実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

Summary

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ、キャリッジの自然なモデルとワクチン開発で使用するための潜在的なモデルを提供しています。この技術は貴重まだ複雑で、人間に病原体を導入することにより、臨床的リスクを伴います。私たちは詳細なプロトコルを開発した。

Abstract

肺炎球菌の鼻咽頭保菌は、伝送と侵襲性疾患の前提条件の主要な供給源でもあるので、実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ（汎用CPU）は、科学的に重要である。キャリッジの機種は、保護の免疫相関の正確な決定は、キャリッジの免疫効果は、鼻咽頭ニッチにおける病原体上のホスト·圧力の影響を許容するでしょう。さらに、ワクチンの研究を含む疫学的研究に有用キャリッジ検出の方法は、比較することができます。

目指す

我々は、ワクチンによって誘導される免疫の代用としてキャリッジの防止にダウン選択候補小説の肺炎球菌ワクチンに使用することができる安全で有用な再現性のある方法である汎用CPUプラットフォームを開発することを目指しています。これは、汎用CPUとcarriaからワクチン防御のメカニズムの候補ワクチンと説明の試験に取り組んでいきますGE ^1。新しいワクチンは現在のワクチンは、非菌血症肺炎に対して最適な保護を与えないように緊急に必要とされると非ワクチン血清型^2から4と ​​血清型交換の証拠があったものの、肺炎球菌に対する現在の共役ワクチンは侵襲性疾患から子供を守る。

方法

我々は、Sで接種する肺炎は、生理食塩水100μlに懸濁した。安全性は、汎用CPUモデルの開発における主要な因子であり、集中的なボランティアのスクリーニングおよびモニタリングを通じて達成されます。研究から独立している臨床医と科学者で構成される安全委員会が毎週のように客観的なフィードバックを提供します。

細菌接種は、標準化されており、動物性製品はボランティア（野菜ベースのメ​​ディアや生理食塩水）に接種されていないことが必要です。植民地化（10 ^{4〜10 5）}に必要な用量は、はるかに低い股関節アールnのものは、動物モデル（10 ^7）5で使用した。比較的粘液無料鼻洗浄は、肺炎球菌キャリッジを大音量によって強化されて検出（理想的には> 10ミリリットル）。このプロトコルは、順番にプロトコルの中で最も重要な部分を扱います。これらの（a）はボランティアの選定、（b）は肺炎球菌接種の準備、（c）の接種、（d）のフォローアップと、（e）キャリッジ検出されています。

結果

我々の現在のプロトコルは、2つの異なる細菌の血清型^6を使用^して、用量の範囲で、100以上のボランティアで安全になっています。 Sを使用して用量範囲の研究肺炎 6Bおよび23Fは、現在50％のキャリッジのための最適な接種用量を決定するために実施されています。キャリッジの50％率は汎用CPUモデルは小規模な研究番号とワクチンの有効性のための高感度を持つことができるだろうと予測。

Protocol

1。選択とスクリーニングをボランティア

1. 健康なボランティアは、NHSの研究倫理委員会のガイダンスに従ってポスター広告を通じて、大学のウェブサイト上で募集しています。
2. 参加のための選択基準は以下のとおりです。
   1. 18から60歳の成人。
   2. 流暢な英語を話し、携帯電話やテキストメッセージの両方で容易に通信することが可能である。
3. 参加のための除外基準は以下のとおりです。
   1. リスク個人（子供、免疫抑制大人、高齢者、慢性病気）でと連絡を閉じます。
   2. 現在の喫煙者や重大な喫煙歴（> 10パック年）。
   3. 喘息や他の呼吸器疾患。
   4. 妊娠。
   5. ペニシリンまたはアモキシシリンにアレルギー。
   6. 観察しない限り、または非介入段階で別の臨床試験で現在の関与。
   7. 完全にインフォームドコンセントを与えることができません。
4. 初期スクリーニング訪問、接種する前に、約1週間は、焦点を絞った病歴とターゲット臨床検査が含まれています。
5. 以前に認識されていない異常が見つかった場合は、ボランティアは研究から除外され、適切な調査がプライマリケアを介して配置されます。
6. 初期スクリーニングで白血球数が接種を訪問する前に、通常の範囲内であることを確実にするために求められるフル血球数を参照してください。鼻洗浄は、（6.1を参照してください）​​自然な肺炎球菌のキャリアを排除するために行われる。
7. 接種の前に、ボランティアが研究への参加に伴うリスクについて教育されており、救急患者のリーフレット、デジタル温度計、緊急電話番号とアモキシシリンの3日間コースが設けられている。

