Eksperimentel Menneskelig Pneumokok Carriage

Summary

Eksperimentel menneskelig pneumokok transport giver en naturlig model af vognen og en potentiel model til brug i udvikling af vacciner. Denne teknik er værdifuld endnu kompleks og involverer klinisk risiko ved at indføre et patogen i et menneske. Vi har udviklet en detaljeret protokol.

Abstract

Eksperimentel human pneumokok vogn (EHPC) er videnskabeligt vigtigt, fordi nasopharyngeal transport af Streptococcus pneumoniae er både den største kilde til transmission og forudsætningen for invasiv sygdom. En model for transport vil tillade nøjagtig bestemmelse af de immunologiske korrelater for beskyttelse, den immuniserende effekt af transporten og effekten af ​​værten pres på patogenet i nasopharyngeal niche. Endvidere metoder til transport opdagelse nyttigt i epidemiologiske undersøgelser, herunder vaccine studier, kan sammenlignes.

Sigt

Vi vil udvikle en EHPC platform, som er en sikker og brugbar reproducerbar metode, der kan anvendes til ned-vælg kandidat nye pneumokok-vacciner med forebyggelse af transport som et surrogat for vaccine induceret immunitet. Den vil arbejde hen imod testning af potentielle vacciner og beskrivelser af de mekanismer, der ligger til grund EHPC og vaccine beskyttelse fra kørebanensge ^1. Aktuelle konjugatvacciner mod pneumokokker beskytte børn mod invasiv sygdom selvom nye vacciner er absolut nødvendigt, da den nuværende vaccine ikke giver optimal beskyttelse mod ikke-bakteriel lungebetændelse, og der har været tegn på serotype udskiftning med ikke-vaccine serotyper ^2-4.

Metode

Vi inokulere med S. pneumoniae suspenderet i 100 pi saltvand. Sikkerhed er en vigtig faktor i udviklingen af ​​den EHPC model og opnås gennem intensiv frivillige screening og overvågning. Et sikkerhedsudvalg bestående af klinikere og forskere, der er uafhængige af den undersøgelse giver objektiv feedback på en ugentlig basis.

Den bakterielle inokulum er standardiseret og kræver, at ingen animalske produkter inokuleres i frivillige (vegetabilsk baserede medier og saltholdige). De doser, der kræves for kolonisering (10 ⁴ -10 ⁵⁾ er meget lavere than dem, der anvendes i dyremodeller (10 ^{7) 5.} Afsløring pneumokok transport forstærkes af en høj volumen (helst> 10 ml) nasal vask, som er relativt slim gratis. Denne protokol vil beskæftige sig med de vigtigste dele af protokollen efter tur. Disse er (a) volontørudvælgelsesprocessen, (b) pneumokok inokulum præparat, (c) podning, (d) opfølgning og (e) transport detektion.

Resultater

Vores nuværende protokol har været sikkert i mere end 100 frivillige på en række doser med to forskellige bakterielle serotyper ^6. En dosis spænder studie med S. pneumoniae 6B og 23F øjeblikket udføres for at bestemme den optimale inokulering dosis for 50% transport. Et forudsagt 50% på transport vil gøre det muligt EHPC model at have høj følsomhed for vaccineeffektivitet med små studier numre.

