Summary
성인 초파리 연상 메모리를 측정하는 방법을 설명한다. 분석은 네거티브 강화제 (감전)되게 냄새를 연결하고 메모리가 측정 될 수 있도록 추후에이 정보를 기억하는 비행의 능력에 기초한다.
Abstract
초파리는 따라서 크게인지 질병 1-7에 관련된 분자 메커니즘의 해명을 포함하여, 메모리에 대한 우리의 이해를 용이 40 년 이상 고전적 조건 형성 실험에서 사용되어왔다. 학습 및 기억은 성인 가소성 유전자 1-7의 기여를 측정하는 신경 발달 8-10 유전자의 효과를 연구하기 유충 및 초파리에서 정량 할 수있다. 또한, 초파리의 짧은 수명은 나이 관련 기억 손상을 매개 5,11-13 유전자의 분석을 용이하게한다. 초파리 신경계를 세분화 많은 유도 성 프로모터의 가용성은 언제 어디서 관심의 유전자가 일반 메모리뿐만 아니라 보강 신호 3,4,14,16의 다양한 측면의 릴레이에 필요한 것이 가능 확인 할 수 있습니다.
성인 초파리에서 공부하는 메모리의 상세한 분석이 가능동작과 관련된 회로 및 장기 메모리 (15) -17의 측정. 성인 스테이지의 길이가 메모리에 3-6,11-13,15-21 노화 및 신경 퇴행성 질환의 효과를 결정하는 단계에 더하여, 메모리의 장기간 유전 행동,식이 요법 및 약물 학적 조작을 수용한다.
고전적 조건 형성은 동물에 의해 서로 연관 될 중립 냄새 큐 (조건 자극, CS +) 및 보강 자극, 예를 들면., 감전, 크로스, (무조건 자극, 미국)의 동시 프레 젠 테이션에 의해 유도된다 1.16. 두번째 조건 자극 (CS는 -) 이후 미국을받지 않고있다. 테스트 단계에서 초파리 동시에 CS + 및 CS - 냄새되게됩니다. 초파리는 악취를 선택할 시간을 제공 한 후, 동물의 분포가 기록된다. 이 절차는 알기온은 혐오 또는의 욕구 조절이 안정적으로 조절 자극 중 하나에 대한 타고난 환경에 의해 도입 편견없이 측정 할 연관. 다양한 제어 실험은 모든 유전자형 혼자 냄새와 보강 정상적으로 동작하는지 테스트하기 위해 수행된다.
Introduction
여기에 제시된 방법은 몇 가지 작은 수정 1 툴리와 퀸으로 설명한다는 것입니다. 초파리는 첫 번째 단계에서 훈련되고 훈련 파리는 두 번째 단계에서 시험된다 : 실험은 두 단계로 수행된다. 훈련하는 동안, 파리의 그룹이 동시에 악취에 노출 일 (CS +) 및 교육 튜브에 전기 충격 (미국). 전기 충격없이 - 파리는 냄새 2 (CS)를받을 수 있습니다. 쇼크 특정 냄새의 페어링이 단일 한 사이클 트레이닝이라고하며, 가장 자주 사용되는 냄새는 4 - 메틸 시클로 헥산 (MCH) 및 3 - 옥탄 올 (10 월)이다.
한 사이클 훈련은 최대 7 시간 동안 검출 될 수있는 메모리의 불안정한상의 형성에 이르게; 그러나, 메모리는 일반적으로 불리는 학습, 인수 또는 2 분의 메모리가 무엇인지 확인하는 즉시 시험한다. 30 분 또는 1 시간을 측정하는 반면 메모리, 단기 메모리 칭한다3 시간 메모리는 중기 메모리로서 지칭된다. 교육주기 (간격 훈련) 사이의 간격을 반복 훈련 사이클 파리의 노출은 CREB 전사에 따라 다르며 주까지 지속되는 장기 기억의 통합 된 형태로 이어집니다. 갭 (한 덩어리로 만들어진 교육)이없는 교육은 일반적으로 교육 7,13,15-17,20,21의 5 사이클 후 24 시간을 측정한다 장기 기억과 유사한 마취 저항 메모리 (ARM)의 형성에 이르게.
