Summary
Un metodo semplice per registrare potenziali di campo extracellulari nel proencefalo larvale zebrafish è descritto. Il metodo fornisce un robusto
Abstract
L'epilessia colpisce circa 3 milioni di persone negli Stati Uniti e fino a 50 milioni di persone in tutto il mondo. Definito come il verificarsi di convulsioni non provocate spontanee, epilessia può essere acquisita a seguito di un insulto al cervello o una mutazione genetica. Gli sforzi per sequestri modello su animali hanno principalmente utilizzato acquisito insulti (farmaci convulsivanti, stimolazione o lesione cerebrale) e manipolazioni genetiche (atterramento antisenso, ricombinazione omologa o transgenesi) nei roditori. Zebrafish sono un sistema modello vertebrato 1-3 che potrebbe fornire una valida alternativa al roditore ricerca basata epilessia. Zebrafish sono ampiamente utilizzati nello studio dei vertebrati genetica o di sviluppo, presentano un elevato grado di somiglianza genetica ai mammiferi ed esprimere omologhi per ~ 85% di umani noti singolo gene mutazioni epilessia. A causa delle loro piccole dimensioni (4-6 mm di lunghezza), larve di zebrafish può essere mantenuta in volumi di fluido a partire da 100 pl durante lo sviluppo precoce e ARRAYED in multi-pozzetti. I reagenti possono essere aggiunti direttamente alla soluzione in cui gli embrioni sviluppano, semplificando la somministrazione del farmaco e consentendo un rapido screening in vivo di composti di prova 4. Oligonucleotidi sintetici (Morpholinos), mutagenesi, zinc finger nucleasi e approcci transgenici possono essere utilizzati per generare rapidamente knockdown gene o mutazione in zebrafish 5-7. Queste proprietà permettersi studi zebrafish senza precedenti analisi statistica vantaggio potere roditori nello studio di disturbi neurologici come l'epilessia. Poiché il "gold standard" per la ricerca l'epilessia è quello di monitorare e analizzare le scariche elettriche anomale che hanno origine in una struttura cerebrale centrale (ad esempio, convulsioni), un metodo per registrare in modo efficiente l'attività cerebrale in larvale zebrafish è descritto qui. Questo metodo è un adattamento dei tradizionali tecniche di registrazione extracellulari e permette stabile monitoraggio a lungo termine di attività cerebrale in larve di zebrafish intatto. Sregistrazioni ampie sono mostrate per crisi acute indotte da bagno applicazione di farmaci convulsivanti e sequestri spontanei registrati in un pesce geneticamente modificato.
Protocol
1. Uovo di produzione e raccolta
- Zebrafish allevamento segue le procedure standard descritte in precedenza 8. In breve, zebrafish adulti vengono impostate in acquari di riproduzione con divisori in atto. Quando le luci in sala si accendono la mattina seguente, divisori vengono rimossi da acquari di riproduzione e pesci sono autorizzati circa 20 a 60 minuti di tempo di accoppiamento indisturbato.
- Uova da vasche di allevamento sono raccolti in un colino e sciacquato con acqua uovo. Uova vengono poi trasferiti ad una piastra di Petri con acqua uovo. Uova non fecondate e detriti vengono rimossi con una pipetta di trasferimento.
- Luogo piatto Petri contenente le uova raccolte in un incubatore (28-32 ° C). Dopo le uova si schiudono, circa due giorni dopo la fecondazione (dpf), rimuovere corion e altri detriti con una pipetta di trasferimento.
- Il giorno desiderato post-fertilizzazione (3-8 dpf) rimuovere piastra Petri contenente larve liberamente nuoto e posto sul banco del laboratorio a temperatura ambiente.
- Utilizzando un estrattore micropipetta, tirare un mm 1,2 diametro esterno in vetro borosilicato capillare in due aghi e conservare in un piatto 150 millimetri Petri o scatola vuota pipetta da posa su rampe Silly Putty. Aghi può essere tirato in anticipo. Diversa OD capillari di vetro possono essere utilizzati a seconda del tipo di amplificatore headstage disponibili.