Protocol

1. Frivillige Valg og Screening

1. Raske frivillige er rekrutteret gennem plakat reklamer og på universitetets hjemmeside i henhold til NHS Forskning og etiske komité vejledning.
2. Inklusionskriterierne for deltagelse er:
   1. Voksne i alderen 18-60 år.
   2. Taler flydende engelsk og er i stand til at kommunikere let ved både mobiltelefon og sms.
3. Udelukkelseskriterierne for deltagelse er:
   1. Tæt kontakt med udsatte personer (børn, immunsupprimerede voksne, ældre, kronisk dårligt helbred).
   2. Nuværende ryger eller betydelig rygning historie (> 10 pack år).
   3. Astma eller andre luftvejssygdomme.
   4. Graviditet.
   5. Allergi over for penicillin eller amoxicillin.
   6. Nuværende engagement i et andet klinisk forsøg, medmindre observationelle eller i ikke-interventionel fase.
   7. Stand til at give fuldt informeret samtykke.
4. En indledende screening besøg, cirka en uge før inokulering omfatter en fokuseret klinisk historie og målrettet klinisk undersøgelse.
5. Hvis en hidtil ukendt abnormitet bliver fundet, vil den frivillige blive udelukket fra undersøgelsen og passende undersøgelse vil blive arrangeret gennem den primære sundhedstjeneste.
6. Under den indledende screening besøge en fuldstændig blodtælling opnås at sikre, at antallet af hvide blodlegemer er inden for normalområdet inden inokulering besøg. En nasal vask udføres for at udelukke fysiske pneumokok luftfartsselskaber (se 6,1).
7. Før podning, er frivillige uddannet på de risici, der er forbundet med deltagelse i undersøgelsen, og er forsynet med en akut patient folder, digitalt termometer, alarmnumre og 3 dages kursus af amoxicillin.

2. Fremstilling af Inokulation Stocks

1. Fremstilling af inokulation lagre skal udføres i et rent miljø. De brugte pipetter bør kun bruged for inokulum præparat. Alle glas og plast ware skal være sterile. Vi anbefaler, at inokulation lagre fremstilles i et dedikeret rum, ved hjælp af en dedikeret fumehood og inkubator.
2. Pneumokok-stammer podes på en blodagarplade. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i _5% CO2 natten over. Den følgende dag alle bakterierne er skrabet fra blodagarplade og inokuleret i en vulst stock konservering system. Disse perle bestande anvendes til podning bestand forberedelse. Test perle lagre for forurening og koloni ensartethed før forberedelse af en podning lager.
3. Til fremstilling af podningen lager, inokulere en blodagarplade med to kugler fra den ønskede pneumokokserotyper bead stock, striber for at dække hele pladen. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i _5% CO2 natten over. Alle yderligere inkubationer vil bruge de samme betingelser. Også inkuberes Vegitone medier natten over for at sikre sterilitet.
4. Den næste morgen swabhalvdelen af ​​pladen, pas på ikke at fjerne noget blod agar, og føje til 12 ml forvarmet Vegitone bouillon. Gentag med den anden halvdel af pladen. Lad de to 12 ml hætteglas ved 37 ° C i 2 timer, eller indtil en ændring i uklarhed viser sig, hvad der kommer først.
5. Tilsæt 12 ml til 40 ml forvarmet Vegitone bouillon og blandes. Gentag i den anden 12 ml hætteglas. Dette er tidspunktet = 0.. Fjern 100 pi at læse den optiske densitet (OD) ved 600 nm. Fjern 20 pi til kvantificering af bakterier ved kolonidannende enhed (CFU) tælling under anvendelse af en variation af fremgangsmåden af Miles og Misra (M & M) ^7. Inkuberes begge hætteglas.
   1. For M & M, opdele en blodagarplade i seks sektioner. Tilsættes 180 ul sterilt PBS til seks brønde i en plade med 96 brønde (U-bund). Der tilsættes 20 ul af mediet til toppen godt og blandes. Serielt Fortynd prøven 1:10 seks gange og kassér 20 ul fra den sjette brønd. Der lægges 10 ul dråber fra den øverste til første sektion afblodagarplade. Gentag for de fem andre brønde. Sikrer pladen er tør, før den vendes om og inkuberes.
   2. Den næste dag tælle antallet af synlige kolonier i hver fortynding sektion og optage. Ved hjælp af fortynding sektion med en tæller mellem 30 og 300, dividerer med antallet af synlige kolonier efter tre for at få et gennemsnit.
   3. Multiplicer det gennemsnitlige antal kolonier med fortyndingsfaktoren og derefter dividere med 10 (mængden af ​​10 pi drop). Dette giver CFU / ul.
   4. Multiplicer tallet med 1000 for at få CFU / ml.
6. Udfør OD 600 aflæsninger og kvantificering af bakterier af M & M metode hver time indtil tidlig mid-log fase er nået, en OD på 0,25.
7. Når denne OD er ​​nået, tilsættes steriliseret 10% glycerol til et hætteglas og fremstille 1 ml aliquoter. Opbevar portioner ved -80 ° C.
8. For en mere koncentreret lager, centrifugeres den anden hætteglasset ved 3345 x g i 15 minutter og fjern supernatanten. Pellet resuspenderes i 22,5 ml Vegitone medium, og der tilsættes 10% glycerol. Fremstille 1 ml alikvoter og opbevares ved -80 ° C.
9. Lad lagre ved -80 ° C i mindst 48 timer før optøning og kvantificere.
10. Kvantificere den frosne bakteriel bestand af M & M metode. Teste tre stock rør individuelt for at sikre reproducerbarhed. Bruge værdien opnået for at fortynde lager til den ønskede inokulumkoncentration i saltvand, som beskrevet nedenfor.
11. For en podning, er mængden af ​​pneumokokker i podestoffet beregnet før og efter inokulering. Denne kvantificering af bakterier fra M & M metode anvendes til at bestemme det gennemsnitlige antal af pneumokokker i inoculum som tegner sig for den tid, det tager at udføre hele proceduren.
    1. Der laves et inokulum, fortynding til den ønskede koncentration, og udføre kvantificering af M & M fremgangsmåde til "præ-inokulation" count.
    2. I vores Clinical Research Facility, det tager holdet 30 min at fuldføre hele inokuleringsprocedurerne. Pneumococcal suspensioner i saltvand vil normalt vise et reduceret antal i dette interval. At tage højde for dette lader vi fortyndede podestof sidder ved stuetemperatur i 30 minutter og derefter udføre en "efter indpodning" kvantificering af bakterierne fra M & M metoden.
    3. Tag gennemsnittet af før og efter at bestemme den endelige inokuleret koncentration. Juster "møde" tid i henhold til dine kliniske protokol, men beholde intervallet så kort som muligt.
12. Alle nye aktier skal sendes til et referencelaboratorium for bekræftelse på lager renhed og identitet.

