Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Summary

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een robuuste

Abstract

Epilepsie treft bijna 3 miljoen mensen in de Verenigde Staten en tot 50 miljoen mensen wereldwijd. Gedefinieerd als het optreden van spontane niet-uitgelokte aanvallen, kan epilepsie worden verworven als gevolg van een beschadiging aan de hersenen of een genetische mutatie. Inspanningen om het model aanvallen bij dieren is in de eerste plaats gebruikt verworven beledigingen (convulsieve geneesmiddelen, stimulatie of hersenletsel) en genetische manipulaties (antisense knockdown, homologe recombinatie of transgenese) bij knaagdieren. De zebravis is een gewervelde modelsysteem ^{1 tot 3,} dat een waardevol alternatief voor knaagdieren op basis van epilepsie onderzoek zou kunnen bieden. Zebravissen worden veel gebruikt in de studie van vertebrate genetica of ontwikkeling, een hoge mate van genetische gelijkenis met zoogdieren en drukken homologen voor ~ 85% van bekende menselijke enkel gen mutaties epilepsie. Vanwege hun geringe omvang (4-6 mm in lengte), zebravis larven worden gehandhaafd fluïdumvolumes zo laag als 100 ul tijdens de vroege ontwikkeling en arraYed in multi-well platen. Reagentia kunnen direct worden toegevoegd aan de oplossing waarin embryo's ontwikkelen, vereenvoudigen toediening en die een snelle in vivo screening van testverbindingen ^4. Synthetische oligonucleotiden (morfolino), mutagenese, zinkvinger nuclease en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om snel genereren gen knockdown of mutatie in zebravis ^5-7. Deze eigenschappen bieden zebravis studies een ongekende statistische power analyse voordeel ten opzichte van knaagdieren in de studie van neurologische aandoeningen zoals epilepsie. Omdat de "gouden standaard" voor epilepsie onderzoek is het monitoren en analyseren van de abnormale elektrische ontladingen die ontstaan ​​in een centrale structuur van de hersenen (dat wil zeggen, toevallen), een methode om efficiënt op te nemen hersenactiviteit in larvale zebravis wordt hier beschreven. Deze methode is een bewerking van conventionele extracellulaire meettechnieken en zorgt voor een stabiele lange-termijn monitoring van de hersenactiviteit in intacte zebravis larven. Sruime opnames worden getoond voor acute aanvallen geïnduceerd door bad toepassing van convulsieve geneesmiddelen en spontane aanvallen vastgelegd in een genetisch gemodificeerde vis.

Protocol

1. Ei en afhaling

1. Zebravis veeteelt volgt standaardprocedures eerder beschreven ^8. In het kort worden volwassen zebravis opgericht in kweekbakken met verdeelschotten op zijn plaats. Wanneer de verlichting in de kamer komen op de volgende ochtend, worden verdelers uit kweekbakken en vis zijn ongeveer 20 tot 60 minuten van de ongestoorde paartijd toegestaan.
2. Eieren van de fokkerij tanks worden verzameld in een zeef en gespoeld met ei water. Eieren worden vervolgens overgebracht naar een petrischaal met ei water. Onbevruchte eieren en vuil worden verwijderd met een transferpipet.
3. Place petrischaal de verzamelde eieren in een incubator (28-32 ° C). Na eitjes komen, ongeveer twee dagen na de bevruchting (DPF), verwijder chorion en alle ander vuil met een transfer pipet.
4. Op gewenste dagen na de bevruchting (3 tot 8 dpf) verwijderen petrischaal met vrij zwemmen larven en plaats op laboratoriumtafel bij kamertemperatuur.