이 방법으로, 메모리의 이러한 상이한 위상에 다양 유전자 돌연변이의 효과를 결정할 수있다. 활성화 또는 특정 신경 세포의 신경 활동을 차단하는 담색 또는 온도에 민감한 유전자의 프로모터 구동 식 한 메모리 수집, 통합 및 검색 3,4,11,15,16,20에 요구되는 뉴런 조사 할 수 있습니다, 22 ~ 24. 이 F 때문에 연령과 관련된 기억 손상을 연구 할 때 1 시간에 메모리는 일반적으로 측정된다메모리의 ORM은 11-13 노화의 영향에 특히 취약 나타납니다. 행동 및 유전 컨트롤 전체 범위는 메모리 실험을 수행하는, 예를 들어, 성능 결함 때문에 중앙 메모리 결함이나 충격이나 후각 큐 5 -7 감지에서 플라이 방지 말초 감각 결함 여부를 확인하는 한 7, 25, 26.
Protocol
1 비행 준비
- 유전 적 배경 (26)에 대한 제어하기 위해 행동 실험을하기 전에 적어도 6 세대, 모든 돌연변이, GAL4 / UAS 및 CSw- 같은 야생형 균주와 다른 라인을 교배.
- 특정 조작이 다른 온도를 필요로하지 않는 25 ° C에서 12시 12분 시간의 명암주기에 따라 표준 옥수수 가루, 효모 및 당밀 음식 다이어트에 파리를 성장.
- 형질 전환 유전자 발현의 효과를 확인하려면 : 사용 18 °를 C는 개발을 통해 GAL4 Gal80 TS (TARGET 시스템)의 도입 유전자의 발현을 방지하고 1~2일 행동 실험 전에 30 ° C 배양기에 파리를 이동합니다. 형질 전환 유전자 발현 3,4,6,7,14의 효과를 결정하기 위해 30 ° C에서 실험을 실시한다.
- 신경을 자극하는 열 활성화 TRPA1 채널을 사용하여 실험 : 알려진 온도 인 23 ° C,에서 파리를 올립니다비활성 채널을 유지하고 신경을 표현하는 TRPA1을 활성화하기 위해 30 ° C에서 동작 방으로 이동합니다.
- 시냅스 출력 11, 14, 24을 차단하는 중요한 Shibire 온도를 사용하여 실험의 경우 : 후면 18 ° C에서 파리와 30 ° C에서 테스트를 실시하고 있습니다.
- 실험 전에 파리 1-2 일 수집과 빛 CO 2 마취하에 약 25의 그룹으로 계산한다. 12시 12분 시간 광 환경 제어 방에 70 %의 상대 습도 (특정 조작이 다른 온도를 요구하지 않는 한), 25 ° C에서 파리 식품 유리 병에서 O / N을 적어도 (효모없이)를 저장 : 어두운 상황을 때까지 실험.
참고 :이 스토리지 파리는 초파리 학습을위한 최적의 조건을 가지고 환경 제어 방에서 수행 된 이후의 학습 테스트에 순응 할 수 있도록하는 것은하고, 중요한 것은, 어떤 일 ENVI를 제거행동 표현형에 영향을 미칠 수있는 환경적인 변화.
실험 전에 2 준비
- 주문 제작 방풍 T-미로 실험 (그림 1)을 수행합니다.
- 정기적으로 밀폐 씰은 실험 기간 동안 얻을 수 있도록 피팅 튜브를 확인합니다. 필요한 경우, T-미로 내부를 구획 밀봉 O-링을 변경.
