Summary
El método para medir de adultos de Drosophila memoria asociativa se describe. El ensayo se basa en la capacidad de la mosca para asociar un olor presentado con un reforzador negativo (descarga eléctrica) y luego recuperar esta información en un momento posterior, permitiendo que la memoria a medir.
Abstract
Drosophila se han utilizado en experimentos de condicionamiento clásico durante más de 40 años, lo que facilita en gran medida nuestra comprensión de la memoria, incluyendo la elucidación de los mecanismos moleculares implicados en enfermedades cognitivas 1-7. Aprendizaje y la memoria se pueden ensayar en las larvas para estudiar el efecto de los genes del desarrollo neurológico 8-10 y en las moscas para medir la contribución de los genes de plasticidad adultos 1-7. Además, la corta vida de Drosophila facilita el análisis de los genes que median deterioro de la memoria relacionada con la edad 5,11-13. La disponibilidad de muchos promotores inducibles que subdividen el sistema nervioso de Drosophila hace posible determinar cuándo y dónde se requiere un gen de interés para la memoria normal, así como el relé de diferentes aspectos de la señal de refuerzo 3,4,14,16.
El estudio de la memoria en adultos Drosophila permite un análisis detallado de lacomportamiento y los circuitos en cuestión y una medida de la memoria a largo plazo 15 -17. La longitud de la etapa adulta acomoda manipulaciones genéticas, de comportamiento, dietéticos y farmacológicos a largo plazo de la memoria, además de determinar el efecto del envejecimiento y la enfermedad neurodegenerativa en la memoria 3-6,11-13,15-21.
El condicionamiento clásico es inducida por la presentación simultánea de un olor clave neutra (estímulo condicionado, CS +) y un estímulo de refuerzo, por ejemplo., Una descarga eléctrica o sacarosa, (estímulo incondicionado, EE.UU.), que se asocian entre sí por el animal 1,16. Un estímulo segundo condicionado (EC -) se presentó posteriormente y sin los EE.UU.. Durante la fase de pruebas, Drosophila se presentan simultáneamente con CS + CS y olores. Después de la Drosophila se proporcionan tiempo para elegir entre los olores, se registra la distribución de los animales. Este procedimiento almínimos asociativas condicionamiento aversivo o apetitivo a medir con fiabilidad sin un sesgo introducido por la preferencia innata por cualquiera de los estímulos condicionados. Varios experimentos de control también se realizan para comprobar si todos los genotipos responden normalmente a olor y refuerzo sola.
Introduction
El método presentado aquí es la descrita por Tully y Quinn con algunas modificaciones pequeñas 1. El experimento se realiza en dos fases: las moscas están capacitados en la primera fase, y las moscas entrenadas son probados en la segunda fase. Durante el entrenamiento, un grupo de moscas están expuestos simultáneamente al olor 1 (CS +) y una descarga eléctrica (US) en un tubo de formación. Las moscas luego reciben olor 2 (CS -) sin una descarga eléctrica. Este único emparejamiento de un olor particular, con un choque se llama entrenamiento 1-ciclo, y los olores que se utilizan con mayor frecuencia son de 4 metilciclohexanol (MCH) y 3-octanol (OCT).
La formación de un ciclo conduce a la formación de una fase lábil de memoria que puede ser detectado durante un máximo de 7 horas; Sin embargo, la memoria suele ser probado de inmediato para determinar cuál es el aprendizaje denominado, adquisición o memoria de 2 min. Memoria medido a 30 min o 1 hr se refiere como la memoria a corto plazo, mientras3 horas de memoria se conoce como memoria intermedia. La exposición de las moscas a los ciclos de formación repetitivas con huecos entre los ciclos formativos de formación (espacio) conduce a una forma consolidada de la memoria a largo plazo, que es la transcripción CREB dependiente y dura hasta una semana. Formación sin huecos (formación masiva) conduce a la formación de la memoria anestesia resistente (ARM), que similar a la memoria a largo plazo, se mide típicamente 24 h después de 5 ciclos de formación 7,13,15-17,20,21.
Con este enfoque, el efecto de diversas mutaciones de genes en estas diferentes fases de la memoria se puede determinar. La expresión promotor impulsado de transgenes-luz o sensibles a la temperatura para activar o bloquear la actividad neuronal de las neuronas específicas permite investigar qué neuronas se requieren para la adquisición de la memoria, la consolidación y recuperación 3,4,11,15,16,20, 22-24. Memoria en 1 hora se mide normalmente en el estudio de trastornos de la memoria relacionada con la edad, porque este form de memoria aparece particularmente vulnerables a los efectos de la edad 11-13. Una gama completa de controles de comportamiento y genéticos se llevan a cabo con los experimentos de memoria, por ejemplo, para determinar si un defecto de rendimiento es debido a un defecto de memoria central o un defecto sensorial periférica que impide la marcha desde la detección de la descarga o referencia olfativa 5 -7, 1 7, 25,26.