1. Met behulp van een micropipet trekker, trek een 1,2 mm OD borosilicaatglas in twee naalden en bewaar ze op een 150 mm petrischaal of lege pipet box capillair door het leggen van meer dan Silly Putty hellingen. Naalden kunnen worden getrokken vooraf. OD verschillende glazen capillairen kunnen worden gebruikt afhankelijk van het type versterker headstage beschikbaar.
2. Obstructies de micro-elektrode met extracellulaire oplossing (2 M NaCl) met een 1 ml spuit met een Nalgene spuitfilter (4 mm) en Microfil filament (Warner Precision Instruments) gekoppeld. Schud of tik op de bolus in de richting van de naald totdat er weinig of geen luchtbellen blijven.

3. Immobilisatie in Agar

1. Bereid een verse oplossing van 1,2% laag smeltpunt agar in water ei. Plaats agar oplossing in een waterbad bij ~ 37 ° C.
2. Bereid een dekglaasje met opname kamer en plaats in de vriezer (5-10 min). De opname kamer moet MATCh dat gebruikt op de elektrofysiologie rig. We maken gebruik van een low-profile open ruitvormige bad imaging kamer van Warner Instruments (Model RC-26GLP).
3. Met behulp van een Pasteur pipet of overdracht, plaats een larvale zebravis in een klein druppeltje van ei water in een schone petrischaal plaat. Deze druppel, voeg een druppel oplossing die een anestheticum (0,02% tricaine) en verlammende agent (1 mg / ml α-bungarotoxin).
4. Monitor zebravis voor het verlies van beweging (5 tot 10 min).
5. Verwijder het dekglaasje / opname kamer uit de vriezer. Plaats kamer op het podium van een stereomicroscoop. Met een transferpipet Meng enkele milliliters 1,2% laag smeltpunt agarose met druppeltje en overdracht oplossing (vis) het dekglaasje / opname kamer.
6. Met een pipetpunt of fijne stompe naald positie larven onder de stereomicroscoop zodat het dorsale aspect van de vis is blootgesteld aan de agarose gel oppervlak. Laat agarose uitharden (5-10 min), vervolgens met behulp van een platte spatel overdracht van de agar bvergrendelen om een ​​opname kamer opgezet op een elektrofysiologie rig.

3. Extracellulaire Field Recording

1. Voeg 2-5 ml zebravis opnamemedium de opname kamer. Als drug wijzigingen nodig zijn, perfuseren kamer met opname oplossing bij een snelheid van ongeveer 1 ml / min. Nr. oxygenatie van de opname oplossing nodig.
2. Plaats een micro-elektrode (ongeveer 1 pm tip diameter, 2-7 MQ) in de versterker headstage gemonteerd op een driedimensionaal micromanipulator. Controleer of de micromanipulator in de juiste positie om een ​​bewegingsbereik en aanpassing. Breng de micro-elektrode tip in het vlak van uitzicht op de microscoop, hoog boven het podium, en het gebruik van grove afstelling lagere naar een punt net boven en iets in de voorkant van het hoofd van de zebravis.
3. Met de versterker in "current-clamp" mode nul de elektrode.
4. Met behulp van grove instelling lager de punt van de elektrode, zodat het net raakt de surface van de zebravis, iets voor de voorhersenen.
5. Met behulp van fijne afstelling stappen vooraf de punt van de elektrode tot het puncties de huid van de zebravis. Laat het bezinken en de elektrode vooraf enkele microns in voorhersenen.
6. Noteer elektrische activiteit in de huidige-klem modus met behulp van Axoscope software. De gegevens worden verkregen bij een bemonsteringsfrequentie van 10 kHz.

