Summary
Transporte pneumocócica Experimental humano oferece um modelo natural de transporte e um modelo potencial para uso no desenvolvimento de vacinas. Esta técnica é útil mas complexo e envolve o risco clínico através da introdução de um agente patogénico para um ser humano. Nós desenvolvemos um protocolo detalhado.
Abstract
Transporte pneumocócica experimental humano (EHPC) é cientificamente importante porque nasofaríngea dos Streptococcus pneumoniae é a fonte principal de transmissão e o pré-requisito de doença invasiva. Um modelo de transporte permitirá a determinação precisa dos correlatos imunológicos de proteção, o efeito da imunização de transporte e o efeito da pressão de acolhimento sobre o patógeno no nicho da nasofaringe. Além disso, os métodos de detecção de transporte útil em estudos epidemiológicos, incluindo estudos de vacinas, podem ser comparados.
Visar
Nosso objetivo é desenvolver uma plataforma EHPC que é um método seguro e útil reprodutível, que poderia ser usado para baixo-selecionar candidatos vacinas pneumocócicas romance com a prevenção de transporte como um substituto de imunidade da vacina induzida. Ele vai trabalhar para testes de vacinas candidatas e descrições dos mecanismos subjacentes EHPC e proteção da vacina a partir carriage 1. Atuais vacinas conjugadas contra o pneumococo proteger as crianças contra a doença invasiva, embora novas vacinas são urgentemente necessários, como a atual vacina não confere proteção ideal contra os não-bacteriémica pneumonia e não houve evidência de substituição sorotipo com vacinas sorotipos não 2-4.
Método
Nós inocular com S. pneumoniae em suspensão em 100 uL de soro fisiológico. A segurança é um factor importante no desenvolvimento do modelo de EHPC e é conseguido através de um rastreio de voluntários intensivos e monitorização. Um comitê de segurança composto por médicos e cientistas que são independentes do estudo fornece feedback objetivo em uma base semanal.
O inóculo bacteriano é padronizado e exige que nenhum produto de origem animal são inoculados em voluntários (à base de vegetais mídia e salinas). As doses necessárias para a colonização (10 4 -10 5) são muito mais baixos than aqueles usados em modelos de animais (10 7) 5. Detecção de portador de pneumococos é reforçada por um elevado volume (de preferência> 10 ml) lavagem nasal que é relativamente livre de muco. Este protocolo irá lidar com as partes mais importantes do protocolo, por sua vez. Estes são: (a) seleção de voluntários, (b) a preparação do inóculo pneumocócica, (c) a inoculação, (d) acompanhar e (e) a detecção de transporte.
Resultados
Nosso protocolo atual tem sido seguro em mais de 100 voluntários em uma gama de doses usando dois diferentes sorotipos bacterianos 6. Um estudo utilizando doses variando S. pneumoniae 6B e 23F está actualmente a ser realizado para determinar a dose óptima para o transporte de inoculação de 50%. A taxa prevista de 50% de transporte permite que o modelo EHPC ter alta sensibilidade para a eficácia da vacina com números de estudo de pequenas dimensões.
Protocol
1. Voluntários de Seleção e Triagem
- Voluntários saudáveis são recrutados por meio de anúncios de cartazes e no site da Universidade de acordo com a Pesquisa NHS e orientação Comitê de Ética.
- Os critérios de inclusão para participação são:
- Adultos com idade entre 18-60 anos.
- Fala fluentemente Inglês e é capaz de se comunicar facilmente por tanto o telefone móvel e mensagens de texto.
- Os critérios de exclusão para a participação são:
- O contato próximo com a indivíduos de risco (crianças, adultos imunodeprimidos, idosos, saúde crônica doente).
- História de tabagismo atual fumante ou significativa (anos> 10 maços).
- Asma ou outras doenças respiratórias.
- Gravidez.
- Alergia à penicilina ou amoxicilina.
- Participação atual em outro ensaio clínico, a menos observacional ou não-intervencionista fase.
- Incapaz de dar consentimento plenamente informado.
- Uma visita de triagem inicial, cerca de uma semana antes da inoculação, inclui uma história focada clínica e exame clínico-alvo.