Protocol
1. Preparación Fly
- Outcross todos los mutantes, Gal4 / UAS y otras líneas con una cepa de tipo salvaje, como CSw-, durante al menos seis generaciones antes de los experimentos de comportamiento para controlar para el fondo genético 26.
- Crecer moscas en una dieta estándar de alimentos de harina de maíz, la levadura y la melaza en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas a 25 ° C, a menos manipulaciones específicas requieren una temperatura diferente.
- Para determinar los efectos de la expresión transgénica: Uso 18 ° C para evitar la expresión de transgenes en (TARGET) Gal4 GAL80 ct a través de desarrollo y luego pasar las moscas a una incubadora a 30 ° 1-2 días antes del experimento conductual. Llevar a cabo el experimento a 30 ° C para determinar los efectos de la expresión del transgen 3,4,6,7,14.
- Para los experimentos que utilizan canales TRPA1 activados por calor para estimular las neuronas: Levante las moscas a 23 ° C, que es una temperatura conocidapara mantener un canal inactivo, y luego cambiar a una habitación comportamiento a 30 ° C para activar el TRPA1 neuronas que expresan.
- Para experimentos con temperatura Shibire sensibles a bloquear la salida sináptica 11, 14,24: Rear las moscas a 18 ° C y realizar pruebas a 30 ° C.
- Recoge las moscas 1-2 días antes del experimento y contarlos en grupos de aproximadamente 25 bajo CO 2 anestesia ligera. Guarde las moscas por lo menos S / N en frascos de comida (sin levadura) a 25 ° C (a menos manipulaciones específicas requieren una temperatura diferente) y una humedad relativa del 70% en una sala de ambiente controlado con luz 12:12 hr: condiciones de oscuridad hasta el momento del experimento.
Nota: Este almacenamiento permite que las moscas se aclimaten a prueba el aprendizaje posterior realizado en la sala de ambiente controlado, que tenía las condiciones óptimas para el aprendizaje Drosophila y, sobre todo, elimina cualquier envi diariavariaciones ambientales que podrían haber afectado el fenotipo conductual.
2. Preparación antes del experimento
- Lleve a cabo los experimentos en un plexiglás T-laberinto a medida (Figura 1).
- Compruebe regularmente el tubo de ajuste para asegurar que se obtiene un sello hermético durante el experimento. Si es necesario, cambiar las juntas tóricas que sellan los compartimentos en el interior de la T-laberinto.
- Coloque rejillas de cobre a la medida interior de los tubos de formación. Revise y limpie estas rejillas regularmente, y reemplazar si es oxidado. Coloque las rejillas de cobre a través de cables de pinzas de cocodrilo que se ejecutan a una caja de interruptor conectado a un estimulador eléctrico. Utilice un voltímetro para asegurarse de que el aparato está entregando el shock necesario.
- Utilizar G-abrazaderas para sujetar firmemente el laberinto para evitar cualquier fuga de aire.
- Conecte el laberinto en T a un tubo que corre a una bomba de aire, para permitir que los olores que se pueden extraer a través de las moscas y posteriormente retirados de la T-laberinto. Mantener el aire levefluir a ~ 2 L / min
3. Olor diluciones
- Use dos olores diferentes en concentraciones tales que las moscas muestran una preferencia igual para ambos olores. Utilice 4-metilciclohexanol (1:67) y 3-octanol (1: 100) diluido en aceite mineral 7,13.
Nota: Determine cuidadosamente estas concentraciones, que variarán por el laboratorio. Por ejemplo otros utilizan 1:10 para ambos olores 24. Otros olores comúnmente usados incluyen acetato de etilo y acetato de iso-amilo. - Pipetear 30 l de la olor diluido en una taza de olor a medida colocado en un bloque de olor cubierto por un tubo de plástico con una tapa perforada que permite que el aire sea aspirado en el olor en la copa, exponiendo así las moscas a un penacho de olor.
4. protocolo de entrenamiento (Figuras 1 y 2)
- Para el adulto choque acondicionado olfativa, realizar todos los experimentos bajo una tenue luz roja (es decir., LED rojo), lo que permite al investigador ver pero impide que el fly de ver, permitiendo así que las moscas se concentren en el olfato en contraposición a las entradas visuales.