3. Inoculum Forberedelse

1. Fremstilling af inoculum bør begynde 30 minutter før den planlagte frivillige podning udnævnelsen.
2. Tag en af ​​de tidligere foretagne lagerfører rørene ud af -80 ° C fryser, tø det og drej røret i mikrocentrifuge ved 17.000 xg i 3 min.
3. Varme blodagarplader i 37 ° C inkubator. Forbereden 96-brønds plade til bakteriel kvantificering af M & M fremgangsmåde og forberede fortynding rør i overensstemmelse med den ønskede dosis.
4. Fjern bouillon supernatanten fra den centrifugerede rør, og pellet resuspenderes i 1 ml saltvand. Dette trin fjerner væsken fra inoculum.
5. Gentag centrifugering.
6. Fjern saltvand supernatanten og resuspender pellet i 1 ml saltvand.
7. Udfør fortynding sæt til den ønskede inokulumkoncentration og kvantificere af M & M metode.
8. Tag inoculum til volontøren udnævnelse og efter inokulering de frivillige, kvantificeringen gentage i laboratoriet. Mærk røret med dato og inokulum dosis og opbevares ved -80 ° C.
9. At sikre overensstemmelse fra inokulation til inokulation, er det vigtigt at anvende de samme pipetter og dedikeret laboratorieudstyr hver gang.

4. Inokulation

1. Frivillige skal sidde behageligt i en halvt liggende stilling.
2. Langsomt bortvise inoculum på næseslimhinden med en cirkulær bevægelse.
3. Det er afgørende, at pipettespidsen ikke kommer i kontakt med næseslimhinden som en afbrydelse i integriteten af ​​epithelium kan resultere i bakterierne ind i blodbanen.
4. Det er også afgørende, at inoculum ikke er placeret for langt tilbage eller det vil køre ned i halsen, og det bør opholde sig inde i næsehulen.
5. Gentag i den anden Naris.
6. Har den frivillige forblive i halvt liggende stilling i 10 minutter uden at sniffe eller pudse næse. Dette giver tid til, at bakterierne spredes på tværs af slimhinden.