- Se uma anormalidade até então desconhecida é encontrada, o voluntário será excluído do estudo e investigação apropriada será organizado através da atenção primária.
- Durante a visita de rastreio inicial de uma contagem de sangue completo é obtido a assegurar que a contagem de células brancas está dentro do intervalo normal, antes da visita de inoculação. A lavagem nasal é realizada para excluir portadores de pneumococos naturais (ver 6.1).
- Antes da inoculação, os voluntários são instruídos sobre os riscos envolvidos com a participação no estudo e são fornecidos com um folheto informativo de emergência, termômetro digital, números de telefone de emergência e três dias de curso de amoxicilina.
2. Preparação de Ações de inoculação
- Preparação dos stocks de inoculação deve ser feito num ambiente limpo. As pipetas usadas só deve ser usard para a preparação do inoculo. Todo o vidro e utensílios de plástico deve ser estéril. Nós recomendamos que os estoques de inoculação ser preparado de uma sala dedicada, utilizando um fumehood dedicado e incubadora.
- Estirpes pneumocócicas são inoculadas em uma placa de ágar sangue. As placas são incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2 durante a noite. No dia a seguir todas as bactérias é raspada da placa de agar de sangue e inoculadas em um sistema de preservação do grânulo estoque. Estes estoques de contas são utilizadas para preparação da inoculação. Teste os estoques talão de contaminação e uniformidade colônia antes de preparar um estoque de inoculação.
- Para preparar o stock de inoculação, inocular uma placa de ágar de sangue com dois rebordos do pneumococos do serotipo estoque desejado grânulo, listando-se a cobrir a totalidade da placa. Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO2 durante a noite. Todas as incubações adicionais irão utilizar as mesmas condições. Também incubar os meios Vegitone durante a noite para garantir a esterilidade.
- O cotonete manhã seguintemeia a placa, não tendo o cuidado de remover qualquer ágar sangue, e adicionar 12 ml de pré-aquecido caldo Vegitone. Repita usando a outra metade da placa. Deixar os dois frascos de 12 ml a 37 ° C durante 2 horas ou até que uma alteração na turvação torna-se aparente, o que ocorrer primeiro.
- Adicionar a 12 ml a 40 ml de caldo de pré-aquecida Vegitone e misturar completamente. Repita para o outro frasco ml 12. Este é o ponto de tempo = 0. Remover 100 ul para ler a densidade óptica (DO) a 600 nm. Remover 20 pi para a quantificação de bactérias formadoras de colónias por unidade (CFU) de contagem usando uma variação do método de Miles e Misra (M & M) 7. Incubar ambos os frascos.
- Para o M & M, dividir uma placa de ágar sangue em seis seções. Adicionar 180 ul de PBS estéril a seis poços de uma placa de 96 poços (fundo em U). Adicionar 20 ul de caldo para o bem de topo e misturar. Serialmente diluir a amostra 1:10 seis vezes e descartar 20 ul do poço sexto. Coloque três gotas 10 uL do bem superior na primeira seção doágar-sangue. Repetir para os cinco outros poços. Assegurar a placa é seca antes de ser invertidas e incubadas.
- No dia seguinte, contar o número de colónias visíveis em cada secção de diluição e de gravação. Usando o ponto de diluição com uma contagem de entre 30 e 300, dividir o número de colónias visíveis por três, para obter uma média.
- Multiplicar o número médio de colónias por o factor de diluição e, em seguida, dividir por 10 (o valor da queda de 10 uL). Isto dá UFC / ul.
- Multiplicar esse número por 1000 para obter CFU / ml.
- Realize OD 600 leituras e quantificação de bactérias por M & M método a cada hora até meados fase log precoce é alcançado, uma DO de 0,25.
- Uma vez que isto é alcançado OD, adicionar 10% de glicerol esterilizado para um frasco e preparar alíquotas de 1 ml. Alíquotas de armazenar a -80 ° C.
- A uma unidade mais concentrada, centrifugar a outra cuvete de 3.345 xg durante 15 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 22,5 ml de Vegitone meio e adicionar 10% de glicerol. Preparar alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C.
- Deixar stocks a -80 ° C durante pelo menos 48 horas antes de descongelação e de quantificação.
