Drosophila Voksen Olfactory Shock læring

Summary

Metoden til måling af voksen Drosophila associativ hukommelse er beskrevet. Analysen er baseret på evnen af ​​fluen til at knytte en lugt præsenteret med en negativ forstærker (elektrisk stød), og husker så disse oplysninger på et senere tidspunkt, så hukommelse, der skal måles.

Abstract

Drosophila er blevet brugt i klassisk betingning eksperimenter i over 40 år, hvilket i høj grad lette vores forståelse af hukommelse, herunder belysning af de molekylære mekanismer involveret i kognitive sygdomme ^1-7. Indlæring og hukommelse kan analyseres i larver at studere virkningen af neurologiske gener ^8-10 og fluer til at måle bidrag voksne plasticitetsegenskaber gener ^1-7. Desuden korte levetid Drosophila letter analysen af gener, der medierer aldersrelateret hukommelsessvækkelse ^5,11-13. Tilgængeligheden af mange inducerbare promotorer, der underinddeler Drosophila nervesystem gør det muligt at bestemme, hvornår og hvor et gen af interesse er nødvendig for normal hukommelse samt relæ af forskellige aspekter af armeringen signalet ^3,4,14,16.

Studere hukommelse hos voksne Drosophila giver mulighed for en detaljeret analyse afadfærd og kredsløb involveret, og en måling af langtidshukommelse ^{15 -17.} Længden af den voksne scene kan rumme mere langsigtede genetiske, adfærdsmæssige, kosten og farmakologiske manipulationer af hukommelse, ud over at bestemme effekten af aldring og neurodegenerative sygdomme på hukommelsen ^{3-6,11-13,15-21.}

Klassisk condition er foranlediget af den samtidige præsentation af en neutral lugt cue (betinget stimulus, CS ⁺⁾ og en forstærkning stimulus, f.eks., Elektrisk stød eller saccharose, (ubetinget stimulus, USA), der bliver forbundet med hinanden af dyret ^1,16. Et andet betinget stimulus (CS ^-) efterfølgende præsenteres uden USA. Under testfasen, er Drosophila samtidig præsenteres med CS + og CS lugte. Efter Drosophila leveres tid til at vælge mellem de lugte, er fordelingen af dyrene registreres. Denne procedure alnedture associative afskrækningsmiddel eller appetitive conditioning for at måles pålideligt uden en bias indført ved den medfødte præference for nogen af ​​de konditionerede stimuli. Forskellige kontrolforsøg er også udført for at teste, om alle genotyper reagerer normalt på lugt og styrkelse alene.

Introduction

Metoden præsenteres her er, at ved Tully og Quinn beskrevet med nogle små ændringer ^1. Forsøget udføres i to faser: fluerne er uddannet i den første fase, og de uddannede fluer testes i anden fase. Under træningen er en gruppe af fluer samtidigt er udsat til lugt 1 (CS ⁺⁾ og et elektrisk stød (US) i en uddannelse rør. Fluerne modtager derefter lugt 2 (CS ^-) uden elektrisk stød. Denne enkelt parring af en bestemt lugt med et chok, kaldes 1-cyklus træning, og de lugte, der hyppigst anvendes, er 4-methylcyclohexanol (MCH) og 3-octanol (OLT).

One-cycle uddannelse fører til dannelsen af ​​en labil fase af hukommelse, der kan påvises i op til 7 timer; dog hukommelse typisk straks testet for at bestemme, hvad der er betegnet læring, erhvervelse eller 2 min hukommelse. Hukommelse målt ved 30 min eller 1 time betegnes som korttidshukommelse, hvorimod3 timer hukommelse kaldes midtvejsevalueringen hukommelse. Eksponeringen af ​​fluer til gentagne erhvervsuddannelsesforløbene med huller mellem uddannelse cyklusser (afstand uddannelse) fører til en konsolideret form af langtidshukommelse, der er CREB transkription afhængig og varer op til en uge. Uddannelse uden huller (bliver samlet uddannelse) fører til dannelsen af anæstesi-resistent memory (ARM), som svarer til langtidshukommelsen, måles typisk 24 timer efter 5 cyklusser af uddannelse ^{7,13,15-17,20,21.}

