Summary
इस प्रोटोकॉल zebrafish में माध्यमिक संवाददाताओं के रूप में प्राथमिक रिपोर्टर और GFP / आरएफपी के रूप में Gal4-VP16 उपयोग कर जीन जाल insertional mutagenesis की विधि का वर्णन करता है. लगभग एक उच्च व्यक्त F0 मछली उपज जीन जाल संतान GFP और आरएफपी सह व्यक्त दस में. स्क्रीनिंग प्रक्रिया तत्काल insertional mutagenesis स्क्रीन प्रदर्शन प्रयोगशाला के आकार के लिए अनुकूल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Abstract
बड़े क्लच आकार और ऑप्टिकली पारदर्शी भ्रूण के बाहरी विकास zebrafish उत्परिवर्तित जीन की अभिव्यक्ति टैग करने के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग करने में विवो insertional mutagenesis के लिए एक असाधारण हड्डीवाला मॉडल प्रणाली बनाते हैं. कई प्रयोगशालाओं संवाददाताओं से 1-7 के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन, Gal4 और Lexa आधारित ट्रांसक्रिप्शनल activators का उपयोग, zebrafish में बढ़ाने और जीन जाल वैक्टर का निर्माण और परीक्षण किया है. और कम mutagenicity (शायद ही कभी अशक्त alleles उत्पादित जीन में जैसे एकीकरण) suboptimal तंगी (बढ़ाने और जीन जाल घटनाओं के बीच अंतर करने की क्षमता का उदाहरण कमी): इन वैक्टर दो संभावित कमियां थी. जीन तोड़कर transposon (GBTs) इन कमियों 8-10 पता करने के लिए विकसित किए गए. जीन ट्रैप घटना के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए माध्यमिक पत्रकार के रूप में EGFP: हम प्राथमिक जीन जाल रिपोर्टर और कहा कि यूएएस रूप Gal4-VP16 साथ प्रयोग के लिए, पहली GBT वैक्टर में से एक, GBT-R15 संशोधित किया है. एकप्राथमिक जीन जाल पत्रकार के रूप में Gal4-VP16 के pplication दो मुख्य लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, यह कम अभिव्यक्ति के स्तर पर व्यक्त जीनों के लिए संवेदनशीलता बढ़ जाती है. दूसरा, यह बहुत ही विशेष ऊतकों में अन्य transgenes की प्रत्यक्ष अभिव्यक्ति को Gal4 चालकों के रूप में जीन जाल लाइनों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाता है. इस जीन जाल एकीकरण प्रकट phenotypes में परिणाम नहीं हो सकता है, जहां गैर जरूरी या अनावश्यक कार्यों के साथ जीनों के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है. प्राथमिक जीन जाल पत्रकार के रूप में Gal4-VP16 का उपयोग करने का नुकसान यह है कि जिसके परिणामस्वरूप Gal4-VP16 संलयन प्रोटीन नाभिक में प्रवेश करने में सक्षम होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं और सक्रिय रूप एन टर्मिनल संकेत दृश्यों के साथ प्रोटीन के लिए जीन कोडिंग, फँसाने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं प्रतिलेखन. महत्वपूर्ण बात है, Gal4-VP16 का उपयोग परमाणु प्रोटीन के लिए पूर्व चयन नहीं होता: हम नाभिक, cytoplasm और प्लाज्मा झिल्ली में समारोह जो प्रोटीन एन्कोडिंग जीन में जीन जाल म्यूटेशन बरामद किए.