- Quantificar o estoque de congelados bacteriana pelo método de M & M. Teste três tubos de ações individualmente para garantir a reprodutibilidade. Utilizar o valor obtido para diluir o material até a concentração desejada em solução salina de inoculo, como descrito abaixo.
- Para a inoculação, a quantidade de pneumococos no inoculo é calculada antes e depois da inoculação. Esta quantificação de bactérias pelo método de M & M é utilizado para determinar o número médio de pneumococos no inoculo que representa o tempo que leva a completar todo o procedimento.
- Preparar um inoculo, a diluição até à concentração desejada e realizar a quantificação pelo método de M & M para o "pré-inoculação" count.
- No nosso Centro de Pesquisa Clínica que leva a equipe de 30 minutos para completar o processo de inoculação inteiro. Pneumococcal suspensões em soro fisiológico normalmente irá mostrar uma contagem diminuída neste intervalo. Para ter em conta isto, nós Deixe o inóculo diluído à temperatura ambiente durante 30 min e, em seguida, executar uma "pós-inoculação" quantificação das bactérias pelo método de M & M.
- Tomar a média do antes e depois de determinar a concentração final inoculado. Ajuste a "sessão" tempo de acordo com o protocolo clínico, mas manter o intervalo tão breve quanto possível.
- Todos os novos lotes deve ser enviado para um laboratório de referência para a confirmação da pureza e identidade de estoque.
3. Preparação do inóculo
- Preparação do inoculo deve começar antes de 30 min o agendamento voluntário inoculação.
- Pegue um dos tubos de ações feitas anteriormente fora do congelador -80 ° C, descongele-o e girar o tubo na microcentrífuga a 17.000 xg por 3 min.
- Placas de agar de sangue quente na incubadora a 37 ° C. Prepararuma placa de 96 cavidades para a quantificação de bactérias pelo método de M & M e preparar tubos de diluição de acordo com a dose desejada.
- Remover o sobrenadante do caldo de tubo centrifugado e ressuspender o pellet em 1 ml de solução salina. Este passo remove o caldo do inóculo.
- Repetir o passo de centrifugação.
- Remover o sobrenadante salina e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução salina.
- Executar conjunto de diluição para a concentração desejada de inóculo e quantificar por M & M método.
- Leve o inóculo para o compromisso voluntário e após a inoculação dos voluntários, repita a quantificação no laboratório. Rotular o tubo com a data e a dose de inoculo e armazenar a -80 ° C.
- Para garantir a consistência da inoculação para a inoculação, é importante usar as mesmas pipetas e equipamento de laboratório dedicado a cada vez.
4. Inoculação
- Os voluntários devem estar sentado confortavelmente em uma posição semi-deitada.
- Lentamente expelir o inoculo para a mucosa nasal, usando um movimento circular.
- É fundamental que a ponta da pipeta não entra em contacto com a mucosa nasal, como uma interrupção na integridade do epitélio pode resultar em que as bactérias que entram na corrente sanguínea.
- É também vital que o inóculo não é colocado muito para trás, ou ele vai correr pela garganta, que devem residir no interior da cavidade nasal.
- Repita a operação para o outro naris.
- Têm o voluntário permanecer na posição de semi-deitada durante 10 min sem cheirar ou assoar o nariz. Isto permite o tempo para as bactérias se dispersar através da mucosa.
5. Monitoramento
- Os voluntários são monitorados diariamente após inoculação. Isso inclui uma mensagem de texto enviado diariamente pelo voluntário para investigadores antes de 2 horas.
- Se o texto inão é recebido por duas horas o voluntário será contactado para garantir a sua / o seu bem-estar. Se ele / ela não responder, o próximo alocado de parentes será contactado para garantir o voluntário do bem-estar.
- Voluntários são convidados a relatar quaisquer sintomas do trato respiratório superior, a cada nomeação. Corpo clínico vai pedir ao voluntário para descrever suas / seus sintomas e irá acompanhar quaisquer queixas.
- Os antibióticos dadas aos voluntários são só deve ser tomada em três circunstâncias: no caso de que eles estão bem e são orientados a levá-los pela equipe de pesquisa, se eles estão carregando pneumococo no final do estudo, ou se eles são mal e não conseguiu contatar a equipe de pesquisa. O voluntário é encorajado a manter este pacote de emergência com eles em todos os momentos durante o estudo e é contactar a equipe de pesquisa em uma base diária para os próximos 7 dias.