5. Overvågning

1. Frivillige overvåges dagligt efter podning. Dette omfatter en daglig sms sendt af volontøren til efterforskerne før 2 pm.
2. Hvis teksten is ikke modtaget med 2 pm frivillige vil blive kontaktet for at sikre hans / hendes velbefindende. Hvis han / hun ikke svarer, vil den tildelte pårørende kontaktes for at sikre den frivilliges velbefindende.
3. Frivillige er bedt om at rapportere om eventuelle øvre luftveje symptomer ved hver udnævnelse. Klinisk personale vil bede frivillige til at beskrive hans / hendes symptomer og vil følge op på eventuelle klager.
4. De antibiotika til de frivillige skal kun tages under tre omstændigheder i tilfælde af, at de er utilpas og bliver bedt om at tage dem af forskerholdet, hvis de medbringer pneumokokker ved afslutningen af ​​undersøgelsen, eller hvis de er utilpas og ude af stand til at kontakte forskerholdet. Den frivillige opfordres til at holde denne nødsituation pack med dem på alle tidspunkter under undersøgelsen og anmodes om at kontakte forskerholdet på daglig basis for de næste 7 dage.
5. Vores team er tilgængelig 24/7 med sygeplejerske kontakt i arbejdstiden og to læger til rådighed ud af hoUrs. Alle forespørgsler behandles af telefonsamtale og / eller øjeblikkelig gennemgang. Bestemmelser er til rådighed for øjeblikkelig, direkte adgang til en smitsom sygdom afdeling, hvis det er nødvendigt.

6. Nasal Wash (NW) Procedure

1. Nasale vaskninger (NW) udføres ved en indledende screening visit, såvel som 48 timer, 7 og 14 dage efter indpodning. NW anvendte metode er taget fra Naclerio et al. ⁸ frivillige naturligt koloniseret af S. pneumoniae er udelukket fra podning og opfølgning.
2. Den frivillige sidder komfortabelt og hovedet vippes tilbage 30 ° fra lodret.
3. Spørg de frivillige til at tage en dyb indånding i og holde vejret, mens skubbe deres tunge op og bagud mod ganen. Mens der i denne stilling, er den frivillige bedt om at signalere, at de er klar.
4. En sprøjte fyldes med 20 ml saltvand indsættes i den forreste nasal rum og 5 ml saltvand uddrives. Den volunteer så læner sig frem med det samme og udstøder væsken ved exhaling hurtigt gennem deres næse ind i en folie skål.
5. Gentag denne procedure 3 gange til, således at hver Naris er blevet vasket to gange, og den fulde 20 ml er anvendt.
6. Pool alle prøver sammen i et centrifugeglas, og sende til laboratoriet ved stuetemperatur til forarbejdning.

7. Nasal Wash Processing

1. Centrifugeres prøverne i 10 minutter ved 3345 x g.
2. Fjern supernatanten og gemmes som 1 ml prøver i mærkede Eppendorf-rør ved -80 ° C.
3. Tilsæt 100 pi STGG medium ⁹ til pelleten, og bland grundigt. Sikre, at det samlede volumen i røret på dette tidspunkt bestemmes. Denne fortynding vil blive brugt i beregningen af ​​CFU af en vogn positiv NV.
4. Pladen a 20 pi dråbe af STGG indeholdende den resuspenderede pellet til en blod-agarplade indeholdende gentamicin og streak hele pladen.
   1. Hvis NW er efter indpodning, Fjerne 10 ul fra STGG indeholdende den resuspenderede pellet og anvendelse for bakteriel kvantificering af M & M metoden.
5. Tilføj en anden 800 ul STGG til NW røret og bland grundigt.
6. Pladen 25 pi på en blodagarplade og 25 pi på en chokolade-agarplade, striber hele pladen.
7. Opdel det resterende beløb bakterier suspenderet i STGG medium i 2 kryohætteglas og opbevares ved -80 ° C.
8. Pladerne inkuberes ved 37 ° C natten over i _5% CO2.
9. Undersøg pladerne den næste dag for pneumokokker og andre potentielle respiratoriske patogener.
10. Pneumokokker er identificeret på plader med kolonimorfologi. Alpha hæmolytiske kolonier med ordfører morfologi er subkultiveret på blodagar med en optochin disk og inkuberet natten over.
11. Formodede pneumokok kolonier, som er optochin følsomme, er Gram farves at bekræfte Gram positiv diplokokker og serotypebestemmes med Statens Serum Institut Pneumotest-latex kit.

