Summary
En simpel metode til at registrere ekstracellulære feltpotentialer i larvens zebrafisk forhjerne er beskrevet. Fremgangsmåden tilvejebringer en robust
Abstract
Epilepsi påvirker næsten 3 millioner mennesker i USA og op til 50 millioner mennesker på verdensplan. Defineret som forekomsten af spontane uprovokerede anfald, kan epilepsi kan erhverves som et resultat af en fornærmelse til hjernen eller en genetisk mutation. Bestræbelser på at model anfald hos dyr har primært udnyttet erhvervet fornærmelser (Krampestillende lægemidler, stimulering eller hjerneskade) og genetiske manipulationer (antisense knockdown, homolog rekombination eller transgenese) hos gnavere. Zebrafisk er et hvirveldyr modelsystem 1-3, der kunne give et værdifuldt alternativ til gnaver-baserede epilepsi forskning. Zebrafisk anvendes i udstrakt grad ved studiet af vertebrat genetik eller udvikling, udviser en høj grad af genetisk lighed til pattedyr og udtrykke homologer for ~ 85% af kendte humane single-gen epilepsi mutationer. På grund af deres lille størrelse (4-6 mm i længde), kan zebrafisk larver opretholdes væskevoluminer så lavt som 100 ul under tidlig udvikling og arrayed i multi-brønd plader. Reagenser kan tilsættes direkte til opløsningen hvor embryoerne udvikler, forenkle lægemiddelindgivelse og muliggør hurtig in vivo screening af testforbindelser 4. Syntetiske oligonucleotider (morpholinos), mutagenese, zinkfinger nuklease og transgene metoder kan anvendes til hurtigt at generere genet knockdown eller mutation i zebrafisk 5-7. Disse egenskaber giver zebrafisk undersøgelser en hidtil uset statistisk styrke analyse fordel i forhold til gnavere i studiet af neurologiske lidelser, såsom epilepsi. Fordi "gold standard" for epilepsi forskning er at overvåge og analysere de unormale elektriske udladninger, der stammer fra en central hjerne struktur (dvs. anfald), en metode til effektivt at registrere hjernens aktivitet i larvestadiet zebrafisk er beskrevet her. Denne metode er en tilpasning af konventionelle ekstracellulære optagelse teknikker og giver mulighed for en stabil og langsigtet overvågning af hjernens aktivitet i intakt zebrafisk larver. Srigelig optagelser er vist for akutte krampeanfald induceret af bad anvendelse af Krampestillende lægemidler og spontane anfald registreres i en genetisk modificerede fisk.
Protocol
1. Ægproduktion og samling
- Zebrafisk opdræt følger standardprocedurer beskrevet tidligere 8. Kort fortalt voksne zebrafisk oprettet i avl tanke med skilleplader på plads. Når lyset i rummet kommer på den følgende morgen, er dividers fjernet fra ynglende tanke og fisk er tilladt cirka 20 til 60 minutter af uforstyrret parring tid.
- Æg fra ynglende tanke er samlet i en si og skylles med æg vand. Æg overføres derefter til en petriskål med æg vand. Ubefrugtede æg og cellerester fjernes ved hjælp af en transfer pipette.
- Sted petriskål indeholdende de opsamlede æg i en inkubator (28-32 ° C). Efter æg klækkes, omkring to dage efter befrugtning (DPF), fjerne chorion og andre urenheder med en transfer pipette.
- På ønskede dag efter befrugtningen (3 til 8 dpf) fjern petriskål indeholdende frit svømning larver og sted på lab bænk ved stuetemperatur.
- Med en mikropipette aftrækker, trække en 1,2 mm OD borosilikatglas kapillær i to nåle og opbevares i en 150 mm petriskål eller tom pipette kasse ved at lægge mere end Silly Putty ramper. Nåle kan trækkes på forhånd. Forskellige OD glaskapillarer kan anvendes afhængigt af typen af forstærkeren hovedtrin til rådighed.
- Udsætte den mikroelektrode med ekstracellulære optagelse opløsning (2 M NaCl) under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en Nalgene sprøjtefilter (4 mm) og Microfil filament (Warner Precision Instruments) fastgjort. Ryst eller bank bolus mod nålespidsen indtil der kun er få eller ingen bobler tilbage.
3. Immobiliseringen i Agar
- Der fremstilles en frisk opløsning af 1,2% lavtsmeltende agar i æg vand. Sted agaropløsning i et vandbad indstillet til ~ 37 ° C.
- Forbered et dækglas med indspilning kammer og plads i fryseren (5-10 min). Optagelsen Kammeret skal match at anvendes på elektrofysiologi riggen. Vi bruger en lav profil åben diamant bad imaging kammer fra Warner Instruments (Model RC-26GLP).
- Ved hjælp af en Pasteur eller overførselspipetten, sted en larvernes zebrafisk i en lille dråbe af æg vand i en ren petriskål plade. Til denne dråbe, en dråbe opløsning indeholdende et anæstetikum (0,02% tricaine) og lammende middel (1 mg / ml α-bungarotoxin) tilsættes.
- Overvåge zebrafisk for tab af bevægelse (5-10 min).
- Tag dækglasset / optagelse kammer fra fryseren. Placer kammer på scenen af et stereomikroskop. Under anvendelse af en transfer pipette adskillige ml af 1,2% agarose med lavt smeltepunkt blandes med dråbe og overførsel opløsning (med fisk) til dækglasset / registreringskammer.
- Ved hjælp af en pipettespids eller fint stump nål, position larver under stereomikroskop, således at den dorsale aspekt af fiskene udsættes for agarosegel overflade. Lad agarose at hærde (5-10 min), derefter med en flad spatel overførsel agar blås til en optagelse kammer sat op på en elektrofysiologi rig.