Introduction
Insertional mutagenesis के चूहों और पौधों के रूप में बहुकोशिकीय जीव को बैक्टीरिया और खमीर की तरह कोशिकीय जीवों से विभिन्न मॉडल प्रणाली में जीन समारोह विदारक के लिए एक शक्तिशाली तरीका साबित हो गया है. कोई एक्सोजेनस डीएनए (वायरस, transposon या प्लाज्मिड) ऐसे एक्सॉनों या प्रमोटरों के रूप में जीन के आवश्यक तत्वों को दखल से एक उत्परिवर्तजन के रूप में सेवा कर सकता है. एक्सॉनों एक ठेठ हड्डीवाला जीनोम का केवल 1-3% शामिल के बाद से इस तरह के सरल तरीकों में से प्रभावी लक्ष्य, बड़ी जटिल जीनोम में बेहद छोटा है. Zebrafish 11,12 में रेट्रोवायरल insertional mutagenesis की जबरदस्त सफलता से उदाहरण के रूप में छोटे प्रभावी लक्ष्य आकार, बहुत उच्च वेक्टर एकीकरण दरों को दूर किया जा सकता है. इसके विपरीत, इंट्रोन्स हड्डीवाला जीनोम के बारे में 20-30% शामिल. प्रभावी ढंग से introns में अशक्त या एकीकरण पर गंभीर hypomorphic म्यूटेशनों परिचय जो zebrafish, transposon आधारित insertional mutagenesis वैक्टर में "जीन तोड़ने transposo नाम दिया गया हैएनएस "(GBTs) 8-10. कुशल जीन जाल एकीकरण के लिए, वे एक न्यूनतम Tol2 transposon 13,14 का उपयोग करें. GBTs की Mutagenicity मछली व्युत्पन्न ब्याह स्वीकर्ता और transcriptional समाप्ति / polyadenylation दृश्यों पर निर्भर करता है. GBT mutagenicity के लिए जिम्मेदार तत्वों घिरे रहे हैं Cre recombinase द्वारा छांटना के लिए प्रत्यक्ष loxP साइटों से. इस प्रकार, Cre mRNA की इंजेक्शन कुछ transposon दृश्यों एकीकरण ठिकाना 9,10 पर बने हुए हैं, हालांकि GBT प्रेरित परिवर्तन के कुशल प्रत्यावर्तन की ओर जाता है.
हाल ही में प्रकाशित GBT वैक्टर दो संभावित कमियों के लिए अग्रणी जीन जाल संवाददाता 9,10 रूप mRFP का उपयोग करें. सबसे पहले, यह प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट संवाददाता संलयन प्रोटीन से पता लगाया जा करने के लिए एक उच्च पर्याप्त स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं zebrafish जीन किस अंश ज्ञात नहीं है. दूसरा, जीन की केवल एक छोटे सबसेट आवश्यक कार्य है की संभावना है. यह zebrafish विकास के लिए आवश्यक केवल 1,400-2,400 जीन होते हैं कि अनुमान लगाया गया हैNT 15,16. अधिकांश जीन जाल म्यूटेंट प्रकट phenotypes प्रदर्शित करने के लिए और इसलिए सीमित उपयोगिता होगा उम्मीद नहीं कर रहे हैं. इन दो सीमाओं को पार करने के लिए, हम प्राथमिक जीन जाल पत्रकार के रूप में Gal4-VP16 के साथ उपयोग करने के लिए GBT-R15 9,10 संशोधित किया है (Balciuniene एट अल. तैयारी में). GBT-R15 में अगस्त कम mRFP साथ के रूप में, अनुवाद शुरू साइट Gal4-VP16 से हटा दिया गया था. जीन ट्रैप घटना के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए, हमारे वैक्टर 14x Gal4 यूएएस 17,18 के नियंत्रण में एक EGFP संवाददाता होते हैं.