2。接種株の作製

1. 接種株の調製はクリーンな環境で行わなければなりません。ピペットは使用のみ使用されるべきである接種の準備のためのD。すべてのガラスやプラスチック容器は、無菌でなければならない。我々は、接種株は、専用fumehoodとインキュベーターを用いて、専用の部屋で準備することをお勧めします。
2. 肺炎球菌の菌株は血液寒天プレート上に接種されています。プレートを5％CO _2下で一晩37℃でインキュベートする。翌日は、すべての細菌が血液寒天プレートから掻き取り、ビード株式保全システムに接種する。これらのビーズを取り揃えており、接種の在庫準備のために使用されます。接種の在庫を準備する前に、汚染やコロニーの均一性のためにビーズ銘柄をテストします。
3. 接種の在庫を準備するには、プレート全体をカバーするためにストリーキング、希望肺炎球菌血清型ビーズストックから2ビーズで血液寒天プレートに接種する。 ₂晩、5％のCOで37℃でプレートをインキュベートする。それ以降のすべてのインキュベーションは、これらと同じ条件を使用します。また、無菌性を確保するために一晩Vegitoneメディアをインキュベートする。
4. 翌朝綿棒2分の1プレートは、任意の血液寒天培地を除去し、あらかじめ温めておいたVegitoneブロスの12ミリリットルに追加しないように注意してください。プレートの残りの半分を使用して繰り返します。濁度の変化が明らかになるまで、2時間または37℃で2つの12 mLバイアルを残して、いずれか早い方。
5. あらかじめ温めておいたVegitoneブロス40mlに12ミリリットルを加え、よく混ぜる。他の12 mlバイアルに対して、この手順を繰り返します。これは、時点= 0です。 600nmでの光学密度（OD）を読むために100μlを削除します。マイルズとMisraの（M＆M）は⁷でメソッドのバリエーションを使用してコロニー形成単位（CFU）のカウントによって細菌の定量化のための20μlを削除します。両方のバイアルをインキュベートする。
   1. M＆Mのために、6つのセクションに血液寒天プレートを分割します。 96ウェルプレートの6ウェル（U底）に滅菌PBS 180μlを添加する。トップだけでなく、ミックスにブロスの20μlを添加する。逐次サンプル一時10 6倍に希釈し、第六ウェルから20μlを捨てる。ウェルの最初のセクションに先頭から310μlの水滴を置き血液寒天プレート。 5他のウェルについて、この手順を繰り返します。それが反転してインキュベートされる前に、板が乾燥していることを確認します。
   2. 翌日は各希釈部と記録に見えるコロニー数をカウントします。 30と300の間の数で希釈セクションを使用して、平均値を得ることが3によって可視コロニー数を割る。
   3. 希釈率をコロニー数の平均値を乗算した後、10（10μlの降下量）で割ります。これは、CFU /μlで与える。
   4. CFU / mlを得るために1000でこの数値を掛けます。
6. 早い中間対数期に達するまで0.25のOD、毎時のM＆M法による細菌のOD 600が測定値と定量を行う。
7. この外径に達すると、1バイアルに滅菌10％グリセロールを追加し、1mlのアリコートを準備します。 -80℃でアリコート℃で保存し
8. より濃縮された株式については、15分間3345 xgで他のバイアルを遠心分離し、上清を除去する。 Vegitonの22.5ミリリットルでペレットを再懸濁し電子媒体及び10％グリセロールを追加します。 -80℃で1mlアリコートとストアを準備℃に
9. 解凍および定量化する前に、少なくとも48時間、-80℃で株式を残す。
10. M＆Mの方法により凍結細菌株を定量化する。再現性を確保するため、個別に3在庫管をテストします。後述するように、生理食塩水で所望の接種濃度に株式を希釈するために取得した値を使用します。
11. 接種については、接種で肺炎球菌の量は接種前と後に計算されます。 M＆M法による細菌のこの定量化は、それが全体の手順を完了するのにかかる時間を占める接種で肺炎球菌の平均数を決定するために使用されます。
    1. 所望の濃度に希釈し、接種を準備して、 "事前接種"カウントのためのM＆M法により定量を行う。
    2. 我々の臨床研究施設では、全体の接種の手順を完了するには、チームで30分かかります。 Pnは生理食塩水でeumococcal懸濁液は、通常、この間隔の減少カウントが表示されます。これを説明するために、我々は30分間室温で希釈した接種座り込みを聞かせて、その後のM＆M法による細菌の "接種後"定量を行う。
    3. 最終接種濃度を決定するために前後の平均を取る。あなたの臨床試験計画書によると、 "座っている"の時間を調整しますが、できるだけ簡潔に間隔を保つ。
12. すべて新株式は、株式の純度とアイデンティティの確認のための基準実験室に送られるべきである。