- Introducir las moscas en el tubo de entrenamiento y luego adjuntar a la T-laberinto y les permiten adaptarse al tubo y el flujo de aire durante 90 segundos.
- Presentar el primer olor (4-metilciclohexanol, MCH) con un choque de 60 V (que consta de doce pulsos 1.25 segundos con intervalos entre pulsos 3,75 seg) para una duración total de 60 segundos.
- Siga el choque con un periodo de descanso de 30 segundos sin un olor o una descarga.
- Presentar el segundo olor (3-octanol, OCT) durante 60 segundos sin un shock.
- Siga el choque con un periodo de descanso de 30 segundos sin un olor o una descarga.
- Mueva las moscas de la cámara de la formación en la cámara central de la T-laberinto girando el laberinto en T en su lado y suavemente golpeando el fondo del laberinto en T en una superficie blanda, como una vieja estera del ratón. Mantener las moscas en la cámara central durante 90 segundos.
- Montar los tubos de elección en el bottom del aparato para formar el laberinto en T.
- Para medir el aprendizaje, mover las moscas hasta el punto de la T-laberinto, donde fueron expuestos simultáneamente a los dos olores elección y avanzar hacia una. Llevar a cabo un período de prueba durante 120 segundos.
- Trampa las moscas en los tubos de elección deslizando la cámara central de este modo hasta el bloqueo de los extremos de los tubos de elección. Recoger las moscas en cada brazo del laberinto en T y en el compartimiento central en viales de alimentos y recuento.
- Para medir la memoria, recoger las moscas después de la formación (4.6) y transferirlos desde el laberinto en T a viales de alimentos sin levadura. Tienda vuela en la oscuridad a 25 ° C y 70% de humedad durante el tiempo necesario restante para determinar la fase de la memoria de interés (véase la introducción). Reintroducir las moscas a la T-laberinto como en la etapa 4.7.
- Para la memoria a largo plazo, utilice un laberinto a la medida que permite a varios lotes de moscas para ser entrenados de forma simultánea. Administrar 5 ciclos de formación con un 15 min entre ciclos intervalo (spaced) o sin un intervalo entre ciclos (masivo). Mantener las moscas a 18 ° C y 70% de humedad en la oscuridad hasta que las pruebas. Antes de la prueba, mover las moscas a 25 ° C y deje que se aclimaten durante al menos 1 hora. Evaluar la memoria a largo plazo 24 horas después del entrenamiento.
- Después de los experimentos de comportamiento, limpiar las tazas de olor con agua caliente y detergente sin olor. Después del secado, capa las tazas con 10 l Sigmacote. Secar la Sigmacote por calentamiento en un horno de microondas. De vez en cuando limpie el laberinto en T de tubos de metacrilato y bloques de olor con agua caliente y detergente sin olor.
5. Cálculo del Índice de Rendimiento: una medida de la memoria de las moscas
- Calcular el Índice de Rendimiento (PI) para cada condición como el número de moscas evitando el olor de choque-emparejado (CS -) menos el número de moscas que eligen el olor de choque-emparejado (CS +) dividido por el número total de moscas (CS - + CS +) 1.
PeÍndice rformance (PI) = (# CS - vuela - # CS + vuela) / (# total de moscas) - Calcular la PI final del experimento promediando la PI del experimento en el que MCH era el olor de choque-emparejado y uno en el que la tomografía óptica fue el olor de choque-emparejado. Esto elimina cualquier sesgo de las moscas que tienen una mayor preferencia por un olor.
6. Controles sensoriomotora
- Realizar olor agudeza introduciendo ~ 40-50 moscas en el laberinto en T 6,7,17.
- Después de 90 segundos, mueva las moscas hasta el punto de elección, y les permitirá a 2 min de elegir entre los olores puros y aire.
- Recoger y contar las moscas. Calcular el porcentaje de evitación dividiendo el número total de moscas que optaron por el olor de los que participaron en la prueba.
- Para sorpresa reactividad 6,7,17, introducir las moscas en la cámara de descarga.
- Después de 90 segundos de descanso, administrar una descarga eléctrica de 60 V DC, de la que las moscas pueden escapar a un semejantetubo sin un shock.
- Permita 2 min para las moscas para elegir; recoger y contar las moscas. Calcular el porcentaje evitación de shock dividiendo el número de moscas que evitaron el choque escapando el tubo de choque por el número total de moscas en el experimento. Incluya las moscas que permanecen en la cámara central en el total de los que escaparon de la descarga eléctrica.