कई अतिरिक्त सुविधाओं हमारे द्विपक्षीय जीन जाल वेक्टर में इंजीनियर हैं. यूएएस: EGFP कैसेट प्रत्यक्ष FRT साइटों (चित्र 1 में ग्रे शेवरॉन) द्वारा flanked है. EGFP प्रतिदीप्ति द्वारा अगोचर जीन जाल उत्परिवर्तन छोड़ रहा है, EGFP कैसेट: FLP recombinase mRNA इंजेक्शन यूएएस की छांटना की ओर जाता है. यह तो GFP प्रतिदीप्ति द्वारा विशिष्ट ऊतकों या विकास संबंधी घटनाओं की जो छाप ट्रांसजेनिक लाइनों में इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य में के रूप मेंGBTs, पूरे जीन जाल कैसेट प्रत्यक्ष loxP साइटों (चित्रा 1 में खुला pentagons) द्वारा flanked है. यह आसानी से एक विशेष जीन जाल एकीकरण के बीच करणीय संबंध के सबूत की स्थापना और चित्रा (2) phenotype मनाया, Cre recombinase की अभिव्यक्ति द्वारा जीन ट्रैप घटना प्रतिवर्ती बनाता है. अंत में, जीन जाल कैसेट उल्टे मैं SCEI meganuclease साइटों (चित्र 1 में काला त्रिकोण) द्वारा flanked है. ड्रोसोफिला में, transposon एकीकरण अक्सर पी तत्व के imprecise छांटना द्वारा विलोपन (कमियों) को परिवर्तित कर रहे हैं. Tol2 transposon (या इस तरह के सौंदर्य, PiggyBac या एसी / डी एस सोने के रूप में रीढ़ में सक्रिय किसी भी अन्य transposon) के छांटना विलोपन का कारण बन सकता है कि कोई सबूत नहीं है. हम इसलिए मैं SCEI zebrafish में विलोपन के लिए प्रेरित कर सकते हैं कि वहाँ कोई सबूत नहीं है, भले ही विलोपन के शामिल होने के लिए एक संभावित किराए की विधि के रूप में मैं SCEI साइटों शामिल थे. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब मैं SCEI मेगाnuclease zebrafish में transgenesis की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मैं SCEI meganuclease द्वारा डीएनए दरार डीएनए की मरम्मत खमीर में त्रुटि प्रवण गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने सहित तंत्र,, और स्तनधारी कोशिकाओं 19-22 अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
हमारे जीन जाल वेक्टर के एकीकरण दो अलग तंत्र द्वारा EGFP अभिव्यक्ति हो सकती है. पहले एक सच्चे जीन ट्रैप स्पर्धा (चित्रा 1C) है: वेक्टर एक जीन (Insertionally उत्परिवर्तित जीन के लिए आईएमजी), अंतर्जात आइएमजी प्रतिलेख और Gal4-VP16 के 5 'के बीच एक संलयन प्रतिलेख में एकीकृत एक में बनाया और अनुवाद किया है आईएमजी और Gal4-VP16 द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के एन टर्मिनस युक्त संलयन प्रोटीन. इस संलयन प्रोटीन 14x यूएएस को बांधता है और EGFP के प्रतिलेखन सक्रिय. दूसरा, कम वांछनीय घटना एक बढ़ाने जाल (चित्रा -1) है: EGFP के सामने कम से कम प्रमोटर एबी में EGFP के उत्पादन के लिए अग्रणी एकीकरण स्थल के निकट एक बढ़ाने के नियंत्रण के अंतर्गत आती हैGal4-VP16 उत्पादन की भावना. हमारे अनुमान में, EGFP अभिव्यक्ति की घटनाओं का 30-50% एक बढ़ाने जाल के कारण होते हैं और 50-70% एक जीन जाल 23 की वजह से कर रहे हैं (Balciuniene एट अल. तैयारी में). MRFP ट्रांसजेनिक लाइन (चित्रा 1 बी), लेंस विशिष्ट γCry द्वारा चिह्नित सुविधा के लिए: (. Balciuniene एट अल तैयारी में) GFP घटनाओं के इन दो वर्गों के बीच भेद करने के लिए, हम एक 14xUAS बना दिया है. जीन ट्रैप घटना GFP के सह अभिव्यक्ति और आरएफपी (चित्रा 2 में सी और डी तुलना) द्वारा सत्यापित कर रहे हैं.