3。接種の準備

1. 接種物の調製は、スケジュールされたボランティアの接種の予定30分前に開始する必要があります。
2. -80℃の冷凍庫から以前に作成した在庫管の1を取り出し、それを解凍し、3分間17000×gで遠心チューブをスピン。
3. 37℃インキュベーターで温かい血液寒天プレート。準備するM＆M法による細菌の定量化のための96ウェルプレートおよび所望の投与量に応じて希釈用チューブを準備します。
4. 遠心分離チューブからブロス上清を除去し、生理食塩水1mlにペレットを再懸濁します。このステップでは、接種から培養液を除去します。
5. 遠心ステップを繰り返します。
6. 生理食塩水上清を除去し、生理食塩水1mlにペレットを再懸濁します。
7. 希望接種濃度の希釈セットを実行し、M＆Mの方法により定量化する。
8. ボランティア予定に接種を取り、ボランティアを接種した後、ラボで定量化を繰り返します。 -80℃での日付と接種量や店舗でチューブにラベルを付け℃に
9. 接種から接種への一貫性を確保するために、それは同じピペットと専用の実験装置たびに使用することが重要です。

4。接種

1. ボランティアは、半臥位で快適に座っすべきである。
2. ゆっくりと円を描くようにして鼻粘膜に接種を追放。
3. それは、ピペットの先端が血流に入る細菌につながる可能性上皮の完全性の混乱として鼻粘膜に接触しないことが重要です。
4. これは、接種しすぎて戻されていないか、またはそれが喉を実行されることも重要であり、それは鼻腔の内側に存在する必要があります。
5. 他の鼻孔についても同じ手順を繰り返します。
6. ボランティアが鼻を盗聴または吹くことなく10分間、半臥位のままで持っています。これは、細菌が粘膜を横切って分散させるための時間を確保できます。

5。監視

1. ボランティアは、接種後に毎日監視されています。これは、午後2時前に調査官にボランティアによって送信された毎日のテキストメッセージが含まれています。
2. テキストiの場合sは、ボランティアが彼/彼女の幸福を確保するために接続される2時までに受け取っていない。彼/彼女が応答しない場合は、親族の割り当てられている次は、ボランティアの福祉を確保するためにご連絡させていただきます。
3. ボランティアは、すべての予定で任意の上気道症状を報告するように求められます。臨床スタッフは彼/彼女の症状を記述するためにボランティアをお願いし、苦情をフォローアップします。
4. ボランティアに与えられた抗生物質は、次の3つの状況下で撮影するだけであり、彼らが体調不良であり、彼らは研究の終了時に肺炎球菌を運ぶか、またはそれらが体調不良であればしている場合は、研究チームがそれらを取るように指示された場合に研究チームに連絡することができません。ボランティアは、試験期間中にすべての回で一緒にこの緊急パックを維持することが奨励され、次の7日間、毎日のように研究チームに連絡することを要求され​​ています。
5. 私たちのチームは、HOのうち勤務時間中に看護師の連絡先と利用できる24/7であり、2つの医師が利用できるURS。全ての問い合わせは、電話の呼び出しおよび/または即時見直しによって対処されています。必要に応じて規定は、感染症病棟への即時、直接入学のために用意されています。

6。鼻ウォッシュ（NW）手順

1. 鼻洗浄（NW）は、最初のスクリーニング訪問と同様、48時間、7日および14日、接種後に実行されます。使用NWメソッドはNaclerio らから取得されます^。8ボランティアが自然に、S.によって植民地化肺炎球菌は、接種から除外され、フォローアップされています。
2. ボランティアは、快適な姿勢で座っていると頭が垂直から戻って30°傾いている。
3. で深呼吸をして口の屋根に対して後方に自分の舌を押し上げながら、自分の息を保持するためにボランティアをお願いします。この位置にしながら、ボランティアは、彼らは準備ができていることを通知するように頼まれます。
4. 20mlの生理食塩水を充填したシリンジは前鼻の空間に挿入され、生理食塩水5mlを追放されています。 volunteerは、その後すぐに前かがみと箔ボウルに彼らの鼻を通して急速に吐き出すことにより、流体を排出する。
5. この手順を各鼻孔を2回洗浄されており、完全な20ミリリットルが用いられてきたように、3回繰り返します。
6. 遠心管中で一緒にプールのすべてのサンプルを処理し、室温で実験室に送る。