- 교육 튜브 내부에 맞춤 구리 그리드를 배치합니다. 확인하고 정기적으로 이러한 그리드를 청소하고, 산화 된 경우 교체합니다. 전기 자극기에 연결된 스위치 박스에 실행 악어 클립을 통해 와이어에 구리 그리드를 연결합니다. 장치는 필요한 충격을 전달 될 수 있도록 전압계를 사용합니다.
- 어떤 공기 누출을 방지하기 위해 긴밀하게 미로를 보유하는 g-클램프를 사용합니다.
- 공기 펌프로 실행 튜브에 T-미로를 연결, 허용하는 냄새는 파리에서 그려지고 이후 T-미로에서 제거합니다. 온화한 공기를 유지~ 2 L / min으로 흐름
3 냄새 희석
- 파리가 모두 냄새에 대한 동일한 선호를 표시하도록 농도에서 두 개의 서로 다른 냄새를 사용합니다. 미네랄 오일 7,13에 희석 : 4 - 메틸 시클로 헥산 (1:67) 3 옥탄 올을 (100 일)를 사용합니다.
참고 : 조심스럽게 실험실에 따라 다를 수 이러한 농도를 결정합니다. 예를 들어 다른 사람은 모두 냄새 24 1:10을 사용합니다. 일반적으로 사용되는 다른 냄새 에틸 아세테이트 및 이소 아밀 아세테이트를 포함한다. - 피펫 따라서 냄새의 깃털로 파리를 노출, 공기가 컵에 냄새에 그려 질 수있는 구멍이 상단이 플라스틱 튜브에 의해 덮여 냄새 블록에 배치 맞춤 냄새 컵에 희석 냄새의 30 μL.
(4) 교육 프로토콜 (그림 1과 2)
- 성인 후각 충격 조화를 들어, 희미한 붉은 빛 아래의 모든 실험 (예., 빨간색 LED), 연구자가 볼 수 있도록 수행하지만 플로리다 방지이와 같이 입력 영상과 반대로 파리 후각에 집중할 수 보는 Y.
- 교육 튜브에 파리를 소개하고 T-미로에 부착하고 90 초 동안 튜브와 공기 흐름에 적응 할 수 있습니다.
- 60 초간의 전체 지속 기간 동안 (3.75 초 펄스 간 간격과 열두 1.25 초 펄스들로 이루어진) 60 V의 충격으로 제 냄새 (4-메틸 시클로 헥산, MCH)을 제시한다.
- 냄새 나 충격없이 30 초 휴식 기간이 충격을 따르십시오.
- 충격없이 60 초 동안 초 냄새 (3 - 옥탄 올, OCT를) 현.
- 냄새 나 충격없이 30 초 휴식 기간이 충격을 따르십시오.
- 이러한 낡은 마우스 매트 부드러운 표면에 T-미로의 바닥을 두드리는 부드럽게 옆으로 T-미로를 켜서 T-미로의 중앙 챔버로 교육 실에서 파리로 이동합니다. 90 초 동안 중앙 챔버에서 파리를 유지한다.
- 보로 선택 튜브를 장착장치의 ttom는 T-미로를 형성한다.
- 학습을 측정 그들은 동시에 냄새에 노출 된 T-미로의 선택 지점에 파리를 이동 한 방향으로 이동합니다. 120 초 동안 시험 기간을 수행.
- 트랩하여 최대 중앙 챔버를 슬라이딩 선택 튜브의 끝을 차단하여 선택 튜브의 파리. T-미로의 각 팔에 음식 튜브 및 횟수에 중앙 구획에 파리를 수집합니다.
- 메모리를 측정 교육 (4.6) 후 파리를 수집하고 누룩을 넣지 않은 식품 유리 병에 T-미로로 전송합니다. 저장소 (소개 참조) 관심 메모리 위상을 결정하기 위해 필요한 남은 시간 동안 25 ° C에서 어두운 70 % 습도에서 파리. 단계 4.7에서와 같이 T-미로 파리를 재 도입.
