Forebrain Elektrofysiologisk opptak i larve Sebrafisk

Summary

En enkel metode for å registrere ekstracellulære felt potensialer i larve sebrafisk forhjernen beskrives. Metoden gir en robust

Abstract

Epilepsi påvirker nesten 3 millioner mennesker i USA og opp til 50 millioner mennesker verden over. Definert som forekomsten av spontane uprovoserte anfall, kan epilepsi erverves som følge av en fornærmelse mot hjernen eller en genetisk mutasjon. Arbeidet med å modellere anfall hos dyr har primært benyttet kjøpt fornærmelser (convulsant narkotika, stimulering eller hjerneskade) og genetiske manipulasjoner (antisens knockdown, homolog rekombinasjon eller transgenesis) i gnagere. Sebrafisk er et virveldyr modellsystem ^1-3 som kan gi et verdifullt alternativ til gnager-baserte epilepsi forskning. Sebrafisk brukes mye i studiet av vertebrate genetikk eller utvikling, utviser en høy grad av genetisk likhet til pattedyr og uttrykke homologer for ~ 85% av de kjente humane enkelt-gen epilepsi mutasjoner. På grunn av sin lille størrelse (4-6 mm i lengde), kan sebrafisk larver opprettholdes i væske volumer så lavt som 100 ul under tidlig utvikling og arrayed i multi-brønn plater. Reagenser kan tilsettes direkte til oppløsningen hvor embryoer utvikler, forenkle legemiddeladministrasjon og muliggjør rask in vivo screening av testforbindelser ^4. Syntetiske oligonukleotider (morpholinos), mutagenese, sink finger nuclease og transgene tilnærminger kan brukes til raskt å generere genet knockdown eller mutasjon i sebrafisk ^5-7. Disse egenskapene råd sebrafisk studier en enestående statistisk maktanalyse fordel over gnagere i studiet av nevrologiske forstyrrelser slik som epilepsi. Fordi "gullstandarden" for epilepsi forskning er å overvåke og analysere unormale elektriske utladninger som kommer i en sentral hjernestruktur (dvs. anfall), en metode for å effektivt ta opp hjernens aktivitet i larve sebrafisk er beskrevet her. Denne metoden er en tilpasning av konvensjonelle ekstracellulære opptak teknikker og gir mulighet for stabil langsiktig overvåking av hjernens aktivitet i intakt sebrafisk larver. Srikelig opptak vises for akutte anfall indusert av bad anvendelse av convulsant narkotika og spontane anfall registrert i en genmodifisert fisk.

Protocol

1. Eggproduksjon og innkreving

1. Sebrafisk reindrift følger standard prosedyrer beskrevet tidligere ^8. Kort, er voksne sebrafisk satt opp i avl tanker med skillevegger på plass. Når lysene i rommet kommer på morgenen, er skillevegger fjernet fra avl tanker og fisk er tillatt omtrent 20 til 60 minutter av uforstyrret parring tid.
2. Egg fra avl tanker samles i en sil og skylles med egg vann. Egg er deretter overført til en petriskål med eggevannet. Ubefruktet egg og rusk fjernes ved hjelp av en overføringspipetten.
3. Plass petriskål inneholdende de innsamlede egg i en inkubator (28-32 ° C). Etter eggene klekkes, rundt to dager etter befruktning (DPF), fjern chorion og annen skitt med en overføringspipetten.
4. På ønsket dag etter befruktning (3-8 DPF) fjerne petriskål inneholder frittsvømmende larver og sted på lab benken i romtemperatur.

1. Ved hjelp av en mikropipette avtrekker, trekke en 1,2 mm OD borsilikatglass kapillær inn to nåler og lagrer i en 150 mm petriskål eller tom pipette boksen ved å legge over dum kitt ramper. Nåler kan trekkes på forhånd. Different OD glass kapillærer kan brukes avhengig av type av forsterkeren headstage tilgjengelig.
2. Returlast mikroelektroden med ekstracellulære opptak løsning (2 M NaCl) med en 1 ml sprøyte med en Nalgene sprøyte filter (4 mm) og Microfil filament (Warner Precision Instruments) vedlagt. Rist eller bank bolus mot nålespissen før det er få eller ingen bobler er igjen.

3. Immobilisering i Agar

1. Forbered en frisk oppløsning av 1,2% lavt smeltepunkt agar i eggevannet. Plass agaroppløsningen i et vannbad innstilt på ~ 37 ° C.
2. Forbered et dekkglass med innspilling kammer og plasser i fryseren (5-10 min). Innspillingen kammeret bør match som brukes på elektrofysiologi riggen. Vi bruker en lav profil åpen diamant bad bildebehandling kammer fra Warner Instruments (modell RC-26GLP).
3. Ved hjelp av en Pasteur eller overføringspipetten, plasser en larve sebrafisk i en liten dråpe egg vann i en ren petriskål plate. Til denne dråpe, legge en dråpe oppløsning inneholdende en bedøvelse (0,02% Tricaine) og lammende middel (1 mg / ml-α bungarotoxin).
4. Overvåke sebrafisk for tap av bevegelse (5 til 10 min).
5. Fjern dekkglasset / opptak kammer fra fryseren. Plasser kammer på scenen av en stereomikroskop. Ved hjelp av en overføring pipette blande flere ml 1,2% lavt smeltepunkt agarose med dråpe og overføring løsning (med fisk) til dekkglasset / opptak kammer.
6. Ved hjelp av en pipettespiss eller fine stump nål, posisjon larver under stereomikroskop slik at dorsal aspektet av fisken utsettes for agarosegel overflaten. Tillat agarose å herde (5-10 min), deretter ved hjelp av en flat spatel overføring agar blåse til en innspilling kammer satt opp på en elektrofysiologi riggen.