Med denne fremgangsmåde kan virkningen af ​​forskellige genmutationer på disse forskellige faser af hukommelsen bestemmes. Promotor-drevne udtryk for lyst eller temperaturfølsomme transgener for at aktivere eller blokere den neurale aktivitet af specifikke neuroner tillader en at undersøge, hvilke neuroner der kræves til erhvervelse hukommelse, konsolidering og genfinding ^{3,4,11,15,16,20, 22-24.} Hukommelse på 1 time måles typisk, når man studerer aldersrelateret hukommelsessvækkelse fordi denne fOrm hukommelse forekommer særligt sårbare over for virkningerne af aldring ^11-13. En komplet vifte af adfærdsmæssige og genetiske kontroller udføres med hukommelse eksperimenter, for eksempel, at afgøre, om en ydelse defekt er på grund af en central hukommelse defekt eller en perifer sensorisk defekt, der forhindrer fluen fra sensing stød eller olfaktoriske cue ^{5 -7, 1 7, 25,26.}

Protocol

1. Fly Forberedelse

1. Udkrydsning alle mutanter, Gal4 / UAS og andre strækninger med en vildtype-stamme, såsom CSw-, i mindst seks generationer forud for de adfærdsmæssige eksperimenter for at kontrollere for genetiske baggrund ^26.
2. Grow fluer på en standard majsmel, gær og melasse fødevarer kost under en 00:12 timers lys-mørke cyklus ved 25 ° C, medmindre specifikke manipulationer kræver en anden temperatur.
   1. At bestemme virkningerne af transgen ekspression: Brug 18 ° C for at forhindre ekspressionen af transgener i Gal4 Gal80 ^ts (Target-system) gennem udvikling og derefter flytte fluerne til en 30 ° C inkubator 1-2 dage før den adfærdsmæssige eksperiment. Gennemføre eksperimentet ved 30 ° C for at bestemme virkningerne af transgen ekspression ^3,4,6,7,14.
   2. Til forsøg med varmeaktiverede TRPA1 kanaler til at stimulere neuroner: Hæv fluerne ved 23 ° C, hvilket er en temperatur kendtat opretholde en inaktiv kanal, og derefter skifte til en adfærd rum ved 30 ° C for at aktivere TRPA1 udtrykkende neuroner.
   3. Til forsøg med Shibire ^{temperaturfølsomme} at blokere synaptisk udgang ^{11, 14,24:} Bag fluer ved 18 ° C og gennemføre test ved 30 ° C.
3. Saml fluerne 1-2 dage før forsøget og tælle dem i grupper på cirka 25 under let CO ₂ bedøvelse. Opbevar fluerne mindst O / N i fødevarer hætteglas (uden gær) ved 25 ° C (medmindre specifikke manipulationer krævede en anden temperatur) og 70% relativ fugtighed i en miljømæssigt kontrolleret rum med 00:12 timers lys: mørke omgivelser indtil det tidspunkt, af eksperimentet.
   Bemærk: Denne lagring giver fluerne at vænne sig til den efterfølgende prøve læring udføres i miljømæssigt kontrollerede rum, som havde de optimale betingelser for Drosophila læring og vigtigere, fjerner enhver daglig milmæssige variationer, der kan have påvirket adfærdsmæssige fænotype.

2. Forberedelse før forsøget

1. Udfør forsøg i et skræddersyet Plexiglas T-labyrint (figur 1).
2. Kontrollér regelmæssigt rørbeslag at sikre, at en lufttæt forsegling opnås under eksperimentet. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre O-ringene, der lukker de indvendige rum i T-labyrinten.
3. Placer skræddersyede kobber net inde i uddannelse rør. Kontroller og rengør disse net regelmæssigt, og udskift dem, hvis oxideret. Fastgør kobber net til ledninger via krokodillenæb, der kører til en switch-boks tilsluttet til en elektrisk stimulator. Brug et voltmeter for at sikre, at apparatet giver de ønskede stød.
4. Brug g-klemmer til at holde labyrinten stramt for at undgå luft lækage.
5. Fastgør T-labyrint til slanger, der kører til en luftpumpe, at tillade lugte, der kan drages på tværs af fluer og efterfølgende fjernes fra T-labyrint. Oprethold mild luftstrømme med ~ 2 L / min

3. Lugt Fortyndinger

1. Brug to forskellige lugte i koncentrationer, således at fluerne viser en lige stor for begge lugte. Brug 4-methylcyclohexanol (1:67) og 3-octanol (1: 100) fortyndet i mineralolie ^7,13.
   Bemærk: bestemme omhyggeligt disse koncentrationer, som vil variere alt efter laboratorium. For eksempel andre bruger 1:10 for begge lugte ^24. Andre almindeligt anvendte lugte omfatter ethylacetat og isoamylacetat.
2. Afpipetteres 30 ul af den fortyndede lugt ind i en skræddersyet lugt kop placeret i en lugt blok er dækket af et plastrør med en perforeret top, der tillader luft at blive trukket over lugt i koppen, og dermed udsætte fluerne til en lugt fane.