- 장기 기억은, 파리의 여러 배치가 동시에 훈련 할 수있는 사용자 지정 내장 된 미로를 사용합니다. 15 분 간주기 간격 (스파와 교육의 5주기를 관리CED) 또는 간주기 간격없이 (밀집). 시험 때까지 어둠 속에서 18 ° C에서 파리와 70 %의 습도를 유지한다. 테스트에 앞서, 25 ° C로 파리를 이동하고 적어도 1 시간 동안 순응 할 수 있습니다. 장기 기억에게 훈련 후 24 시간을 평가합니다.
- 행동 실험 후, 뜨거운 물, 무취의 세제 냄새 컵을 청소합니다. 10 μL의 sigmacote으로 건조 후, 코트 컵. 전자 레인지에 의한 가열 건조를 sigmacote. 때때로 뜨거운 물, 무취의 세제 방풍 튜브 및 악취 차단 T-미로를 청소합니다.
성과 지표의 5 계산 : 파리 '메모리의 측정
- 마이너스 파리 (CS의 총 개수로 나눈 충격 페어링 냄새 (CS +)를 선택하는 파리의 수 - 충격 페어링 냄새 (CS)을 피하는 파리의 수와 같은 각각의 조건에 대한 성능 지수 (PI)를 계산 - + CS +) 1.
PErformance 지수 (PI) = (# CS는 - 파리 - # CS +가 파리) / (# 총 파리) - MCH는 충격 페어링 냄새 및 OCT를 충격 페어링 냄새시킨 하나시킨 실험의 PI를 평균화함으로써 실험의 최종 PI를 계산한다. 이것은 하나의 냄새에 대한 높은 선호도를 갖는 파리의 편견을 제거합니다.
6 감각 운동 제어
- T-미로 6,7,17로 ~ 40-50 파리를 도입하여 악취 시력을 수행합니다.
- 90 초 후, 선택 포인트로 파리를 이동하고 순수한 냄새와 공기 사이에서 선택을 그들에게 두 분을 할 수 있습니다.
- 수집하고 파리를 계산합니다. 테스트에 참여하는 사람들에 의해 악취를 선택 파리의 총 수를 나눔으로써 회피 백분율을 계산한다.
- 충격 반응성 6,7,17 들어 충격 챔버에 파리를 소개한다.
- 나머지의 90 초 후, 파리 유사한 탈출 할 수있는 60-V DC 감전, 관리충격이없는 튜브.
- 파리가 선택할 수있는 두 분을 허용; 수집하고 파리를 계산합니다. 실험에서 파리의 전체 숫자로의 충격 관을 탈출하여 충격을 피할 파리의 개수를 나눔으로써 충격 회피 백분율을 계산한다. 전기 충격을 탈출 자들의 총에 중앙 챔버에 남아 파리를 포함합니다.
Representative Results
성능 지수 (PI)가 메모리의 척도로서 기능한다. 표 1은 PI의 대표적인 계산을 도시한다.
| MCH는 충격과 짝 | 3-OCT를 충격과 짝 |
| OCT (튜브) MCH 피하는 파리 = 80 (MCH 튜브) MCH 선호 파리 = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0.6 | (MCH 튜브) OCT를 회피 파리 (75) = OCT (튜브) OCT를 선호하는 파리 25 = PI 2 = (75-25) / (+ 25 75) = 0.5 |
| 실험 = (0.6 + 0.5)의 PI /2=0.55 |
표 1에 도시 된 데이터를 사용하여 성능 지수의 계산 대표. 다른 실험에 대한 성능 지수는 메모리 효과를 규명하기 위해 비교 될 수있다. 예를 한 번비교는 광저우 S 야생형 성인 파리 (WT)과 무지 렁 한 많은 돌연변이 성인 학습 수행 한 일련의 실험의 결과를 포함 그림 3에 표시됩니다. 10 연구 책임자의 평균은 평균의 표준 오차 (SEM)을 나타내는 오차 막대와 함께 제공됩니다. 이러한 결과는 무지 렁 파리 야생형에 비해 학습의 감소를 보여 있음을 보여줍니다.