3. Ekstracellulær Field Recording
- Tilføj 2-5 ml af zebrafisk optagemedier til optagelsen kammeret. Hvis lægemiddel-ændringer er nødvendige, perfundere kammer med optagelsen opløsning med en hastighed på cirka 1 ml / min. Nr. iltning af optagelsen løsningsmodel.
- Indsætte en mikroelektrode (ca. 1 um tip diameter, 2-7 MQ) i forstærkeren hovedtrin monteret på en tredimensional mikromanipulator. Kontroller at mikromanipulator er i en korrekt stilling for at tillade en række af bevægelse og justering. Bring mikroelektrode spids ind i planet i lyset af mikroskop, høj fra scenen, og ved hjælp grovindstilling lavere til et punkt lige over og lidt foran hovedet af zebrafisk.
- Med forstærkeren i "current-clamp"-tilstand nul elektroden.
- Anvendelse af grovjustering lavere elektrodespidsen således at det netop rører surface af zebrafisk, lidt foran af forhjernen.
- Ved hjælp finjustering trin fremme elektrodespidsen indtil den punkterer huden af zebrafisk. Tillad at bosætte sig og derefter videre elektroden flere mikron i forhjerne.
- Optag elektrisk aktivitet i den nuværende-clamp-tilstand ved hjælp Axoscope software. Data erhverves til en samplingfrekvens på 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på elektrografiske anfald-lignende udledning registreret i forhjernen af en agar-indlejret zebrafisk larver er vist i figur 1.. Stor amplitude multi-spike burst udladning i disse prøver blev fremkaldt af bath anvendelse af en konvulsiv stof, 40 mM pilocarpin (i A, 6 dpf) eller 1 mM picrotoxin (i B, 8 dpf). I disse optagelser, immobiliseret og agar-indlejrede zebrafisk løbende overvåges i op til 90 min. Fisk forblive levedygtig under disse optageforhold for op til 24 timer. Lægemidler tilsættes til badning medium og normalt diffunderer ind i agaren for at fremkalde aktiviteten i larvestadiet zebrafisk forhjerne inden for 30-45 min. Denne metode kan anvendes med relativt små volumener af lægemiddelopløsning (2-5 ml) som larver ikke kræver kontinuerlig perfusion og kan optages i en statisk bad konfiguration, hvis det er nødvendigt. I panel C, er en spontan burst decharge vist for en genetisk modificeret zebrafisk ved 3 dpf, optagelsen blev foretaget i zebrafiskoptagemedier. Morpholino oligonukleotid injektion ved 1-2 cellestadiet blev anvendt til knockdown ekspressionen af et gen for tuberous sclerosis Complex (tsc1a), en pædiatrisk form for epilepsi i forbindelse med kramper og autisme. Ekstracellulære optagelser kan også fås fra optikken Tectum. For eksempler, se Baraban et al. (2005) 9 eller Baraban et al. (2007) 10. Som vist her, kan de elektriske begivenheder variere i bølgeform og varighed afhænger af virkningsmekanismen anvendes til at fremkalde anfald.
Figur 1. Extracellulære field recordings af unormal burst udledning aktivitet registreret i forhjernen af immobiliseret og agar-embedded zebrafisk larver. Registrerende elektroder er anbragt under visuelobservation på et Olympus BX50 opretstående mikroskop. Optagelser i (A) og (B) blev initieret ca 40 til 45 minutter efter lægemiddelpåføring. (A) Multi-spike udledning optaget i pilocarpin, en muscarin-acetylcholin-receptor-antagonist. (B) Burst udledninger optaget i picrotoxin, en GABA-A-receptor-antagonist. (C) En enkelt multi-spike burst udledning optaget fra en 3 dpf zebrafisk larver injiceret med en morpholino mod tsc1a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ekstracellulære registreringsmetode præsenteres her muliggør en meget følsom og hurtig analyse af hjerneaktivitet. Disse optagelser er analoge med elektroencephalografisk (EEG) overvågning almindeligt anvendt til at vurdere tilstedeværelsen af abnorm elektrisk udladning (dvs. anfald) i gnavermodeller for epilepsi 11 og patienter over 12. Ekstracellulære optagelser kan kombineres med farmakologiske manipulationer, som vist her. Disse typer af optagelser kan også anvendes til at vurdere de potentielle epileptiske fænotyper i genetisk modificerede zebrafisk. Mutant zebrafisk er almindeligt tilgængelige for mange genmutationer identificeret i ENU mutagenese skærme (se zebrafisk International Resource Center, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) eller gennem nye Tol2 transgene 7 og zinkfinger nukleotid 13 teknikker. Som påvist her, hurtig gen knockdown hjælpmorpholino oligonukleotider efterfulgt af elektrofysiologiske overvågning så tidligt som 3 dpf giver en ekstra metode til at vurdere beslaglæggelse-inducerende gendefekter. Den elektrode kan let placeres i enhver zebrafisk, herunder en optisk Tectum eller cerebellum, og flere registrerende elektroder kan anvendes efter behov. En begrænsning af disse optagelser er, at det er vanskeligt at vurdere den nøjagtige placering af optagelsen elektrodespidsen i forhold til specifikke hjernekerner. Tilgængeligheden af Zebrafisken transporterer fluorescerende reportere i specifikke kerner eller celletyper vil afbøde denne begrænsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatteren vil gerne takke Peter Castro og Matthew Dinday for deres tidlige bestræbelser på at skabe zebrafisk i laboratoriet. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health EUREKA tilskud (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