- Nossa equipe está disponível 24/7 com o contato enfermeira durante as horas de trabalho e dois médicos disponíveis de hours. Todas as consultas são tratados por chamada telefónica e / ou revisão imediata. Provisões estão disponíveis para admissão imediata e direta a uma ala de Doenças Infecciosas, se necessário.
6. Nasal Wash (NW) Procedimento
- Lavagens nasais (NW) são realizados a uma visita de rastreio inicial, bem como 48 horas, 7 e 14 dias pós-inoculação. O método utilizado é tomado NW de Naclerio et al. Oito voluntários naturalmente colonizado por S. pneumoniae são excluídos da inoculação e acompanhamento.
- O voluntário está sentado confortavelmente ea cabeça inclinada para trás 30 ° com a vertical.
- Peça ao voluntário para tomar uma respiração profunda e segurar a respiração enquanto empurrando a sua língua para cima e para trás, contra o céu da boca. Enquanto nessa posição, o voluntário é convidado a indicar que eles estão prontos.
- A seringa cheia com 20 ml de solução salina é inserido no espaço nasal anterior e 5 ml de solução salina é expelido. O volunteer então se inclina para frente imediatamente e expulsa o fluido por exalar rapidamente através de seu nariz em uma bacia de alumínio.
- Repetir este procedimento 3 vezes mais, de modo que cada naris foi lavado duas vezes e os 20 ml cheio tiver sido utilizado.
- Piscina de todas as amostras em conjunto num tubo de centrífuga e envie para o laboratório à temperatura ambiente durante o processamento.
7. Nasal Wash Processamento
- Centrifugar as amostras durante 10 min a 3.345 x g.
- Remover o sobrenadante e armazenada como alíquotas de 1 ml em tubos Eppendorf marcados à temperatura de -80 ° C.
- Adicionam-se 100 ul de meio STGG 9 do pellet e misture bem. Certifique-se de que o volume total dentro do tubo neste ponto é determinado. Esta diluição será usada para calcular o CFU de uma carruagem NW positivo.
- Placa de queda de 20 ul da STGG contendo o sedimento ressuspenso para uma placa de agar de sangue contendo gentamicina e raia a placa inteira.
- Se o NW é pós-inoculação, 10 ul de remover o STGG contendo o sedimento ressuspenso e utilização para a quantificação de bactérias por M & M método.
- Adicione mais 800 ul de STGG ao tubo NW e misture bem.
- Ul placa 25 sobre uma placa de agar de sangue e de 25 ul numa placa de ágar de chocolate, listando a placa inteira.
- Dividir as bactérias em suspensão numa quantidade restante STGG médio em 2 criotubos e armazenar a -80 ° C.
- Incubar as placas a 37 ° C durante a noite em 5% de CO 2.
- Examine as placas no dia seguinte para pneumococo e outros patógenos respiratórios potenciais.
- Os pneumococos são identificados em placas por meio da morfologia de colónias. Colónias hemolíticas com morfologia alfa relator são sub-cultivadas em agar de sangue, com um disco de optoquina e incubadas durante a noite.
- Presumíveis colónias de pneumococos que são optoquina sensíveis são Gram para confirmar diplococos Gram positiva e sorotipadas usando o Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.
Representative Results
Temos experiência de inocular 159 pessoas, dos quais 35 têm realizado pneumococo. A dose mais baixa que conseguida com o uso de transporte serotipo 6B era 11100 ufc/100 ul por naris, a dose mais elevada foi de 313.000 ufc/100 ul por naris. A dose mais baixa que conseguimos com o uso de transporte 23F sorotipo foi 9000 ufc/100 ul por naris, a dose mais elevada foi 84.500 ufc/100 ul por naris.