Representative Results
El índice de rendimiento (PI) sirve como medida de la memoria. La Tabla 1 ilustra un cálculo representante de PI.
| MCH emparejado con una descarga | 3-OCT emparejado con una descarga |
| Las moscas evitando MCH (en tubo de octubre) = 80 Las moscas prefieren MCH (en tubo MCH) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6 | Las moscas evitando octubre (en tubo MCH) = 75 Las moscas prefieren octubre (en tubo de octubre) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0,5 |
| PI del experimento = (0,6 + 0,5) /2=0.55 |
Tabla 1. Un cálculo representante del índice de rendimiento utilizando datos ilustrativos. Índices de rendimiento para diferentes experimentos se puede comparar para dilucidar los efectos de memoria. Una vez que talescomparación se muestra en la Figura 3, que contiene los resultados de una serie de experimentos realizados con Canton S moscas de tipo salvaje (WT) de adultos y de burro aprendizaje mutante moscas adultas 1. Se proporciona la media de 10 inhibidores de la proteasa, con barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Estos resultados demuestran que las moscas de burro muestran una reducción en el aprendizaje en comparación con los de tipo salvaje.
Figura 1. El adulto experimental. Las moscas son entrenados y examinados en un laberinto T. La formación consiste en presentar un olor A con descarga eléctrica seguida de una segunda olor B sin descarga eléctrica. Después de un período de descanso en la cámara intermedia las moscas se presentan tanto con los olores de forma simultánea. Las moscas se atrapanen los dos tubos y recogido y contado para obtener puntajes de aprendizaje / memoria.
Figura 2 El protocolo de formación de adultos. Las moscas están entrenando en dos pasos. El primer paso donde las moscas reciben un olor (CS +) emparejado con una descarga eléctrica (EE.UU.) durante 60 segundos. En el siguiente paso moscas reciben una segunda olor (CS) sin descarga eléctrica. Las moscas se dejan descansar durante 90 segundos después de lo cual se ensayaron para determinar su elección entre CS + y CS-.
Figura 3. Un gráfico representativo que muestra burro y el aprendizaje de tipo salvaje en adultos de Drosophila. de burro se ensayaron después de una sesión de entrenamiento. Dunce moscas muestran una reducción en el aprendizaje en comparación con el WT (n = 10).
Discussion
El ensayo de choque de aprendizaje olfativo de Drosophila adulta que aquí se presenta permite el análisis de los mecanismos moleculares que subyacen a las diferentes fases de la memoria, incluyendo la memoria a largo plazo 15-17. Así como la determinación del efecto de los ritmos circadianos del sueño 18, 19, 20,21, dieta senescencia 11-13, enfermedad neurodegenerativa 5 y tratamientos farmacológicos 5,6,19 en la memoria.
Muchos enfoques poderosos se han desarrollado recientemente para la obtención de imágenes funcionales de los circuitos neuronales que median la memoria olfativa en moscas 3,4,7,11,16,27. Estas técnicas de optogenética utilizan el vasto repertorio de los diferentes promotores disponibles en Drosophila 14,16. Estos promotores se utilizan para expresar codificados genéticamente de calcio y de AMPc reporteros en las neuronas de la memoria 16,27 para estudiar el efecto de mutaciones genéticas específicas en huellas de la memoria.
The uso de promotores condicionales y mutaciones en los adultos permite el estudio de la función de post-desarrollo de un producto génico en la memoria 3,4,6,7,13,14. Imaging y enfoques conductuales se pueden combinar con canales-luz y activados por calor para estimular o inhibir diferentes neuronas en el circuito de memoria 11,14,16,22-24 para dilucidar aún más su función. Además, las neuronas de la memoria del cuerpo de hongo se puede acceder a su conjunto de células grabaciones patch clamp 28, y las técnicas matemáticas y computacionales se utilizan para modelar Drosophila memoria olfativa 29.
Estos avances experimentales, combinados con las diferentes formas de protocolos de memoria asociativa introducidas aquí, permiten Drosophila que se utiliza para modelar las-molecular y de nivel de circuito de los cambios en la memoria asociativa que se producen en respuesta a la recompensa, el castigo, la motivación, la adicción, el envejecimiento y la enfermedad 5,6,11-13,16,30-31.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos centros de acopio en Bloomington para la cepa de mosca. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación del BBSRC (BB / G008973 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Octanol | Sigma | 218405 | |
| 4-Methyl cyclohexanol | Sigma | 15309-5 | |
| Benzaldehyde | Sigma | 418099 | |
| Mineral oil | Fluka | BP2629-1 | |
| Hexyl acetate | Sigma | 108154 | |
| Fructose | Sigma | F0127 | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 |
References
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