Representative Results

Vi har erfaring med inokulering 159 mennesker, hvoraf 35 har foretaget pneumokokker. Den laveste dosis opnåede vi transport med hjælp serotype 6B var 11.100 cfu/100 gi pr Naris, den højeste dosis var 313.000 cfu/100 gi pr Naris. Den laveste dosis opnåede vi transport med anvendelse af serotype 23F var 9.000 cfu/100 gi pr Naris, den højeste dosis var 84.500 cfu/100 gi pr Naris.

Vores metode til transport vurdering er en nasal vask, valgt, fordi en nylig undersøgelse ¹⁰ viste, at 91% af frivillige fundet nasal vask at være mere komfortabel end nasopharyngeal podepind, den nasale vask var også mere tilbøjelige til at opdage patogener ved hjælp af mikrobiologisk kultur. Mikrobiel flora inddrevet på blodagarplader inokuleret med NW kan være variabel og vanskelig at læse. Gentamicin anvendes på den første blodagarplade at selektere for pneumokokker. Chokoladen agarplade og den anden blodagarplade anvendes til at opdage andre potentielle respiratorisk vejogens, som kan hjælpe eller hindre pneumokok kolonisering. Et eksempel på en blodagarplade podet med NW, som er let at læse er vist i figur 1a; en vanskelig plade indeholdende adskillige typer af flora er vist i figur 1b.

På hver udnævnelse frivillige blev bedt om at beskrive eventuelle øvre luftveje symptomer, hvis den findes, og sammenligninger mellem luftfartsselskaber og ikke-bærere blev fremhævet. Af de 145 personer for nylig inokuleret med pneumokokker, klagede 28 af symptomer (tabel 1). Otte af disse var bærere, 20 ikke var. De mest almindelige symptomer var uspecifikke nasale symptomer (tabel 1). Af de tilfælde, hvor der blev rapporteret systemiske symptomer, herunder feber og / eller utilpashed, viste ingen af ​​de gennemførte undersøgelser beviser for pneumokoksygdom og symptomer var i overensstemmelse med samtidig virusinfektion bortset fra et tilfælde af halsbetændelse. To pneumokok positive frivillige blev behandlet med antibiotika. Den ene klagede over ondt i halsen og øre ache, og efter et møde med undersøgelsen læge, blev rådet til at tage antibiotika som en sikkerhedsforanstaltning. Den anden frivillige blev diagnosticeret klinisk med halsbetændelse. Alle frivillige havde en hurtig løsning af symptomer.

Figur 1. Blodagarplade podet med NW. Blodagarplader inokuleret med NW kan være vanskelig at læse. 1a er et eksempel på en plade, som er let at læse med pneumokokker klart synlig. 1b er en plade med mange co-koloniserende flora gøre det mere vanskeligt at opdage, hvis pneumokokker er til stede.

Symptomer		Carriage (n = 32)	Ingen Carriage (n = 112)
Allesymptomer		24%	18%
Systemisk	Feber	3%	4%
	Utilpashed *	9%	4%
Local	Ører	9%	3%
	Næse	0	10%
	Throat	12%	3%

Tabel 1. Karakterisering af frivillige rapporterede symptomer efter S. pneumoniae 6B podning. Alle klager blev revideret af den eksterne sikkerhedsudvalget og efter fuld undersøgelser blev ingen symptomer tilskrives pneumokoksygdom. De mest almindelige symptomer var ondt i halsen, fyldte næse og influenzalignende sygdom.