4. Træning Protocol (figur 1 og 2)

1. For voksne olfaktoriske chok condition, udføre alle eksperimenter under et svagt rødt lys (dvs.., Rød LED), som tillader forskeren at se, men forhindrer flå fra at se, således at fluerne at koncentrere sig om lugtesansen i modsætning til visuelle input.
2. Indføre fluerne i træningen røret og derefter vedhæfte til T-labyrint og give dem mulighed for at tilpasse sig til røret og luftstrøm i 90 sek.
3. Præsentere den første lugt (4-methylcyclohexanol, MCH) med en 60-V chok (bestående af tolv 1,25 sek pulser med 3,75 sek inter-puls intervaller) med en samlet varighed på 60 sek.
4. Følg chok med en 30 sek hvileperiode uden en lugt eller stød.
5. Præsenter anden lugt (3-octanol, OLT) i 60 sekunder uden et chok.
6. Følg chok med en 30 sek hvileperiode uden en lugt eller stød.
7. Flyt fluerne fra træningen kammer ind i det centrale kammer af T-labyrint ved at dreje T-labyrint på sin side og forsigtigt slå bunden af ​​T-labyrint på en blød overflade, såsom en gammel musemåtte. Vedligehold fluer i det centrale kammer i 90 sek.
8. Monter valg rør i BOttom af apparatet til dannelse af T-labyrint.
9. For at måle læring, flytte fluerne til valget punkt af T-labyrint, hvor de blev samtidig udsat for både lugte og bevæge sig mod den ene. Foretag en testperiode på 120 sek.
10. Fælde fluerne i valget rørene ved at skubbe det centrale kammer op derved blokerer enderne af valg rør. Saml fluerne i hver arm af T-labyrint og i det centrale rum i fødevarer hætteglas og tæller.
11. For at måle hukommelse, indsamle fluerne efter uddannelse (4.6) og overføre dem fra T-labyrint til fødevarer hætteglas uden gær. Opbevar flyver i mørke ved 25 ° C og 70% fugtighed i den resterende tid, der kræves for at bestemme hukommelse fase af interesse (se indledningen). Genindføre fluerne til T-labyrint som i trin 4.7.
12. For langtidshukommelsen, skal du bruge en specialbygget labyrint, som gør det muligt for flere partier af fluer til at blive uddannet på samme tid. Anvend 5 cyklusser af træning med en 15 min inter-cyklus interval (spaCED) eller uden en inter-cyklus interval (mass). Vedligehold fluer ved 18 ° C og 70% fugtighed i mørke, indtil testning. Forud for afprøvning flytte fluer til 25 ° C, og tillade dem at akklimatisere i mindst 1 time. Vurdere langtidshukommelse 24 timer efter træning.
13. Efter de adfærdsmæssige eksperimenter, rense lugt kopper med varmt vand og lugtfri rengøringsmiddel. Efter tørring overtrække kopper med 10 pi sigmacote. Tør sigmacote ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Lejlighedsvis rengøre T-labyrint plexiglas rør og lugt blokke med varmt vand og lugtfri rengøringsmiddel.

5. Beregning af Performance Index: Et mål for Flies 'hukommelse

1. Beregn Performance Index (PI) for hver betingelse, da antallet af fluer undgå chok-parret lugt (CS ^-) minus antallet af fluer der vælger chok-parret lugt (CS ⁺⁾ divideret med det samlede antal af fluer (CS ^- + CS ^{+) 1.}
   Performance indeks (PI) = (# CS ^- fluer - # CS ⁺ fluer) / (# Total fluer)
2. Beregn endelige PI af forsøget ved at midle PI af eksperimentet, hvor MCH var chok-parrede lugt og en, hvor oktober var chok parret lugt. Dette fjerner enhver skævhed af fluer, der har en højere præference for en lugt.

6. sensorimotorisk Controls

1. Udfør lugt skarphed ved at indføre ~ 40-50 fluer i T-labyrinten ^6,7,17.
2. Efter 90 sekunder, flyt fluerne til valget punkt, og give dem 2 min at vælge mellem rene lugt og luft.
3. Indsamle og tælle fluerne. Beregn undgåelse procent ved at dividere det samlede antal af fluer, der valgte den lugt af dem, der deltog i testen.
4. For chok reaktivitet ^6,7,17 ​​indføre fluerne i chok kammer.
5. Efter 90 sekunder af hvile, administrere en 60-V DC elektrisk stød, hvorfra fluer kan flygte til en lignenderør uden stød.
6. Tillad 2 min for fluerne at vælge; indsamle og tælle fluerne. Beregn chok undgåelse procent ved at dividere antallet af fluer, der undgik chok ved at flygte chokrøret med det samlede antal af fluer i forsøget. Medtag fluerne, der forbliver i det centrale kammer i alt dem, der undslap det elektriske stød.

