 에서 녹음 (A)와 (B) 약물 신청 후 약 40-45 분을 시작했다. pilocarpine에 기록 (A) 멀티 스파이크 방전, muscarinic 아세틸 콜린 수용체 길항제. (B) 버스트 방전은, picrotoxin에서 GABA-A 수용체 길항제를 기록했습니다. (C) 3 dpf의 zebrafish의 애벌레에서 녹화 한 멀티 스파이크 버스트 방전 tsc1a에 대한 morpholino로 주입.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 제시된 세포 녹화 방법은 뇌 활동의 매우 민감하고 빠른 분석이 가능합니다. 이 음반은 일반적으로 간질 환자 11 12 쥐 모델에서 비정상적인 전기 방전 (즉, 발작)의 존재를 평가하는 데 사용 electroencephalographic (EEG) 모니터링 유사합니다. 여기에 표시된대로 세포 녹음, 약리 조작과 함께 사용할 수 있습니다. 레코딩 이러한 유형의도 유전자 변형 zebrafish 잠재적 인 간질 phenotypes을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 돌연변이 zebrafish는 ENU mutagenesis의 화면 (Zebrafish 국제 리소스 센터를 참조에서 확인 많은 유전자 변이에 일반적으로 사용할 수 있습니다 http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php을 ) 또는 신흥 Tol2 유전자 변형 7 아연 손가락 염기 13 기술을 통해. 사용 여기 보여준 바와 같이, 신속한 유전자 최저3 dpf 초부터 electrophysiological 모니터링에 이어 morpholino의 oligonucleotides는 발작을 유발하는 유전자 결함을 평가하는 추가 방법을 제공합니다. 기록 전극 쉽게 광 tectum이나 소뇌를 포함하여 zebrafish 구조에 배치 할 수 있으며, 필요한 경우 여러 기록 전극을 사용할 수 있습니다. 이 녹음의 제한은 특정 뇌 핵에 비해 기록 전극 팁의 정확한 위치를 평가하기 어려운 것입니다. 특정 핵 또는 셀 유형에 형광 기자를 들고 zebrafish의 사용 가능 여부는이 제한을 완화합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 실험실에서 zebrafish를 확립하기 위해 초기 노력에 피터 카스트로와 매튜 Dinday 감사드립니다. 이 작품은 건강 유리카 기금 (# R01NS079214-01)의 국립 연구소에 의해 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