Discussion

Den EHPC platform har en række potentielle anvendelser, herunder anvendelse som en mucosal vaccine model og som erstatning for beskyttelse til afprøvning af nye proteinfejlindikatorer vacciner. Fremgangsmåden er afhængig af en konsekvent inokulation teknik og en høj kvalitet NW.

Reproducerbarhed kan være et problem med inoculum. På grund af den variable beskaffenhed af de frosne bakterielle alikvoter, kan det være svært at genskabe den ønskede dosis. En halvering eller fordobling af den ønskede dosis betragtes inden for rækkevidde. Det er afgørende, at den bakterielle kvantificering udføres umiddelbart før-og efter podning, for nøjagtigt at bestemme kvantificering af bakterier ved CFU count. Af denne grund kan det være nyttigt, hvis frivillige aftaler optræder samtidigt, således at kun ét inokulum behøver at være og kvantificeringen plating udført før og efter inokulering sker ikke mere end 30 min fra hinanden.

NW fremgangsmåde kræver samarration af de frivillige og ikke ville være en ideel metode hos børn. Hvis udbyttet er mindre end 5 ml, kan proceduren gentages ved hjælp frigøre yderligere 20 ml. Iført proteser kan reducere NW udbytte. Hvis de frivillige har en blokeret / overbelastede næse og saltvand er ved at løbe ud fortil efter indsættelse, pudser næse, skal du indsætte sprøjten lidt længere tilbage, og vippe hovedet tilbage mere, hvis det er nødvendigt.

Det NW er en teknik, der bliver bedre med praksis. Nogle volumen vil normalt blive tabt så målet er for et afkast på mindst 10 ml. Hvis volontøren kan smage saltvand under NW derefter forbindelsen mellem den bageste nasopharynx og oropharynx er ikke blevet tilstrækkeligt lukket af den frivilliges tungen. Hvis frivillige sluger fleste af saltvand, forklarer proceduren igen, understreger skubning af tungen mod ganen. Derefter gentages proceduren for at øge lydstyrken tilbage.

Hvis NW indeholder en substantial mængde slim, er det bedst at fjerne det før centrifugering. Vortex prøven for at løsne noget, der kan være bundet til slim og derefter fjerne så meget af de store stykker som muligt under fjernelse af så lidt saltvand som muligt.

En tidligere EHPC undersøgelse i USA blev afsluttet sikkert og havde ingen bivirkninger ^11. For at sikre den fortsatte sikkerhed EHPC platform, har vi oprettet en nødsituation protokol, der er bygget op omkring 24 hr adgang til forskerholdet. Frivillige får kontaktoplysninger, der giver dem adgang til forskerholdet 24 timer om dagen. Enhver medicinsk nødvendige pleje gives i Royal Liverpool University Hospital. Som en yderligere beskyttelsesforanstaltning, modtager et sikkerhedsudvalg bestående af klinikere og forskere fra lande uden for forskergruppen en ugentlig sikkerhedsrapport. Rapporten indeholder den bakterielle dosis hver volontør modtaget, og om eventuelle symptomer eller sygdom blev rapporteret. Denne rapport giver sikkerhed the undersøgelse, der skal eksternt kritiseret uden bias. Sikkerhedsudvalget er også tilgængelige 24 timer i døgnet i det usandsynlige tilfælde af en nødsituation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Fisher	G/0650/08
0.9% Sodium Chloride	B. Braun	3627667
Skim milk powder	Fluka	70166
Tryptone soya broth	Becton Dickinson	211768
Glucose	BDH	284504S
Columbia Agar with chocolated horse blood	Oxoid	PB0124
Pneumotest-latex kit	Statens Serum Institut	51823