Representative Results

Forestillingen indeks (PI) tjener som et mål for hukommelse. Tabel 1 viser en repræsentativ beregning af PI.

MCH parret med chok	3 OLT parret med chok
Fluer undgå MCH (i oktober rør) = 80 Fluer foretrækker MCH (i MCH rør) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6	Fluer undgå oktober (i MCH rør) = 75 Fluer foretrækker oktober (i oktober rør) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0,5
PI af forsøget = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tabel 1. En repræsentant beregning af ydeevne indeks ved hjælp af illustrative data. Ydeevneværdierne for forskellige eksperimenter kan sammenlignes med belyse hukommelse effekter. Når en sådanSammenligningen er vist i figur 3, der indeholder resultaterne fra en række forsøg udført med Canton S vildtype voksne fluer (WT) og dunce lære mutant voksne fluer ^1. Gennemsnittet af 10 PI'er er forudsat, med fejlsøjler repræsenterer standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Disse resultater viser, at dunce fluer viser en reduktion i at lære i forhold til vildtype.

Figur 1. Den voksne forsøgsopstilling. Fluerne er uddannet og testet i en T-labyrint. Uddannelsen indebærer at præsentere en lugt A med elektrisk stød, efterfulgt af en anden lugt B uden elektrisk stød. Efter en hvileperiode i den midterste kammer fluer er præsenteret med begge lugte samtidigt. Fluerne er fangeti de to rør og samles og tælles for at opnå læring / hukommelse scoringer.

Figur 2. Den voksne træning protokol. Fluerne træner i to trin. Det første trin, hvor fluer får en lugt (CS +) parret med elektrisk stød (US) for 60 sek. I det næste trin fluer modtager et andet lugt (CS) uden elektrisk stød. Fluer får derefter lov at hvile i 90 sekunder, hvorefter de testes for deres valg mellem CS + og CS.

Figur 3. Et repræsentativt graf, der viser tumpe og vildtype læring hos voksne Drosophila. dunce fluer blev testet efter en session af uddannelse. Dunce fluer viser en reduktion i at lære i forhold til WT (n = 10).

Discussion

Drosophila voksen olfaktoriske chok læring analysen præsenteres her giver mulighed for analyse af de molekylære mekanismer, der ligger forskellige faser af hukommelse, herunder langtidshukommelse ^15-17. Samt bestemmelse af effekten af døgnrytmen ^18, sove ^19, kost ^20,21, ældning ^11-13, neurodegenerativ sygdom ⁵ og lægemiddelbehandlinger ^5,6,19 på hukommelsen.

Mange magtfulde metoder er for nylig blevet udviklet til funktionel billeddannelse af de neurale kredsløb, der medierer olfaktoriske hukommelse i fluer ^{3,4,7,11,16,27.} Disse optogenetic teknikker anvender den stort repertoire af forskellige promotorer findes i Drosophila ^14,16. Disse promotorer bruges til at udtrykke genetisk indkodede calcium og Camp reportere i hukommelsen neuroner ^16,27 at studere effekten af specifikke genmutationer på hukommelse spor.

The brug af betingede initiativtagere og mutationer hos voksne tillader studiet af post-udviklingsmæssige rolle af et gen produkt i hukommelsen ^{3,4,6,7,13,14.} Imaging og adfærdsmæssige metoder kan kombineres med lette og varmeaktiverede kanaler stimulerer eller hæmmer forskellige neuroner i hukommelseskredsløbet ^{11,14,16,22-24} til yderligere at belyse deres funktion. Desuden champignon krop hukommelse neuroner er tilgængelige for hel-celle patch clamp optagelser ^28, og matematiske og beregningsmæssige teknikker bliver brugt til at modellere Drosophila olfaktoriske hukommelse ^29.

Disse eksperimentelle fremskridt, kombineret med de forskellige former for associative hukommelse protokoller indført her, tillade Drosophila, der skal bruges til at modellere de molekylære og kredsløb niveau ændringer i associativ hukommelse, der opstår som reaktion på belønning, straf, motivation, afhængighed, aldring og sygdom ^{5,6,11-13,16,30-31.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Octanol	Sigma	218405
4-Methyl cyclohexanol	Sigma	15309-5
Benzaldehyde	Sigma	418099
Mineral oil	Fluka	BP2629-1
Hexyl acetate	Sigma	108154
Fructose	Sigma	F0127
Agarose	Bioline	BIO-41025