7。鼻洗浄処理

1. 3345×gで10分間サンプルを遠心分離します。
2. -80℃で標識したエッペンドルフチュー​​ブに1 mlアリコートとして清とストアを削除℃に
3. ペレットに媒体⁹ STGGの100μlを加えてよく混合します。この時点でチューブ内の総量が決定されることを確認します。この希釈は、キャリッジ正NWのCFUを計算する際に使用されます。
4. プレートゲンタマイシン、ストリーク、プレート全体を含む血液寒天プレートに再懸濁したペレットを含むSTGG20μlのドロップ。
   1. NWは、接種後の場合、再懸濁ペレットと、M＆M法による細菌の定量化のための使用を含むSTGGから10μlを削除します。
5. NWチューブにSTGGの別の800μlを加えてよく混合します。
6. 血液寒天プレートとチョコレート寒天プレート上に25μlの上にプレートを25μl、プレート全体をストリーキング。
7. -80℃で2クライオバイアルとストアにメディアをSTGGに懸濁させ、残量の細菌を分ける℃に
8. 5％CO ₂で37℃で一晩プレートをインキュベートする。
9. 肺炎球菌やその他の潜在的な呼吸器病原体のために翌日プレートを調べます。
10. 肺炎球菌は、コロニー形態によりプレートで識別されます。製図形態を有するα溶血性コロニーがoptochinディスクと血液寒天培地上で継代培養され、一晩インキュベートした。
11. optochin小文字が区別され、推定肺炎球菌のコロニーはグラムグラム陽性diplococcusの複数形を確認するために染色し、Statens血清研究所PNEUを使用して血清型アールmotest-ラテックスキット。

Representative Results

我々は、経験が、35は肺炎球菌を実施しているそのうちの159人に接種した。我々は血清型6Bを使用してキャリッジを達成した最低用量は、最高用量は鼻孔あたり313000 CFU/100μLであった、鼻孔あたり11100 CFU/100μLであった。我々は血清型23Fを使用してキャリッジを達成した最低用量は、最高用量は鼻孔あたり84500 CFU/100μLであった、鼻孔あたり9000 CFU/100μLであった。

キャリッジアセスメントの我々の方法は、最近の研究では¹⁰人のボランティアのうち91％が鼻咽頭スワブより快適に鼻洗浄を見つけたことを示したので、選ばれた鼻洗浄、である;鼻洗浄はまた、微生物培養を用いた病原体を検出する可能性が高くなりました。 NWを接種し、血液寒天プレート上で回収された微生物叢が読み変数とが困難な場合があります。ゲンタマイシンは肺炎球菌を選択するために最初の血液寒天プレート上で使用されています。チョコレート寒天プレートと第2の血液寒天プレートは、他の潜在的な呼吸のパスを検出するために使用され肺炎球菌のコロニー形成を助けたり、妨げになるかもしれogens。読みやすいNWを接種血液寒天プレートの例を図1aに示します。フローラの数多くの種類を含む困難なプレートは 、 図1bに示されている。

すべての予定のボランティアで、任意の上気道症状を説明するように求めていた、存在する場合は、キャリアと非キャリア間の比較が強調された。最近、肺炎球菌を接種した145人のうち、28は（ 表1）の症状を訴えた。これらのうち8人が20でなかったキャリアがあった。最も一般的な症状は、非特異的鼻症状（ 表1）であった。発熱および/または倦怠感などの全身症状を、そこに報告され、実施調査の未肺炎球菌疾患や症状の証拠を示さなかった例の扁桃炎の1症例を除いて同時ウイルス感染と一致していました。二つ肺炎球菌positiv電子ボランティアは抗生物質で治療した。一つは、喉の痛みと耳の痛みを訴えたと、研究の医者と会った後、予防措置として抗生物質を服用することをお勧めしました。他のボランティアは、扁桃腺炎と臨床的に診断された。すべてのボランティアは、症状の迅速な解決を持っていた。