हमारे पायलट स्क्रीन में, हम transposon डीएनए और Transposase mRNA की एक मिश्रण के साथ इंजेक्शन 270 F0 मछली स्क्रीनिंग के बाद 40 से अधिक जीन ट्रैप घटना बरामद किए. NSF और फ्लोर: हमारे जीन जाल एकीकरण के दो पहले प्रकाशित रासायनिक प्रेरित म्यूटेंट के साथ जीन में हुई है. हमारे insertional म्यूटेंट NSF tpl6 और फ्लोर tpl24 के phenotypes फेनोटाइप से अल्पज्ञता अप्रभेद्य हैंइसी रासायनिक प्रेरित म्यूटेंट की है. हम भी जीन ट्रैप घटना इस प्रकार अशक्त alleles की संभावना बढ़ रही है, जीन के 5 'अंत निकट introns की ओर झुका हुआ दिखाई देते हैं उल्लेख किया. हम हमारे जीन जाल लाइनों के सभी में यूएएस मुंह बंद (विचित्र रंगना) के कुछ डिग्री का पालन करते हैं, और कुछ स्थलों स्पष्ट रूप से दूसरों की तुलना में विचित्र रंगना लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. हम आसानी से अकेले GFP अभिव्यक्ति के लिए चयन करके कम से कम पांच पीढ़ियों के माध्यम से हमारे जीन जाल लाइनों के सभी प्रचार करने में सक्षम है के रूप में यूएएस मुंह बंद, जीन जाल लाइनों के प्रचार के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या है कि विश्वास नहीं है.
Protocol
1. जीन जाल के microinjection द्वारा F0 पीढ़ी का उत्पादन.
अटल बिहारी और Tuebingen उपभेदों गरीब अस्तित्व है, जबकि लांग फिन (TLF) सबसे अधिक सहिष्णु जा रहा है - हम विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के भ्रूण पालतू दुकान आधारित जंगली प्रकार और Tuebingen के साथ, इस प्रक्रिया के लिए अलग tolerances प्रदर्शित पाया है.
- Transposon डीएनए की तैयारी. GBT-B1 तैयार (pDB783, Balciuniene एट अल. तैयारी में) मानक QIAprep Miniprep किट (Qiagen 27106) का उपयोग प्लास्मिड डीएनए. यह अन्यथा Miniprep डीएनए Transposase mRNA की गिरावट के लिए अग्रणी RNase एक से दूषित हो जाएगा, (QIAprep प्रक्रिया में वैकल्पिक है) पीबी धोने कदम शामिल करने के लिए आवश्यक है. इंजेक्शन से पहले, 10 एनजी / μl को RNase मुफ्त पानी (Ambion AM9937) में डीएनए पतला.
- Transposase mRNA की तैयारी. XbaI का उपयोग pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 linearize और एक mMessage मशीन T3 का उपयोग linearized डीएनए नक़लइन विट्रो प्रतिलेखन किट में (Ambion AM1348). हम RiboLock RNase अवरोध करनेवाला (ThermoFisher Fermentas EO0381) के 0.5 μl जोड़कर इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया को संशोधित किया है. DNase उपचार कदम के बाद, एक RNeasy MinElute किट (Qiagen 74204) का उपयोग mRNA शुद्ध. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा इन विट्रो लिखित mRNA की गुणवत्ता का आकलन. 40 एनजी / μl को RNase मुक्त पानी में mRNA पतला, और दुकान डिग्री सेल्सियस -80 पर 2 μl aliquots के रूप में
- Microinjection मिश्रण तैयार करना. इंजेक्शन से पहले, Transposase mRNA की एक 2 μl विभाज्य पतला transposon डीएनए के 8 μl जोड़ें.
- Microinjection. जर्दी / प्रसूखण्ड इंटरफेस के लिए लक्ष्य, मानक microinjection तकनीक का उपयोग कर 1 सेल zebrafish भ्रूण की जर्दी में डीएनए / आरएनए मिश्रण के 3 NL इंजेक्षन. 1 सेल मंच पर इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण हर 20 मिनट लीजिए. हमारे अनुभव में, एक कुशल व्यक्ति आसानी से 1-1.5 घंटे में 1,000 भ्रूण इंजेक्षन कर सकते हैं.
- इंजेक्शन के बाद, बाएं से 5 μl चलानेTransposase mRNA अपमानित नहीं किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक 1% agarose जेल, पर इंजेक्शन समाधान पर.