- Ritardare l'microelettrodo con soluzione di registrazione extracellulare (2 M NaCl) utilizzando una siringa da 1 ml con una siringa Nalgene filtro (4 mm) e Microfil filamento (Warner Precision Instruments) allegata. Agitare o picchiettare il bolo verso la punta dell'ago fino a quando non ci sono bolle o non ancora.
3. Immobilizzazione in Agar
- Preparare una soluzione fresca di 1,2% agar a basso punto di fusione in acqua uovo. Soluzione da agar in un set da bagno di acqua a ~ 37 ° C.
- Preparare un vetrino con la camera di registrazione e mettere in freezer (5-10 minuti). La camera di registrazione dovrebbe MATCh quello utilizzato sulla piattaforma elettrofisiologia. Usiamo un basso profilo aperto bagno camera di diamante immagini da Warner Instruments (RC-26GLP).
- Usando una pipetta Pasteur o il trasferimento, mettere un pesce zebra larvale in una goccia d'acqua uovo in un piatto pulito piastra di Petri. Per questo gocciolina, aggiungere una goccia di soluzione contenente un anestetico (0,02% tricaine) e agente paralizzante (1 mg / ml α-bungarotossina).
- Monitorare zebrafish per la perdita di movimento (da 5 a 10 minuti).
- Rimuovere il coprioggetto / camera di registrazione dal congelatore. Posizionare camera sul palco di uno stereomicroscopio. Usando una pipetta di trasferimento, mescolare alcuni millilitri di 1,2% di agarosio a basso punto di fusione con la gocciolina e la soluzione di trasferimento (con pesce) al coprioggetto / registrazione da camera.
- Utilizzando un puntale o con ago sottile smussato, larve posizione sotto lo stereomicroscopio in modo che la parte dorsale del pesce è esposto alla superficie del gel di agarosio. Lasciar indurire agarosio (5-10 minuti), quindi utilizzando un trasferimento spatola piatta del b agarbloccare ad una camera di registrazione impostato su una piattaforma elettrofisiologia.
3. Campo di registrazione extracellulare
- Aggiungere 2-5 ml di supporti di registrazione zebrafish alla camera di registrazione. Se droga cambiamenti sono necessari, camera profumato con soluzione di registrazione ad una velocità di circa 1 ml / min. No ossigenazione della soluzione di registrazione è necessaria.
- Inserire un microelettrodo (circa 1 micron di diametro punta, 2-7 MW) nel headstage amplificatore montato su un tridimensionale micromanipolatore. Controllare che il micromanipolatore è in una posizione appropriata per consentire una gamma di movimento e regolazione. Portare la punta microelettrodo nel piano di vista del microscopio, alto fuori fase, e con regolazione grossolana inferiore ad un punto appena sopra e leggermente davanti alla testa della zebrafish.
- Con l'amplificatore in modalità "current-clamp" zero dell'elettrodo.
- Uso della regolazione grossolana abbassare la punta dell'elettrodo in modo che tocchi solo la surface del zebrafish, leggermente davanti proencefalo.
- Usare passi di regolazione fine avanzare la punta dell'elettrodo fino perfora la pelle del zebrafish. Lasciar depositare e poi avanzare l'elettrodo alcuni micron nel proencefalo.
- Registrare l'attività elettrica in current-clamp mode utilizzando il software Axoscope. I dati vengono acquisiti ad una frequenza di campionamento di 10 kHz.
