Summary
Простой метод для записи внеклеточных потенциалов поля в личиночной рыбок данио мозга описаны. Метод обеспечивает надежную
Abstract
Эпилепсия затрагивает почти 3 миллиона человек в Соединенных Штатах и до 50 миллионов человек по всему миру. Определяется как возникновение спонтанной неспровоцированных припадков, эпилепсии могут быть приобретены в результате оскорбления в мозг или генетической мутации. Усилия по модели припадки у животных в первую очередь использовать приобретенные оскорбления (судорожного наркотики, стимуляцию или черепно-мозговой травмы) и генетических манипуляций (антисмысловой нокдаун, гомологичной рекомбинации или трансгенез) у грызунов. Данио рерио является моделью системы позвоночных 1-3, которые могут предоставить ценную альтернативу грызунов на основе исследования эпилепсии. Данио рерио широко используются в исследовании позвоночных генетики или развития, проявляют высокую степень генетического сходства с млекопитающими и выразить гомологов для ~ 85% известных человеческих одной мутации гена эпилепсии. Из-за своих небольших размеров (4-6 мм в длину), личинки данио рерио могут быть сохранены в объемах жидкости столь же низко как 100 мкл во время раннего развития и ARRAрый в мульти-луночных планшетах. Реагенты могут быть добавлены непосредственно в раствор, в котором развиваются эмбрионы, упрощения введения препарата и позволяет быстро в естественных условиях скрининга тестируемых соединений 4. Синтетические олигонуклеотиды (morpholinos), мутагенеза, цинкового пальца нуклеазы и трансгенных подходов может быть использован для быстрого создания нокдаун гена или мутации у рыбок данио 5-7. Эти свойства позволить себе рыбок данио исследования беспрецедентными статистического анализа преимуществ власть над грызунами в изучении неврологических расстройств, таких как эпилепсия. Потому что «золотым стандартом» для лечения эпилепсии исследований является мониторинг и анализ аномальных электрических разрядов, которые происходят в центральной структуры мозга (например, эпилептические припадки), метод эффективного записи активности мозга в личиночной рыбок данио описано здесь. Этот метод адаптации обычных внеклеточной методы записи и позволяет стабильный долгосрочный мониторинг активности мозга в неповрежденный личинки данио рерио. Sдостаточное записи показаны для острого шок, вызванный ванны применения судорожного наркотиков и спонтанных припадков, записанные в генетически модифицированной рыбы.
Protocol
1. Производство яиц и коллекции
- Данио рерио хозяйства следует стандартным процедурам, описанным ранее 8. Короче говоря, взрослые данио созданы в разведении танков с перегородками на месте. Когда свет в комнате прийти на следующее утро, разделители удаляются из племенных танков и рыба разрешены примерно от 20 до 60 мин ненарушенных время спаривания.
- Яйца из разведения танков, собранных в сито и промыть яйцо водой. Яйца затем переносят в чашку Петри с яйцом воды. Неоплодотворенные яйца и мусор удаляются с помощью передачи пипетки.
- Место чашке Петри содержащие собранные яйца в инкубаторе (28-32 ° C). После яиц вылупляются, около двух дней после оплодотворения (DPF), удалить хориона и любой другой мусор с передачей пипетки.
- В нужный день после оплодотворения (3 до 8 DPF) удалить чашке Петри содержащие свободно плавающих личинок и место на лабораторном столе при комнатной температуре.
- Использование съемника микропипетки, потяните 1,2 мм OD боросиликатного стеклянный капилляр на две иглы и магазин в 150 мм чашки Петри или пустую коробку пипеткой путем прокладки над глупыми пандусы замазкой. Иглы могут быть вытащил заранее. Различные OD стеклянные капилляры могут быть использованы в зависимости от типа усилителя headstage доступны.
- Backload микроэлектрод с внеклеточной решение для записи (2 М NaCl) с использованием 1 мл шприц с Nalgene шприц фильтр (4-мм) и Microfil нити (Warner Precision Instruments) прилагается. Встряхните или нажмите болюса на кончике иглы, пока есть мало или совсем нет пузырьков осталось.
3. Иммобилизация в агар
- Подготовка свежий раствор 1,2% агар низкой температурой плавления в яйце воды. Место агар решение в комплекте водяной бане при температуре ~ 37 ° C.
- Подготовка покровное с камерой запись и место в морозильной камере (5-10 мин). Запись камеры должна MATCч, что использовались на буровой электрофизиологии. Мы используем низкопрофильных открытых алмазов ванны изображения камеры от Warner Instruments (модель RC-26GLP).
- Использование Пастера или передачи пипетки, положите одну личиночной данио рерио в небольшой капле воды яйца в чистую тарелку чашке Петри. Для этого капля, добавьте каплю раствора, содержащего анестетик (0,02% Tricaine) и парализующий агент (1 мг / мл α-bungarotoxin).
- Мониторинг рыбок данио за потерю движения (5 до 10 мин).
- Удалить покровное / записи камеры с морозильной камерой. Поместите камеру на сцену стереомикроскопа. Использование передачи пипетки, смешать несколько мл 1,2% низкой температурой плавления агарозы с каплей и передачи решения (с рыбой) на покровное / записи камеры.