- इंजेक्शन भ्रूण देखभाल. देर से दोपहर में, unfertilized और असामान्य भ्रूण को हटाने और 100 मिमी पेट्री डिश प्रति 60-80 भ्रूण वितरित. असामान्य और मृत भ्रूण 1 दिन बाद निषेचन (DPF), 2 DPF और 3 DPF पर निकाल रहे हैं.
- GFP अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीनिंग. 3 DPF पर GFP प्रतिदीप्ति (चित्रा 3) के लिए खुला दोष के बिना स्क्रीन भ्रूण. स्क्रीनिंग (हम एक 5X Fluar उद्देश्य के साथ एक Zeiss AxioImager उपयोग) प्रतिदीप्ति से लैस एक stereomicroscope पर भी किया (हम Nikon एक SMZ1500 उपयोग) या एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है. कम GFP अभिव्यक्ति के कारण RNase संदूषण (चित्रा 3) के लिए असफल इंजेक्शन या Transposase शाही सेना की गिरावट या तो इंगित करता है. एफ तुलना (कई ऊतकों में या एक विशिष्ट ऊतकों की कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत में GFP अभिव्यक्ति है जो या तो प्रतिभाशाली भ्रूण के बारे में 30% का चयन करेंigures 3 बी और 3C). 1,000 भ्रूण का एक इंजेक्शन से, हम आम तौर पर करने के लिए 100 developmentally सामान्य, उच्च GFP-व्यक्त भ्रूण है.
- मानक zebrafish पालन प्रक्रियाओं का उपयोग कर चयनित F0 भ्रूण उठाएँ. यह पालन के लिए चयनित इंजेक्शन भ्रूण की 20-30% वयस्कता के लिए बच जाएगा कि उम्मीद करना उचित है.
2. यूएएस का रखरखाव: mRFP परीक्षक रेखा.
हम एक 14xUAS उत्पन्न किया है: लेंस विशिष्ट γCry द्वारा चिह्नित mRFP लाइन: GFP. यूएएस डीएनए मेथिलिकरण के माध्यम से मुंह बंद करने के लिए विषय है, यह शेयर प्रचार करने के लिए मुंह बंद करने के निम्न स्तर के साथ मछली का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- व्यक्तिगत यूएएस स्थापनाः हमारे सबसे विश्वसनीय Gal4 जीन जाल लाइनों में से एक के साथ संभोग के लिए mRFP समयुग्मज, NSF tpl6 (Balciuniene एट अल तैयारी में.).
- अगले दिन, यूएएस स्थानांतरण: भ्रूण एकत्र कर रहे हैं, जबकि व्यक्तिगत स्थिर टैंकों को भ्रूण दिया जो mRFP मछलीऔर साफ कर दिया.
- 1 DPF और 3 DPF पर GFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति के लिए स्क्रीन भ्रूण.
- यूएएस की अगली पीढ़ी की स्थापना के लिए उच्च mRFP अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण दिया जो दूसरे को काटना मछली: mRFP लाइन.
3. F0 मछली की स्क्रीनिंग.
- MRFP मछली (चित्रा 4): समयुग्मक यूएएस साथ व्यक्तिगत F0 पार. हम आम तौर पर जंगली प्रकार या तेंदुए रंजकता पैटर्न के साथ लाइनों में हमारे GBTs इंजेक्षन, और हमारे समयुग्मक यूएएस: mRFP लाइन पीतल पृष्ठभूमि में है. इसलिए GBT इंजेक्शन F0 मछली यूएएस से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है: mRFP मछली, जांच की जा रही F0 एक पुरुष या महिला के रूप में भी किया गया था कि क्या रिकॉर्ड नष्ट करने की जरूरत रिकॉर्डिंग में और / या के लिंग का पता लगाने गलतियों से उत्पन्न संभावित त्रुटियों प्रत्येक मछली. बहुत सीमित अनुभव, हमें इस तरह की स्नातक छात्रों के साथ कार्मिक इसलिए की स्थापना की और मछली matings नीचे तोड़ने में सक्षम हैं. इस दृष्टिकोण के दो विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि कर रहे हैं कि एक नुकसान हैसंभावित समारोह phenotypes की हानि की व्याख्या उलझी इस्तेमाल किया जा रहा है.