그림 1 성인 실험 장치. 파리 등은 충분한 지식과 T 미로에서 시험한다. 훈련은 전기 충격이없는 초 악취 B 다음에 전기 충격 악취을 제시하는 작업이 포함됩니다. 중간 챔버의 휴식 기간이 지난 후에 파리 동시에 냄새 두되게됩니다. 파리 갇혀있다이 튜브에 수집과 학습 / 메모리 점수를 얻기 위해 계산합니다.
그림 2 성인 교육 프로토콜. 파리는 두 단계로 훈련된다. 파리 60 초 동안 냄새 전기 충격 (미국)와 짝 (CS +)를 수신하는 첫 번째 단계. 다음 단계에서 파리는 전기 충격이없는 초 냄새 (CS-)을받을 수 있습니다. 파리는 그 때 CS + 및 CS - 사이 그들의 선택에 대한 시험 후 90 초 동안 휴식을 사용할 수 있습니다.
그림 3 성인 초파리에 무지 렁이 야생형 학습을 보여주는 대표적인 그래프. 무지 렁 파리 훈련의 한 세션 다음 시험 하였다. 무지 렁 파리는 WT (N = 10)에 비해 학습의 감소를 보여줍니다.
Discussion
여기에 제시된 성인 초파리 후각 충격 학습 분석은 장기 기억 15-17 포함한 메모리의 상이한 위상을, 기본 분자 메커니즘의 분석을 허용한다. 뿐만 아니라 생체 리듬 (18), 수면 (19), 다이어트 (20, 21), 노화 11-13, 신경 퇴행성 질환 (5)와 약물 치료 메모리 5,6,19의 효과의 판정 등.
대부분의 강력한 접근 방식은 최근에 파리 3,4,7,11,16,27 후각 기억을 매개 신경 회로의 기능적인 이미징을 위해 개발되어왔다. 이러한 optogenetic 기술은 초파리 (14, 16)에서 사용할 수있는 다른 발기인의 광대 한 레퍼토리를 사용합니다. 이러한 프로모터는 메모리 추적에 특정 유전자 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 메모리 뉴런 16,27에서 유전자 인코딩 칼슘과 캠프 기자를 표현하는 데 사용됩니다.
목성인의 조건 발기인 및 돌연변이 전자의 사용은 메모리 3,4,6,7,13,14의 유전자 제품의 사후 개발 역할에 대한 연구를 할 수 있습니다. 이미징 및 동작 방법은 상기 자극 또는 그 기능을 해명하기 위해 메모리 회로 11,14,16,22-24에서 다른 뉴런을 억제하는 담색 및 열 - 활성화 채널과 결합 될 수있다. 또한, 버섯 본체 메모리 뉴런은 초파리 후각 메모리 (29)를 모델링하는 데 사용되는 전체 세포 패치 클램프 녹음 (28), 수학 및 계산 기술에 액세스 할 수 있습니다.
여기 소개 연상 메모리 프로토콜의 다른 형태와 조합 한 실험 진행은, 노화, 질병, 초파리가 처벌, 동기, 중독 보상에 응답하여 발생하는 연상 메모리에서 분자 - 회로 레벨 변화를 모델링하는데 사용되는 것을 허용 5,6,11-13,16,30-31.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 즉시 변형 블루밍턴의 재고 센터를 인정합니다. 이 작품은 BBSRC (BB / G008973 / 일)에서 연구비에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Octanol | Sigma | 218405 | |
| 4-Methyl cyclohexanol | Sigma | 15309-5 | |
| Benzaldehyde | Sigma | 418099 | |
| Mineral oil | Fluka | BP2629-1 | |
| Hexyl acetate | Sigma | 108154 | |
| Fructose | Sigma | F0127 | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 |
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