Summary
ووصف طريقة بسيطة لتسجيل إمكانات حقل خارج الخلية في الدماغ الأمامي الزرد اليرقات. الأسلوب يوفر قوية
Abstract
الصرع يؤثر على ما يقرب من 3 ملايين شخص في الولايات المتحدة ويصل إلى 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. يعرف بأنه حدوث النوبات دون سابق استفزاز عفوية، يمكن الحصول على الصرع نتيجة لإهانة إلى الدماغ أو طفرة جينية. الجهود المبذولة لضبط النموذج في المقام الأول تستخدم الحيوانات والشتائم المكتسبة (المخدرات الاختلاج، أو إصابات الدماغ التحفيز) والتلاعب الجيني (ضربة قاضية العقاقير، إعادة التركيب مثلي أو transgenesis) في القوارض. الزرد هي نظام نموذجي الفقاريات 1-3 التي يمكن أن توفر بديلا قيما للابحاث ومقره القوارض الصرع. وتستخدم على نطاق واسع الزرد في دراسة علم الوراثة الفقاريات أو التنمية، يحمل درجة عالية من التشابه الجيني للثدييات والتعبير عن homologs ل85٪ ~ من الطفرات المعروفة الإنسان بالصرع واحد الجينات. بسبب صغر حجمها (4-6 ملم في الطول)، يمكن الحفاظ على الزرد اليرقات في حجم السائل منخفضة تصل إلى 100 ميكرولتر خلال التنمية في وقت مبكر والأذربيجانيةYED في موضوع لوحات جيدة. يمكن إضافة الكواشف مباشرة إلى الحل الذي الأجنة تطوير وتبسيط إدارة المخدرات وتمكين الفحص السريع في الجسم الحي من المركبات اختبار 4. ويمكن استخدام أليغنوكليوتيد] الاصطناعية (morpholinos)، الطفرات والزنك الاصبع نوكلياز والنهج المعدلة وراثيا لتوليد بسرعة ضربة قاضية أو طفرة في الجين الزرد 5-7. تحمل هذه الخصائص الدراسات الزرد لم يسبق له مثيل تحليل القوة الإحصائية ميزة على القوارض في دراسة الاضطرابات العصبية مثل الصرع. لأن "معيار الذهب" للأبحاث الصرع هو رصد وتحليل غير طبيعية الإفرازات الكهربائية التي تنشأ في بنية الدماغ المركزية (أي، نوبات)، وهي طريقة لتسجيل نشاط المخ بكفاءة في الزرد اليرقات يوصف هنا. هذا الأسلوب هو التكيف من تقنيات التسجيل التقليدية خارج الخلية ويسمح لرصد طويل الأجل مستقرة من نشاط المخ في يرقات اسماك الزرد سليمة. Sوتظهر التسجيلات وافرة للمضبوطات الحادة التي تنتج عن تطبيق حمام المخدرات الاختلاج ونوبات عفوية سجلت في الأسماك المعدلة وراثيا.
Protocol
1. إنتاج البيض وكوكتيل
- الزرد تربية يلي الإجراءات القياسية التي سبق وصفها 8. لفترة وجيزة، يتم تعيين الزرد الكبار حتى في تربية الدبابات مع فواصل في المكان. عندما الاضواء في غرفة تأتي في صباح اليوم التالي، تتم إزالة فواصل من تربية الحيوانات الأليفة والأسماك الدبابات ما بين 20 و 60 دقيقة من الوقت التزاوج دون عائق.
- يتم جمع البيض من الدبابات في تربية مصفاة وتشطف بالماء البيض. ثم يتم نقل البيض إلى طبق بيتري مع الماء البيض. تتم إزالة الحطام وبويضة غير مخصبة باستخدام ماصة نقل.
- مكان طبق بتري تحتوي على البيض التي تم جمعها في حاضنة (28-32 ° C). يفقس البيض بعد نحو يومين بعد الإخصاب (DPF)، وإزالة أي المشيماء غيرها من الحطام مع ماصة نقل.
- على اليوم المطلوب بعد الإخصاب (3-8 DPF) إزالة اليرقات طبق بتري تحتوي على السباحة بحرية ووضعت على مقاعد البدلاء المختبر في درجة حرارة الغرفة.
SS = "jove_title"> 2. مسرى مكروي سحب وإعداد
- باستخدام مجتذب micropipette، سحب 1.2 مم OD البورسليكات الزجاج الشعرية إلى قسمين الإبر وتخزينها في طبق بتري 150 ملم مربع ماصة أو فارغة عن طريق وضع المعجون على سلالم سخيفة. يمكن سحب الإبر مسبقا. ويمكن استخدام مختلف OD الزجاج الشعيرات الدموية تبعا لنوع من مكبر للصوت headstage المتاحة.