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Representative Results
Esempi di elettrografico sequestro-come scarico registrata nel proencefalo di agar-embedded larve zebrafish sono mostrati nella Figura 1. Grande ampiezza multi-picco di scarico scoppio in questi campioni è stata evocata da bagno applicazione di un farmaco convulsivante, 40 pilocarpina mM (in A, 6 dpf) o 1 picrotossina mM (in B, 8 dpf). In queste registrazioni, immobilizzato e agar-embedded zebrafish sono continuamente monitorati per un massimo di 90 min. Pesce rimangono vitali in queste condizioni di registrazione per un massimo di 24 ore. Farmaci vengono aggiunti al mezzo di balneazione e normalmente diffuse in agar di suscitare attività nel larvale zebrafish proencefalo entro 30 a 45 min. Questo metodo può essere utilizzato con modeste quantità di soluzione di farmaco (2-5 ml) come larve non richiedono perfusione continua e può essere registrato in un bagno di configurazione statica, se necessario. Nel pannello C, una scarica scoppio spontaneo viene mostrato per una zebrafish geneticamente modificato a 3 dpf, la registrazione è stata fatta in zebrafishsupporti di registrazione. Iniezione Morpholino oligonucleotide in fase di cella 1-2 è stato utilizzato per atterramento espressione di un gene per la sclerosi tuberosa (tsc1a), una forma di epilessia pediatrica associata a convulsioni e l'autismo. Registrazioni extracellulari può anche essere ottenuto dal tetto ottico. Ad esempio, vedere Baraban et al. (2005) 9 o Baraban et al. (2007) 10. Come mostrato qui, gli eventi elettrici può variare in forma d'onda e la durata in base al meccanismo di azione utilizzato per stimolare l'attività convulsiva.
Field recordings Figura 1. Extracellulari di attività anomale scarico scoppio registrato nel proencefalo di immobilizzato e agar-embedded larve di zebrafish. Elettrodi di registrazione sono posizionati sotto visivaosservazione con un microscopio Olympus BX50 verticale. Registrazioni in (A) e (B) sono stati avviati circa 40 a 45 minuti dopo l'applicazione di droga. (A) Multi-scarico picco registrato in pilocarpina, un antagonista dei recettori muscarinici dell'acetilcolina. (B) scarichi Burst registrata in picrotossina, un GABA-A antagonista del recettore. (C) un unico multi-picco di scarico scoppio registrato da un larve di zebrafish 3 dpf iniettato con una morfolino contro tsc1a.
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Discussion
Il metodo di registrazione extracellulare qui presentata consente un'analisi molto sensibile e rapida di attività cerebrale. Queste registrazioni sono analoghi a elettroencefalografico (EEG) monitoraggio comunemente utilizzato per valutare la presenza di scarica elettrica anomala (cioè, sequestro) in modelli di roditori di epilessia 11 e 12 pazienti. Registrazioni extracellulari possono essere combinati con manipolazioni farmacologiche, come illustrato di seguito. Questi tipi di registrazioni possono anche essere utilizzati per valutare potenziali fenotipi epilettici in zebrafish geneticamente modificati. Zebrafish mutanti sono comunemente disponibili per le mutazioni genetiche identificate in molti schermi di mutagenesi ENU (vedi Zebrafish International Resource Center, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) o attraverso emergenti Tol2 transgenici 7 e zinco dita nucleotidi 13 tecniche. Come dimostrato qui, knockdown gene rapido utilizzandooligonucleotidi morpholino procedure di monitoraggio elettrofisiologico già il 3 dpf fornisce un ulteriore metodo per valutare la crisi che induce difetti del gene. L'elettrodo di registrazione può essere facilmente posizionato in qualsiasi struttura zebrafish compreso il tetto ottico o cervelletto, ed elettrodi di registrazione multiple possono essere utilizzati, se necessario. Una limitazione di queste registrazioni è che è difficile valutare la posizione precisa della punta dell'elettrodo di registrazione relativo nuclei cerebrale specifico. La disponibilità di pesce zebra che trasportano reporter fluorescenti in nuclei specifici o tipi di cellule si mitigare questa limitazione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
L'autore desidera ringraziare Peter Castro e Matteo Dinday per i loro primi sforzi per stabilire zebrafish in laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health EUREKA sovvenzione (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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