- अगले दिन, पीतल यूएएस वापसी: mRFP मछली उनके टैंक के लिए. भ्रूण एकत्र की है और जांच कर रहे हैं जबकि (हम हेगन Exo टेरा Faunarium लघु उपयोग करें, लेकिन किसी भी छोटे टैंक इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) व्यक्ति स्थिर टैंक में भ्रूण दिया जो F0 मछली रखें.
- नई पेट्री डिश में स्वच्छ और स्थानांतरण एकत्र भ्रूण दिन 0 से दोपहर में (पकवान प्रति <100).
- GFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति 1 DPF पर, 2 DPF और 3 DPF के लिए स्क्रीन भ्रूण. , GFP और आरएफपी बाहर दोनों के लिए सकारात्मक भ्रूण खींचो GFP / आरएफपी अभिव्यक्ति पैटर्न द्वारा उन्हें तरह (एक से अधिक पैटर्न एक क्लच में मनाया जाता है) और F1 पीढ़ी की स्थापना के लिए उन्हें बढ़ा.
- (50-100 भ्रूण की कुल संख्या में से) केवल नकारात्मक भ्रूण का उत्पादन किया जो F0 मछली euthanize.
- सकारात्मक का एक दूसरा बैच पाने के लिए फिर से GFP / आरएफपी पॉजिटिव संतान का उत्पादन किया जो F0 मछली पार.
4.F1 मछली की स्क्रीनिंग.
F1 मछली, F2 परिवारों की स्थापना के लिए जीन जाल अभिव्यक्ति पैटर्न करने के लिए दस्तावेज़ और 5 'रेस और उलटा पीसीआर द्वारा जीन जाल स्थलों की आणविक पहचान के लिए भ्रूण के बैच फ्रीज करने के लिए जांच कर रहे हैं.
- MRFP मछली (चित्रा 4): समयुग्मक यूएएस साथ व्यक्तिगत F1 मछली पार.
- अगले दिन, भ्रूण एकत्र की है और जांच कर रहे हैं, जबकि व्यक्तिगत स्थिर टैंक में भ्रूण दिया कि एफ 1 मछली जगह है.
- GFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति 1 DPF पर, 2 DPF और 3 DPF के लिए स्क्रीन भ्रूण. GFP और आरएफपी 24 दोनों के लिए सकारात्मक अलग और फोटोग्राफ भ्रूण.
- 5 DPF पर, 20 GFP / आरएफपी पॉजिटिव और 20 GFP / उलटा पीसीआर द्वारा insertionally उत्परिवर्तित जीन की पहचान की है और 5 के लिए आरएफपी नकारात्मक भ्रूण 'रेस 9,10 के बैच फ्रीज. F2 पीढ़ी की स्थापना के लिए शेष GFP / आरएफपी पॉजिटिव भ्रूण उठाएँ.
Representative Results
एक सफल इंजेक्शन में, भ्रूण के कम से कम 80% GFP प्रतिदीप्ति के कुछ डिग्री (चित्रा 3) प्रदर्शित जीन जाल डीएनए / Tol2 Transposase mRNA मिश्रण के साथ इंजेक्शन. प्रतिभाशाली GFP पॉजिटिव भ्रूण (चित्रा -3 सी), f0 पूल स्थापित करने के लिए चयन किया जाता है जब एक के बारे में 10 जांच F0 मछली में जीन जाल संतान निकलेगा. जीन ट्रैप घटना बरामद कर रहे हैं जिसमें से F0 मछली के अलावा, सबसे कई गैर व्यक्त transposon एकीकरण के अलावा एक जीन ट्रैप स्पर्धा संचारित. हालांकि, हम एक एकल F0 व्यक्ति से चार जीन जाल लाइनों को स्थापित किया है. जीन जाल लाइनों में GFP / आरएफपी अभिव्यक्ति पैटर्न (घ्राण बल्ब में उदाहरण के लिए) बहुत ऊतक विशिष्ट करने के लिए काफी सर्वव्यापक से लेकर.
