Summary
Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una robusta
Abstract
La epilepsia afecta a casi 3 millones de personas en los Estados Unidos y hasta 50 millones de personas en todo el mundo. Se define como la aparición de convulsiones no provocadas espontáneos, la epilepsia puede ser adquirido como resultado de un daño cerebral o una mutación genética. Los esfuerzos para convulsiones modelo en animales han utilizado principalmente adquirido insultos (fármacos anticonvulsivos, estimulación o lesión cerebral) y las manipulaciones genéticas (knockdown antisentido, la recombinación homóloga o transgénesis) en roedores. El pez cebra son un sistema modelo vertebrado 1-3 que podría proporcionar una valiosa alternativa a los roedores investigación basada en la epilepsia. El pez cebra se utilizan extensivamente en el estudio de la genética de vertebrados o de desarrollo, presentan un alto grado de similitud genética para los mamíferos y expresar homólogos de ~ 85% de las mutaciones conocidas humanos epilepsia de un solo gen. Debido a su pequeño tamaño (4-6 mm de largo), larvas de pez cebra puede ser mantenido en volúmenes de fluido tan bajo como 100 l durante el desarrollo temprano y arraYED en múltiples pocillos. Los reactivos se pueden añadir directamente a la solución en la que se desarrollan los embriones, la simplificación de la administración del fármaco y que permite una rápida selección in vivo de compuestos de ensayo 4. Los oligonucleótidos sintéticos (morfolinos), mutagénesis, dedo de zinc nucleasa y enfoques transgénicos se pueden utilizar para generar rápidamente desmontables gen o mutación en el pez cebra 5-7. Estas propiedades costear los estudios de pez cebra sin precedentes ventaja estadística sobre el análisis del poder roedores en el estudio de los trastornos neurológicos como la epilepsia. Debido a que el "estándar de oro" para la investigación epilepsia es monitorear y analizar las descargas eléctricas anormales que se originan en una estructura del cerebro central (por ejemplo, convulsiones), un método para grabar de manera eficiente la actividad cerebral en larvas de pez cebra se describe aquí. Este método es una adaptación de las técnicas convencionales de registro extracelular y permite una estabilidad a largo plazo de vigilancia de la actividad cerebral en larvas de pez cebra intacto. Sgrabaciones amplias se muestran para las convulsiones agudas inducidas por la aplicación de fármacos anticonvulsivos baño y convulsiones espontáneas grabadas en un pez modificado genéticamente.
Protocol
1. Huevo de Producción y Recolección
- El pez cebra cría sigue los procedimientos estándar descritos previamente 8. En pocas palabras, el pez cebra adultos se instalan en acuarios de cría con separadores en su lugar. Cuando las luces de la habitación se enciende a la mañana siguiente, los divisores son retirados de los tanques de cría y los peces se permiten aproximadamente 20 a 60 minutos de tiempo de apareamiento sin ser molestados.
- Los huevos procedentes de tanques de cría se recogen en un filtro y se enjuagó con agua huevo. Los huevos se transfieren entonces a una placa de Petri con agua huevo. Huevos no fertilizados y desechos se eliminan utilizando una pipeta de transferencia.
- Coloque una placa de Petri que contiene los huevos recolectados en una incubadora (28-32 ° C). Después de incubar huevos, unos dos días después de la fertilización (dpf), retire cualquier residuo corion y otro con una pipeta de transferencia.
- En el día deseado después de la fertilización (3 a 8 dpf) eliminar placa de Petri que contiene las larvas libremente natación y el lugar en el banco de laboratorio a temperatura ambiente.
- El uso de un extractor de micropipeta, tire de 1,2 mm de diámetro externo de borosilicato de vidrio capilar en dos agujas y guárdelos en un plato de Petri de 150 mm o caja pipeta vacía por encima de las rampas de plastilina. Las agujas pueden ser tirado por adelantado. Diferente OD capilares de vidrio se pueden utilizar dependiendo del tipo de headstage amplificador disponible.
- Retrocarga el microelectrodo con solución de registro extracelular (2 M NaCl) utilizando una jeringa de 1 ml con un filtro de jeringa Nalgene (4-mm) y Microfil filamento (Warner Precision Instruments) conectado. Agitar o golpear ligeramente el bolo hacia la punta de la aguja hasta que no haya burbujas de pocos o ningún restantes.
3. Inmovilización en Agar
- Preparar una solución fresca de agar 1,2% bajo punto de fusión en agua huevo. Place solución de agar en un conjunto de baño de agua a ~ 37 ° C.
- Preparar un cubreobjetos con cámara de registro y el lugar en el congelador (min 5-10). La cámara de grabación debe MATCh que se utiliza en la plataforma de electrofisiología. Usamos un bajo perfil baño abierto diamante cámara de imágenes de Warner Instruments (modelo RC-26GLP).
- El uso de un Pasteur o pipeta de transferencia, coloque una larvas de pez cebra en una pequeña gota de agua de huevo en una placa de Petri plato limpio. Para esta gota, añadir una gota de solución que contiene un anestésico (0,02% tricaína) y agente paralizante (1 mg / ml de α-bungarotoxina).
- Monitorear el pez cebra para la pérdida de movimiento (5 a 10 min).
- Quite el cubreobjetos / cámara de registro del congelador. Coloque la cámara en la etapa de un microscopio estereoscópico. Usando una pipeta de transferencia, se mezcla con algunos mililitros de bajo punto de fusión 1,2% de agarosa con la gotita y solución de transferencia (de pescado) a la cámara de cubreobjetos / grabación.