Representative Results

Voorbeelden van elektrografische beslag-achtige ontlading opgenomen in de voorhersenen van een agar ingebedde zebravis larven worden getoond in Figuur 1. Grote amplitude multi-spike burst ontlading in deze monsters werd opgewekt door toepassing van een bad convulsant geneesmiddel, 40 mM pilocarpine (in A, 6 dpf) of 1 mM picrotoxin (in B, 8 dpf). In deze opnames geïmmobiliseerd en agar ingebedde zebravissen worden continu bewaakt tot 90 min. Vissen levensvatbaar blijven onder deze opnameomstandigheden tot 24 uur. Geneesmiddelen worden toegevoegd aan het medium en zwemmen gewoonlijk diffunderen in de agar de activiteit van de larvale zebravis voorhersenen wekken binnen 30 tot 45 min. Deze methode kan met relatief kleine hoeveelheden geneesmiddeloplossing (2-5 ml) als larven vereisen geen continue perfusie en kan worden opgenomen in een statische configuratie bad indien nodig. In paneel C wordt een burst spontane ontlading weergegeven voor een genetisch gemodificeerde zebravis op 3 dpf; opname gemaakt in zebravisopnamemedia. Morfolino oligonucleotide injectie de 1-2 cellig stadium werd toegepast om knockdown expressie van een gen voor Tubereuze Sclerose Complex (tsc1a), een pediatrische vorm van epilepsie geassocieerd met convulsies en autisme. Extracellulaire opnamen kunnen ook worden verkregen uit de optische tectum. Voor voorbeelden, zie Baraban et al.. (2005) ⁹ of Baraban et al.. (2007) ^10. Zoals hier getoond, kan de elektrische gebeurtenissen variëren in golfvorm en duur afhankelijk werkingsmechanisme gebruikt om epileptische activiteit te wekken.

Figuur 1. Extracellulaire veldopnames abnormale burst ontladingsactiviteit opgenomen in de voorhersenen en van geïmmobiliseerde agar ingebedde zebravis larven. Registrerende elektroden zijn geplaatst onder visueleopmerking over een Olympus BX50 rechtop microscoop. Opnamen in (A) en (B) ingeleid ongeveer 40 tot 45 minuten na Drug Application. (A) Multi-spike ontlading opgenomen in pilocarpine, een muscarine acetylcholine receptor antagonist. (B) Burst lozingen die in picrotoxin een GABA-A receptor antagonist. (C) Een enkele multi-spike uitbarsting ontlading opgenomen van een 3-dpf zebravis larven geïnjecteerd met een morfolino tegen tsc1a.

Discussion

De extracellulaire methode hier gepresenteerde maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van de hersenactiviteit. Deze opnames zijn analoog aan elektro-encefalogram (EEG) monitoring vaak gebruikt om de aanwezigheid van abnormale elektrische ontlading (dat wil zeggen, in beslag) in diermodellen voor epilepsie ¹¹ en patiënten van ¹² te evalueren. Extracellulaire opnamen kunnen worden gecombineerd met farmacologische manipulaties, zoals hier getoond. Deze soorten opnamen kunnen ook worden gebruikt om mogelijke epileptische fenotypes evalueren genetisch gemodificeerde zebravis. Mutant zebravis zijn algemeen beschikbaar voor vele genmutaties geïdentificeerd in ENU mutagenese schermen (zie zebravis International Resource Center, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) of door middel van opkomende Tol2 transgene ⁷ en zinkvinger nucleotide ¹³ technieken. Zoals hier aangetoond, snelle gen knockdown met behulp vanmorfolino-oligonucleotiden, gevolgd door elektrofysiologische controle zo vroeg als 3 dpf biedt een extra methode om beslag te leggen-inducerende gendefecten te beoordelen. De registratie-elektrode kan gemakkelijk worden geplaatst in een zebravis, omvattende de optische tectum of cerebellum, en meerdere registrerende elektroden kunnen worden gebruikt indien nodig. Een beperking van deze opnamen is dat het moeilijk is om de exacte locatie van de opname elektrode ten opzichte specifieke hersenkernen beoordelen. De beschikbaarheid van zebravis dragen fluorescerende verslaggevers in specifieke kernen of celtypen zal de gevolgen van deze beperking.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low melting	Fisher-Scientific	BP1360-100	Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0.02%
α-bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 mg/ml
Capillary glass tubing	Warner Instruments	G120TF-3	Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier	Warner Instruments	PC-505B	We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Filter/amplifier	Cygnus Technology	FLA-01	We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Axon A/D board and Axoscope software	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2	Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions.
Egg water	Instant Ocean		3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water