図1。 NWを接種血液寒天プレート。北西を接種し、血液寒天プレートが読みにくくなることがあります。1aにはっきりと見える肺炎球菌と読みやすい板の一例であり、図1Bはもっとそれを作る共同植民地植物の多くが付いているプレートです肺炎球菌が存在しているかどうかを検出するのが難しい。

症状		キャリッジ（N = 32）	改行なしていない（N = 112）
すべて症状		24パーセント	18パーセント
全身の	発熱	3パーセント	4パーセント
	倦怠感*	9パーセント	4パーセント
ローカル	耳	9パーセント	3パーセント
	鼻	0	10パーセント
	喉	12パーセント	3パーセント

表1。ボランティアのキャラは S以下の症状が報告され肺炎 6B接種はすべての苦情は完全な調査に続いて、外部の安全委員会が検討したが、全く症状は肺炎球菌疾患に起因しなかった。最も一般的な症状は、喉の痛み、鼻の剥製やインフルエンザ様疾患であった。

Discussion

汎用CPUプラットフォームは、粘膜ワクチンモデルとして及び新規タンパク質ワクチンをテストするための保護の代用としての使用を含む、潜在的な用途の番号を持っています。この方法は、一貫性のある接種法および高品質北西に依存しています。

再現性は、接種との問題となることがあります。凍結細菌アリコートの可変的性質のために、それが所望の用量を複製することが困難な場合があります。所望の投与量の半減または倍増は範囲内と見なされます。これは、細菌の定量を正確CFUカウントによる細菌の定量化を決定するために、接種直前に - と、次のことを行うことが重要です。ボランティアの予定が1つだけの接種材料を調製し、接種の前後に行われ定量化めっきは別に最大30分に発生される必要があるように、同時に発生した場合このような理由からそれが役に立つかもしれません。

NWメソッドはcoopeが必要ですボランティアの配給と子どもの理想的な方法ではないでしょう。収率は5ミリリットル未満である場合は、プロシージャ名、エキストラ20ミリリットルまでを使用して繰り返すことができます。身に着けている入れ歯はNW収量が減少することがあります。ボランティアがブロック/鼻閉があり、生理食塩水を挿入した後前方に不足している場合は、鼻をかんで、少し戻って、さらに注射器を挿入し、背面より必要に応じて頭を傾けてください。

NWは練習で良くなるテクニックです。目的は、少なくとも10ミリリットルのリターンのためにあるように、いくつかのボリュームは通常失われてしまいます。ボランティアがNWの間生理食塩水を味わうことができるならば、後部咽頭、中咽頭との間の接続が適切にボランティアの舌によって閉鎖されていません。ボランティアはツバメ生理食塩水のほとんどをした場合、口の屋根に対して舌の押し出しを強調し、再度この手順を説明します。その後、ボリュームは返さ高めるための手順を繰り返します。

NWはsubstantが含まれている場合粘液のIAL量は、それが遠心分離する前にそれを削除するのが最善の方法です。渦粘液にバインドされていて、可能な限り少ない生理食塩水などを除去しながら、可能な限り大規模な作品のを取り除くかもしれない何かを緩めするようにサンプル。

アメリカでは以前の研究では、汎用CPUを無事に完了し、有害事象^11を持っ^ていなかった。汎用CPUプラットフォームの継続的な安全性を確保するために、我々は研究チームに24時間アクセスのまわりで基づいている緊急プロトコルを設定している。ボランティアは、彼らが一日研究チームに24時間にアクセスできるように、連絡先の詳細を与えられている。必要なすべての医療はリバプール大学王立病院で提供されています。保護の更なる対策として、臨床医、研究グループ外からの科学者からなる安全委員会が毎週の安全性報告書を受け取ります。レポートには、各ボランティアが受信し、何らかの症状や病気が報告されたかどうかの細菌量を含んでいます。このレポートでは、目の安全性を可能にする外部バイアスなしで批判する電子研究。安全委員会緊急時の万が一にも一日24時間ご利用いただけます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Fisher	G/0650/08
0.9% Sodium Chloride	B. Braun	3627667
Skim milk powder	Fluka	70166
Tryptone soya broth	Becton Dickinson	211768
Glucose	BDH	284504S
Columbia Agar with chocolated horse blood	Oxoid	PB0124
Pneumotest-latex kit	Statens Serum Institut	51823