- Utilizando una punta de pipeta o aguja fina romo, larvas posición bajo el estereomicroscopio de modo que la cara dorsal del pescado se expone a la superficie del gel de agarosa. Permita que se endurezca agarosa (min 5-10), y luego usando una espátula plana la transferencia b agarbloquear a una cámara de grabación puede configurarse en una plataforma de electrofisiología.
3. Grabación de campo extracelular
- Añadir 2-5 ml de medio de grabación de pez cebra para la cámara de grabación. Si los cambios son drogas cámara necesaria, perfundir con solución de grabación a una velocidad de aproximadamente 1 ml / min. No oxigenación de la solución de grabación es necesario.
- Insertar un microelectrodo (aproximadamente 1 m diámetro de la punta, 2-7 mW) en el headstage amplificador montado en un micromanipulador de tres dimensiones. Comprobar que el micromanipulador se encuentra en una posición adecuada para permitir un rango de movimiento y ajuste. Llevar la punta microelectrodo en el plano de visión del microscopio, alta de la etapa, y el uso de ajuste grueso inferior a un punto justo por encima y ligeramente por delante de la cabeza del pez cebra.
- Con el amplificador en "corriente-clamp" modo cero del electrodo.
- Uso del ajuste del grueso inferior de la punta del electrodo para que apenas toque el surface del pez cebra, ligeramente por delante del prosencéfalo.
- El uso de pasos de ajuste fino avanzar la punta del electrodo hasta que perfora la piel del pez cebra. Deje que se asiente y luego avanzar el electrodo varias micras en cerebro anterior.
- Registrar la actividad eléctrica en modo de corriente-clamp utilizando software AxoScope. Los datos se adquirieron a una velocidad de muestreo de 10 kHz.
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Representative Results
Ejemplos de electrográfica convulsiva de descarga registrada en el cerebro anterior de un agar-incrustado larvas de pez cebra se muestra en la figura 1. De gran amplitud multi-pico de descarga ráfaga en estas muestras fue evocado por baño de aplicación de un fármaco anticonvulsivo, pilocarpina 40 mM (en A; 6 dpf) o 1 mM picrotoxina (en B; 8 dpf). En estas grabaciones, y inmovilizada agar-encajados pez cebra se controlan continuamente durante un máximo de 90 min. Fish siendo viable bajo estas condiciones de grabación de hasta 24 horas. Los fármacos se añadieron al medio de baño y, normalmente, se difunden en el agar para provocar la actividad en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra en 30 a 45 min. Este método se puede utilizar con volúmenes relativamente pequeños de solución de fármaco (2-5 ml) como larvas no requieren perfusión continua y se puede grabar en un baño estático configuración si es necesario. En el panel C, una ráfaga de descarga espontánea se muestra para un pez cebra transgénico en 3 dpf; grabación fue hecha en el pez cebramedios de grabación. Inyección Morpholino oligonucleótido en la fase de 1-2 células se utilizó para la expresión de un gen desmontables para la esclerosis tuberosa compleja (tsc1a), una forma de epilepsia pediátrica asociada con convulsiones y autismo. Grabaciones extracelulares también pueden obtenerse a partir de la óptica tectum. Para ejemplos, véase Baraban et al. (2005) 9 o Baraban et al. (2007) 10. Como se muestra aquí, los eventos eléctricos pueden variar en forma de onda y la duración en función del mecanismo de acción que se utiliza para provocar actividad convulsiva.
Grabaciones Figura 1. Extracelulares campo de actividad anormal de descarga explosión registrada en el cerebro anterior de inmovilizado y agar embedded-larvas de pez cebra. Electrodos de registro se coloca bajo visualobservación en un microscopio Olympus BX50 vertical. Grabaciones en (A) y (B) se iniciaron aproximadamente de 40 a 45 min después de la aplicación del fármaco. (A) Multi-pico de descarga registrado en la pilocarpina, un antagonista de los receptores de acetilcolina muscarínicos. (B) descarga explosión registrada en picrotoxina, un antagonista de GABA-A receptor. (C) Un único multi-pico de descarga rotura registrada desde las larvas de pez cebra 3 dpf inyecta con una morfolino contra tsc1a.
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Discussion
El método de registro extracelular presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de la actividad cerebral. Estas grabaciones son análogos a electroencefalográfica (EEG) de seguimiento comúnmente utilizado para evaluar la presencia de descarga eléctrica anormal (es decir, convulsiones) en modelos de roedores de epilepsia y 11 pacientes 12. Grabaciones extracelular se puede combinar con las manipulaciones farmacológicas, como se muestra aquí. Estos tipos de grabaciones también se puede utilizar para evaluar los posibles fenotipos epilépticos en el pez cebra transgénico. Pez cebra mutantes están comúnmente disponibles para muchas mutaciones genéticas identificadas en las pantallas de mutagénesis ENU (véase el pez cebra Centro Internacional de Recursos, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) oa través emergente Tol2 transgénico 7 y dedos de zinc nucleótidos técnicas 13. Como se ha demostrado aquí, caída rápida utilizando genesoligonucleótidos de morfolino seguidos de monitorización electrofisiológica tan pronto como 3 dpf proporciona un método adicional para evaluar la inducción de convulsiones defectos genéticos. El electrodo de registro se puede colocar fácilmente en cualquier estructura de pez cebra incluyendo el techo óptico o el cerebelo, y múltiples electrodos de grabación se puede utilizar si es necesario. Una limitación de estas grabaciones es que es difícil evaluar la localización precisa de la punta del electrodo de registro en relación con núcleos del cerebro específica. La disponibilidad de pez cebra fluorescente que llevan a los periodistas en núcleos específicos o tipos de células se mitigar esta limitación.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El autor desea dar las gracias a Pedro Castro y Dinday Mateo para sus primeros esfuerzos por establecer pez cebra en el laboratorio. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención EUREKA (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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