चित्रा 1. टीवह युक्त gal4 द्विपक्षीय जीन जाल वेक्टर GBT-B1 और उसके आवेदन. ए Gal4 युक्त जीन जाल वेक्टर के घटक: Tol2 5 'और Tol2 3', न्यूनतम Tol2 transposon 13 समाप्त होता है, सीएसए, काप β-actin ब्याह स्वीकर्ता 8; ^ Gal4-VP16, Aug-कम Gal4-VP16, जिला परिषद ( GBT-R15 9,10 से एक), zebrafish β-actin 3 'UTR और पाली (ए) तत्वों. EGFP अभिव्यक्ति कैसेट 17,18: 14XUAS, EGFP और SV40 पी (ए) यूएएस के घटक हैं. तीर यूएएस की सक्रियता को इंगित करता है: जीन जाल द्वारा उत्पादित Gal4-VP16 द्वारा EGFP बी 14XUAS:. GFP कैसेट: एक लेंस विशिष्ट γCry द्वारा चिह्नित mRFP transgene. तीर यूएएस की सक्रियता को इंगित करता है: mRFP Gal4-VP16 द्वारा ट्रांस सी. जीन ट्रैप स्पर्धा में.. नीले बक्से एक्सॉनों हैं. Splicing धराशायी लाइन. डी. बढ़ाने जाल घटना ने संकेत दिया है. एक बढ़ाने (ब्राउन बॉक्स) के पास वेक्टर की एकता ब्राउन तीर (इस बढ़ाने के नियंत्रण के तहत न्यूनतम EGFP प्रमोटर जगह हो सकती है). इस EGFP के एक ऊतक विशेष अभिव्यक्ति नतीजा होगा, लेकिन Gal4-VP16 नहीं किया जाता है, के बाद से mRFP अभिव्यक्ति सक्रिय नहीं किया जाएगा.
चित्रा 2. Cre recombinase का उपयोग जीन ट्रैप घटना के प्रत्यावर्तन. एक जीन जाल उत्परिवर्तन (ए) और रचनात्मक-लौट जीन जाल एलील (बी) के ए, बी आरेख. सी, डी. GFP (सी) के सह अभिव्यक्ति और NSF tpl6 जीन की तंत्रिका तंत्र में आरएफपी (डी) जाल लाइन. ई, NSF tpl6 भ्रूण में Cre शाही सेना के एफ इंजेक्शन GFP (ई) के नुकसान और आरएफपी (एफ) अभिव्यक्ति की ओर जाता है. उम्मीद के रूप में लेंस में GFP अभिव्यक्ति की कोई कमी नहीं, ध्यान दें कि वहाँ.
चित्रा 3. GBT-B1 (pDB783) जीन जाल के साथ इंजेक्शन भ्रूण. . भ्रूण के एक यादृच्छिक समूह (बी) और पालन के लिए चयनित उच्च expressors: ए भ्रूण pGBT-B1 (pDB783) शरीर बी में अकेले प्रदर्शन थोड़ा GFP प्रतिदीप्ति के साथ इंजेक्शन, सी. भ्रूण pGBT-B1 और Tol2 Transposase mRNA इंजेक्शन के साथ (सी).
चित्रा 4. Gal4 जीन जाल लाइनों की स्थापना के लिए प्रायोगिक रूपरेखा. अकेले हरी जीन जाल या बढ़ाने जाल घटनाओं के लिए mosaicism इंगित करता है, जबकि आंशिक रूप से अतिव्यापी हरी / लाल संरचनाओं, GFP और आरएफपी के सह अभिव्यक्ति का संकेत मिलता है.