3. Ekstracellulære feltopptak

1. Legg 2-5 ml sebrafisk opptaksmedium til opptaket kammeret. Hvis bedøve endringer er nødvendig, perfuse kammer med innspillingen oppløsning ved en hastighet på omtrent 1 ml / min. Ingen oksygenering av opptaket løsning er nødvendig.
2. Sette inn et microelectrode (omtrent 1 um spissen diameter, 2-7 MΩ) inn i forsterkeren headstage montert på en tredimensjonal mikromanipulator. Kontroller at mikromanipulator er i en riktig stilling for å tillate en rekke bevegelse og justering. Bring mikroelektroden tuppen inn i planet for visningen av mikroskop, høy av scenen, og bruke grovjustering lavere til et punkt like over og litt foran hodet av sebrafisk.
3. Med forsterkeren i "gjeldende-clamp" modus null elektroden.
4. Bruke grovjustering lavere elektrodespissen slik at den bare berører surface av zebrafisk, litt foran forebrain.
5. Bruke Finjustering trinnene fremme elektrodespissen til den Punkteringer huden sebrafisk. Tillat å bosette og deretter fremme elektroden flere mikrometer i forebrain.
6. Registrere elektrisk aktivitet i current-clamp modus ved hjelp Axoscope programvare. Innsamlingen til en samplingsfrekvens på 10 kHz.

Representative Results

Eksempler på electrographic anfall-lignende utladning registrert i forhjernen av en agar-embedded sebrafisk larver er vist i figur 1. Stor-amplitude multi-topp burst utslipp i disse prøvene ble fremkalt av bad anvendelse av en convulsant narkotika, 40 mm pilokarpin (i A; 6 DPF) eller 1 mM picrotoxin (i B, 8 DPF). I disse innspillingene, immobilisert og agar-embedded sebrafisk overvåkes kontinuerlig i opptil 90 min. Fisk forblir levedyktig under disse opptaksforhold i opptil 24 timer. Medikamentene blir tilsatt til bading medium og normalt diffunderer inn i agaren for å fremkalle aktiviteten i larve sebrafisk forhjernen innen 30 til 45 min. Denne metoden kan brukes ved relativt små mengder medikamentoppløsning (2-5 ml) som larver ikke krever kontinuerlig perfusjon og kan føres inn i en statisk bad konfigurasjon hvis nødvendig. I panelet C, er en spontan burst utslipp vist for en genmodifisert sebrafisk på 3 DPF; innspillingen ble gjort i sebrafiskopptaksmedier. Morfolino oligonukleotid injeksjonen på 1-2 cellestadiet ble brukt til knockdown ekspresjon av et gen for Tuberous sklerose Complex (tsc1a), en pediatrisk form for epilepsi assosiert med kramper og autisme. Ekstracellulære opptak kan også fås fra den optiske Tectum. For eksempler, se Baraban et al. (2005) ⁹ eller Baraban et al. (2007) ^10. Som vist her, kan de elektriske hendelsene varierer i bølgeform og varighet avhengig virkningsmekanismen brukes for å fremkalle anfall aktivitet.

Figur 1. Ekstracellulære feltopptak av unormal burst utslipp aktivitet registrert i forebrain av immobilisert og agar-embedded sebrafisk larver. Opptak elektrodene er plassert under visuellobservasjon på en Olympus BX50 oppreist mikroskop. Opptak i (A) og (B), ble igangsatt omtrent 40 til 45 minutter etter at stoffet søknad. (A) med flere topp utladning innspilt i pilokarpin, en muskarin acetylkolin reseptorantagonist. (B) Burst utslipp registrert i picrotoxin, en GABA-A-reseptorantagonist. (C) En enkelt multi-spike burst utskrivning fart fra en 3 DPF sebrafisk larver injisert med en morfolino mot tsc1a.

Discussion

Den ekstracellulære opptak metoden presentert her gjør en veldig følsom og rask analyse av hjernens aktivitet. Disse opptakene er analoge til elektroencefalografiske (EEG) overvåking vanligvis brukes for å evaluere tilstedeværelsen av unormal elektrisk utladning (dvs. anfall) i gnagermodeller av epilepsi ¹¹ og pasienter ^12. Ekstracellulære opptak kan kombineres med farmakologiske manipulasjoner, som vist her. Disse typer opptak kan også brukes til å evaluere potensielle epileptiske fenotyper i genmodifiserte sebrafisk. Mutant sebrafisk er allment tilgjengelig for mange genmutasjoner identifisert i ENU mutagenese skjermer (se Sebrafisk International Resource Center, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) eller gjennom nye Tol2 transgene ⁷ og sink finger nukleotid ¹³ teknikker. Som vist her, hurtig gene knockdown hjelpMorpholino oligonukleotider etterfulgt av elektrofysiologisk overvåking så tidlig som 3 DPF gir en ekstra metode for å vurdere anfall-induserende genet defekter. Innspillingen elektroden lett kan plasseres i enhver sebrafisk struktur inkludert den optiske Tectum eller lillehjernen, og flere opptak elektroder kan brukes om nødvendig. En begrensning av disse registreringene er at det er vanskelig å vurdere den nøyaktige plasseringen av opptaket elektrodespissen forhold til bestemt hjernen atomkjerner. Tilgjengeligheten av sebrafisk bærer fluorescerende reportere i konkrete kjerner eller celletyper vil dempe denne begrensningen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low melting	Fisher-Scientific	BP1360-100	Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0.02%
α-bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 mg/ml
Capillary glass tubing	Warner Instruments	G120TF-3	Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier	Warner Instruments	PC-505B	We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Filter/amplifier	Cygnus Technology	FLA-01	We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Axon A/D board and Axoscope software	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2	Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions.
Egg water	Instant Ocean		3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water