- С помощью кончика пипетки или тонкой тупой иглой, положение личинки под стереомикроскопа так, что спинной части рыбы подвергается поверхность геля агарозы. Разрешить агарозы, чтобы укрепиться (5-10 мин), затем с помощью плоского шпателя передачи агар бБлокировка на запись камеры установлены на буровой электрофизиологии.
3. Внеклеточный поле записи
- Добавить 2-5 мл среды рыбок данио записи на записи камеры. Если препарат изменения необходимы, заливать камеру с записью решения в размере около 1 мл / мин. Нет оксигенации записи решение необходимо.
- Вставьте микроэлектрод (около 1 мкм диаметром кончика, 2-7 МОм) в усилитель headstage установленный на трехмерные микроманипулятора. Убедитесь, что микроманипулятора находится в правильном положении, чтобы обеспечить диапазон движения и регулировки. Принесите микроэлектрода чаевые в плоскость зрения микроскопа, высоко над сценой, и с помощью грубой регулировки нижнего уровня чуть выше и немного впереди глава рыбок данио.
- С усилителя в "текущем зажим" режим нулевых электродов.
- Использование грубой регулировки нижнего торца электрода так, чтобы она не коснется ыurface из рыбок данио, немного впереди переднего мозга.
- При использовании тонкой регулировки шага продвижения кончик электрода, пока она прокалывает кожу рыбок данио. Дайте отстояться и затем перейти электрод несколько микрон в переднем мозге.
- Запись электрической активности в текущем зажим режиме с использованием Axoscope программного обеспечения. Данные, полученные в частоте дискретизации 10 кГц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Примеры электрографических захвата типа разряда записаны в мозг из агар-встроенные личинки данио показано на рисунке 1. Большая амплитуда мульти-всплеск всплеск разряда в этих образцах был вызван ванны применения судорожного наркотиков, 40 мМ пилокарпин (в, 6 DPF) или 1 мм пикротоксина (в B, 8 DPF). В этих записях, иммобилизованных и агар-встроенные рыбок данио постоянно контролируется в течение 90 мин. Рыбы остаются жизнеспособными при этих условиях записи до 24 часов. Препараты добавляли в среду купания и обычно диффундируют в агар для выявления активности в личиночной рыбок данио мозга в пределах от 30 до 45 мин. Этот метод может быть использован при относительно небольших объемов лекарственного раствора (2-5 мл), как личинки не требуют непрерывной перфузии и могут быть записаны в статической конфигурации ванну, если это необходимо. В панели C, разряд спонтанных всплесков показан для генетически модифицированных рыбок данио на 3 денье; запись была сделана в данио рерионосителя записи. Морфолино олигонуклеотида инъекции в 1-2 клеточной стадии был использован для нокдаун экспрессии гена для клубневые склероз комплекс (tsc1a), детский формы эпилепсии связаны с эпилептическими припадками и аутизмом. Внеклеточной записи могут быть также получены из зрительного покрышки. Например, см. Барабан и соавт. (2005) 9 или Барабан и соавт. (2007) 10. Как показано здесь, электрических событий может варьироваться в форме волны и продолжительность в зависимости от механизма действия использоваться, чтобы выявить судорожную активность.
Рисунок 1. Внеклеточной полевых записей аномальной активности разряда взрыв, записанные в переднем мозге иммобилизованных и агар-встроенные личинки данио рерио. Запись электроды расположены под визуальнымнаблюдения на Olympus BX50 прямой микроскоп. Записи в (А) и (Б) было начато примерно от 40 до 45 мин после применения препарата. (A) Multi-всплеска разряда, записанные в пилокарпин, антагонист мускариновых рецепторов ацетилхолина. (B) съемка разрядов, записанных в пикротоксина, ГАМК-рецепторов. (C) один многостраничный всплеск всплеск разряда записаны от 3 DPF личинки данио вводят морфолино против tsc1a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Внеклеточной метод записи, представленные здесь позволяет очень чувствительный и быстрый анализ активности мозга. Эти записи аналогичны электроэнцефалографии (ЭЭГ) мониторинг обычно используется для оценки наличия аномальных электрических разрядов (например, арест) в моделях грызунов эпилепсии 11 и пациентов 12. Внеклеточной записи могут быть объединены с фармакологической манипуляции, как показано здесь. Эти типы записей, также может быть использован для оценки потенциальных эпилептические фенотипов в генетически модифицированных рыбок данио. Мутант рыбок данио, как правило, доступны для многих генных мутаций, выявленных в ЕНУ мутагенеза экранов (см. данио рерио Международный ресурсный центр, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) или через новые Tol2 трансгенных 7 и цинковый палец нуклеотидной 13 методов. Как показано здесь, быстрый нокдаун гена с использованиемморфолино олигонуклеотидов следует электрофизиологического мониторинга уже в 3 DPF обеспечивает дополнительный метод оценки захват вызывающие дефекты гена. Запись электрод может быть легко размещен в любом рыбок данио структуры, включая тектуме или мозжечка, а также несколько электродов записи могут быть использованы в случае необходимости. Ограничение этих записей является то, что трудно оценить точное расположение кончика записи электрода по отношению к конкретным ядер головного мозга. Наличие у рыбок данио проведения флуоресцентной журналистам в конкретных ядер или типов клеток будет смягчить это ограничение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Автор хотел бы поблагодарить Питера Кастро и Мэтью Dinday к их скорейшему усилия по созданию данио рерио в лаборатории. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья EUREKA гранта (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