Discussion
यहाँ वर्णित जीन जाल वैक्टर और कार्यप्रणाली पहले से ही कई स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा रहा है. हमारे अनुभव में, इस प्रक्रिया में दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. पहला महत्वपूर्ण कदम इंजेक्शन F0 भ्रूण में जीन जाल एकीकरण की उच्च दर प्राप्त करने के लिए है. इस चरण में विफलता अक्सर इंजेक्शन अभिकर्मकों की RNase संदूषण, विशेष रूप से Miniprep डीएनए के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. यह जीन जाल प्रयोगों के लिए 1 सेल स्तर पर भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए भी बहुत महत्वपूर्ण है. हमारे अनुभव में, Tol2 की मध्यस्थता transgenesis कम गुणवत्ता डीएनए के साथ बाद में 1 सेल मंच से या इंजेक्शन लगाने के भी जब यह संभव ट्रांसजेनिक लाइनों प्राप्त करने के लिए कर रही है, बहुत ही कुशल है. जीन जाल mutagenesis के बाहर ले जाने के लिए जब वेक्टर एकीकरण का केवल एक छोटा सा अंश प्रभावी जीन ट्रैप घटना में परिणाम के बाद से घटिया इंजेक्शन, बहुत अधिक समस्याग्रस्त हैं. दूसरा महत्वपूर्ण कदम हमारे यूएएस को पार करके जीन ट्रैप घटना का पता लगाने के लिए है: mRFP लाइन. MRFP अभिव्यक्ति का अभाव हैलगभग हमेशा एक बढ़ाने जाल घटना का संकेत है. लेकिन, कभी कभी mRFP अभिव्यक्ति की कमी 14x यूएएस का मुंह बंद करने का संकेत हो सकता. यह यूएएस बनाए रखने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है: NSF tpl6 को पार कर जब उच्च आरएफपी अभिव्यक्ति के साथ व्यक्तियों का उपयोग कर अगली पीढ़ी के प्रचार के द्वारा एक गैर खामोश राज्य में mRFP लाइन.
हम हमारे जीन जाल वैक्टर और प्रोटोकॉल के लिए कई सुधार लागू करने की उम्मीद कर सकते हैं. पहला जीन जाल निर्माण में एक कम दोहराव यूएएस उपयोग करने के लिए है. यह एक 5x यूएएस सेल संस्कृति प्रयोगों में पूर्ण सक्रियण प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, और कम दोहराए यूएएस दृश्यों मेथिलिकरण और 6,25 मुंह बंद करने के लिए कम संभावना है कि कि दिखाया गया है. यह भी अंतरराष्ट्रीय माउस जीन जाल कंसोर्टियम द्वारा इस्तेमाल किया और हाल ही में zebrafish 2,26,27 के लिए अनुकूलित वैक्टर करने के सादृश्य में, पूरी तरह से सशर्त mutagenesis के लिए जीन जाल वैक्टर डिजाइन करने के लिए संभव हो सकता है. एक अन्य सुधार एक अलग टी का इस्तेमाल होगाmRFP संवाददाता लाइन: एक यूएएस उत्पन्न करने के लिए सौंदर्य 28 सो रही है, उदाहरण के लिए ransposon प्रणाली,. यह सीधे संवाददाता लाइन और incrossing द्वारा F0s की स्क्रीनिंग में Tol2 आधारित जीन जाल के इंजेक्शन के लिए सक्षम होगा. इसके अलावा, इस समारोह phenotypes की हानि की व्याख्या और अधिक सरल बनाने, दो अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के उपयोग को समाप्त होगा. यहां तक कि इन सुधारों के साथ, यहाँ प्रस्तुत सामान्य Gal4 जीन जाल प्रोटोकॉल अभी भी पूरी तरह से लागू किया जाएगा.
Disclosures
इन लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए रयान गिल डॉ. जेनिफर Emtage धन्यवाद और अभिकर्मकों के लिए zebrafish देखभाल और डॉ. स्टीफन सी. Ekker (मेयो क्लीनिक, Rochster, मिनेसोटा) के साथ मदद की. हमारा काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी के मंदिर विश्वविद्यालय कॉलेज और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01-HD061749) द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
| XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
| mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
| Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
| Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
| Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
| * We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. | |||
References
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- Trinh le, A., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
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