- Backload ومسرى مكروي مع حل خارج الخلية تسجيل (2 M كلوريد الصوديوم) باستخدام حقنة 1 مل مع فلتر حقنة Nalgene (4 ملم) وMicrofil خيوط (وارنر أدوات دقيقة) المرفقة. اهتزاز أو الاستفادة من البلعة نحو غيض إبرة حتى هناك فقاعات قليلة أو معدومة المتبقية.
3. الشلل في آجار
- إعداد جديدة من حل 1.2٪ انخفاض ذوبان في الماء أجار نقطة البيض. مكان حل أجار في المياه مجموعة حمام في ~ 37 درجة مئوية.
- إعداد ساترة مع غرفة تسجيل ومكان في الفريزر (5-10 دقيقة). ينبغي لدائرة تسجيل MATCح التي كانت على منصة الكهربية. نستخدم الأضواء حمام غرفة مفتوحة الماس من أدوات التصوير وارنر (نموذج RC-26GLP).
- باستخدام ماصة باستور أو نقل أو مكان واحد الزرد اليرقات في قطرات صغيرة من الماء البيض في طبق نظيف طبق بتري. لهذا الحبرية، إضافة قطرات من محلول يحتوي على مخدر (0.02٪ tricaine) وكيل شل (1 ملغ / مل α-بنغاروتوكسين).
- رصد الزرد لفقدان الحركة (5 إلى 10 دقائق).
- إزالة ساترة / غرفة التسجيل من الفريزر. ضع دائرة على المسرح لstereomicroscope. باستخدام ماصة نقل، مزيج مل العديد من 1.2٪ منخفضة ذوبان نقطة مع قطرات الاغاروز حل ونقل (مع السمك) إلى الدائرة ساترة / التسجيل.
- تلميح باستخدام ماصة أو إبرة حادة غرامة، يرقات موقف تحت stereomicroscope بحيث يتعرض الجانب الظهري من الأسماك إلى السطح هلام الاغاروز. السماح لتتصلب الاغاروز (5-10 دقيقة)، ثم باستخدام ملعقة مسطحة لنقل ب أجارقفل إلى دائرة تسجيل وضعت على منصة الكهربية.
3. خارج الخلية الميدانية تسجيل
- إضافة 2-5 مل من وسائط تسجيل الزرد إلى غرفة تسجيل. إذا كانت التغييرات ضرورية المخدرات، يروي غرفة مع حل التسجيل بمعدل حوالي 1 مل / دقيقة. لا من الحل الأوكسجين الضروري تسجيل.
- إدراج مسرى مكروي (حوالي 1 ميكرون قطر تلميح، 2-7 MΩ) في مكبر للصوت headstage شنت على مياداة مجهرية ثلاثية الأبعاد. تأكد من أن مياداة مجهرية هي في موقف مناسب للسماح لمجموعة من الحركة والتكيف. جعل تلميح مسرى مكروي في الطائرة نظر المجهر، وارتفاع قبالة المرحلة، واستخدام التكيف الخشنة أقل إلى نقطة أعلاه فقط وقليلا أمام رئيس الزرد.
- مع مكبر للصوت في وضع "الجاري المشبك" صفر القطب.
- استخدام التكيف الخشنة أقل غيض الكهربائي بحيث يمس فقط لياليurface من الزرد، قليلا أمام الدماغ الأمامي.
- باستخدام خطوات التكيف غرامة دفع غيض الكهربائي حتى ثقوب الجلد من الزرد. السماح لتسوية ودفع الكهربائي ثم ميكرون عدة في الدماغ الأمامي.
- تسجيل النشاط الكهربائي في وضع المشبك الجاري باستخدام برنامج Axoscope. يتم الحصول على البيانات بمعدل 10 كيلو هرتز أخذ العينات من.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد أمثلة على تصريف الاستيلاء مثل electrographic سجلت في الدماغ المقدم من أجار جزءا لا يتجزأ من يرقات اسماك الزرد في الشكل 1. وقد أثار واسعة سعة التصريف انفجار متعددة في ارتفاع هذه العينات من خلال تطبيق حمام من المخدرات الاختلاج، و 40 ملي بيلوكاربين (في، 6 DPF) أو 1 ملي بيكروتوكسين (B في و 8 DPF). في هذه التسجيلات، وثبتوا ويتم رصد مستمر أجار جزءا لا يتجزأ من الزرد لمدة تصل إلى 90 دقيقة. الأسماك تبقى قابلة للحياة في ظل هذه الظروف التسجيل لمدة تصل إلى 24 ساعة. تضاف إلى الأدوية والمتوسطة الاستحمام عادة منتشر في أجار لانتزاع النشاط في الدماغ الأمامي الزرد اليرقات في غضون 30 إلى 45 دقيقة. ويمكن استخدام هذه الطريقة مع كميات صغيرة نسبيا من المخدرات حل (2-5 مل) واليرقات لا تحتاج نضح المستمر ويمكن تسجيل في تكوين حمام ثابت إذا لزم الأمر. في لوحة C، يظهر إفرازات عفوية لانفجار الزرد المعدلة وراثيا في 3 DPF؛ تم تسجيل في الزردتسجيل وسائل الإعلام. تم استخدام حقن Morpholino قليل النوكليوتيد في مرحلة الخلية 1-2 التعبير ضربة قاضية لجين لتصلب حدبي مجمع (tsc1a)، وهو شكل من الصرع لدى الأطفال المرتبطة المضبوطات والتوحد. ويمكن أيضا أن التسجيلات خارج الخلية التي تم الحصول عليها من سقف الدماغ البصرية. للحصول على أمثلة، انظر Baraban وآخرون (2005) 9 أو Baraban وآخرون (2007) 10. كما هو موضح هنا، يمكن للأحداث تختلف في الموجي الكهربائية ومدتها تبعا لآلية العمل المستخدمة لانتزاع النشاط الحجز.
الشكل 1. تسجيلات ميدانية خارج الخلية من النشاط غير طبيعي انفجار التفريغ المسجلة في الدماغ المقدم من اليرقات الزرد ويجمد جزءا لا يتجزأ من أجار. يتم وضع أقطاب كهربائية تحت تسجيل مرئيالمراقبة على مجهر BX50 أوليمبوس في وضع مستقيم. التسجيلات في (A) و (B) وبدأت ما بين 40 إلى 45 دقيقة بعد تطبيق المخدرات. (A) موضوع متعدد ارتفاع التفريغ المسجلة في بيلوكاربين، ومستقبلات أستيل المسكارينية خصم. (B) سجلت عمليات التصريف في انفجار بيكروتوكسين، وGABA-A مستقبلات. (C) A واحد التفريغ انفجار متعددة سجلت ارتفاعا اليرقات الزرد من 3 حقن DPF مع morpholino ضد tsc1a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تسجيل خارج الخلية المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة من نشاط المخ. هذه التسجيلات هي مشابهة لرصد (EEG) تخطيط كهربية تستخدم عادة لتقييم وجود التفريغ الكهربائي غير طبيعي (أي الاستيلاء) في نماذج القوارض من الصرع 11 و 12 مريضا. ويمكن الجمع بين التسجيلات خارج الخلية مع التلاعب الدوائية، كما هو موضح هنا. ويمكن أيضا هذه الأنواع من التسجيلات أن تستخدم لتقييم الظواهر الصرع المحتملة في الزرد المعدلة وراثيا. الزرد متحولة متاحة عادة لطفرات الجينات التي تم تحديدها في العديد من الطفرات شاشات ENU (انظر اسماك الزرد المركز الدولي للموارد، http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) المعدلة وراثيا أو من خلال Tol2 الناشئة 7 و إصبع الزنك تقنيات النوكليوتيدات 13. كما هو موضح هنا، ضربة قاضية الجينات السريع باستخدام[أليغنوكليوتيد] morpholino تليها الرصد الكهربية في وقت مبكر من 3 DPF يوفر وسيلة إضافية لتقييم عيوب الجين الذي يحفز الاستيلاء. يمكنك بسهولة تسجيل القطب الكهربائي توضع في أي هيكل الزرد بما في ذلك سقف الدماغ البصرية أو المخيخ، ويمكن استخدام أقطاب متعددة تسجيل إذا لزم الأمر. A الحد من هذه التسجيلات هو أنه من الصعب تقييم الموقع الدقيق للتسجيل غيض الكهربائي نسبة إلى نوى الدماغ محددة. وسوف توفر الزرد يحمل صحفيين الفلورسنت في نوى معينة أو أنواع الخلايا تخفيف هذا القيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن المؤلف أن يشكر بيتر كاسترو وDinday ماثيو لجهودهم في وقت مبكر لإقامة الزرد في المختبر. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EUREKA (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