Nosso método de avaliação de transporte é uma lavagem nasal, escolhido por um estudo recente 10 mostrou que 91% dos voluntários encontrou lavagem nasal para ser mais confortável do que swab de nasofaringe, a lavagem nasal também foi mais fácil detectar patógenos por meio de cultura microbiológica. Flora microbiana recuperados em placas de ágar sangue inoculados com NW pode ser variável e difícil de ler. A gentamicina é usado na primeira placa de ágar de sangue para seleccionar para pneumococo. A placa de agar de chocolate e a placa de ágar de sangue segundo são utilizados para detectar caminho respiratória outro potencialOgens que podem ajudar ou dificultar a colonização pneumocócica. Um exemplo de uma placa de agar de sangue inoculadas com NW que é fácil de ler é mostrado na Figura 1A, com uma placa de difícil contendo vários tipos de flora é mostrado na Figura 1b.
A cada nomeação voluntários foram solicitados a descrever os sintomas do trato respiratório superior, se presente, e comparações entre portadores e não-portadores foram destaque. Das 145 pessoas recentemente inoculados com o pneumococo, 28 queixaram-se de sintomas (Tabela 1). Oito deles eram portadores, 20 não eram. Os sintomas mais comuns eram não específicas sintomas nasais (Tabela 1). Dos casos em que não foram relatados sintomas sistêmicos, como febre e / ou mal-estar, nenhuma das investigações realizadas mostraram evidência de doença pneumocócica e os sintomas eram compatíveis com a infecção viral concomitante, exceto em um caso de amigdalite. Dois positiv pneumocócicavoluntários de e foram tratados com antibióticos. Se queixou de dor de garganta e dor de ouvido e, depois de se encontrar com o médico do estudo, foi aconselhado a tomar antibióticos como precaução. O outro voluntário foi diagnosticado clinicamente com amigdalite. Todos os voluntários tiveram resolução rápida dos sintomas.
Figura 1. Placa de agar de sangue inoculadas com NW. Placas de agar de sangue inoculadas com NW pode ser difícil de ler. 1a é um exemplo de uma placa que é fácil de ler com pneumococos claramente visível. 1b é uma placa com vários co-colonizadoras flora tornando mais difícil detectar se pneumococo está presente.
| Os sintomas | Transporte (n = 32) | Não Transporte (n = 112) | |
| Todossintomas | 24% | 18% | |
| Sistêmico | Febre | 3% | 4% |
| * Mal-estar | 9% | 4% | |
| Local | Orelhas | 9% | 3% |
| Nariz | 0 | 10% | |
| Garganta | 12% | 3% |
Tabela 1. Caracterização de voluntários relataram sintomas seguindo S. pneumoniae 6B inoculação. Todas as reclamações foram analisadas pelo comitê de segurança externa e, após investigações completas, sem sintomas foram atribuídos à doença pneumocócica. Os sintomas mais comuns foram dor de garganta, nariz e recheado síndrome gripal.
Discussion
A plataforma EHPC tem um número de utilizações potenciais, incluindo o uso como um modelo de vacina da mucosa e como um substituto da protecção para teste de vacinas de proteínas novos. O método depende de uma técnica de inoculação consistente e de alta qualidade NW.
Reprodutibilidade pode ser um problema com o inóculo. Devido à natureza variável das alíquotas congeladas bacterianas, que podem ser difíceis de replicar a dose desejada. Uma redução para metade ou dobrar a dose desejada é considerada dentro do alcance. É fundamental que a quantificação de bactérias ser feito imediatamente antes e após a inoculação, a fim de determinar com precisão a quantificação de bactérias por contagem de CFU. Por esta razão, pode ser útil, se os compromissos voluntários ocorrem simultaneamente, de modo que apenas um inoculo precisa ser preparado e o revestimento de quantificação feito antes e após a inoculação ocorre não mais do que 30 min.
O método requer a NW Cooperação do voluntário e não seria um método ideal em crianças. Se o rendimento é inferior a 5 ml, o procedimento pode ser repetido usando-se a um extra de 20 ml. Uso de próteses podem reduzir o rendimento NW. Se o voluntário tem um nariz entupido / congestionado ea solução salina está se esgotando anteriormente após a inserção, assoar o nariz, insira a seringa um pouco mais para trás, e inclinar a cabeça para trás mais, se necessário.
O NW é uma técnica que fica melhor com a prática. Algum volume será geralmente perdido para o objectivo é que o retorno de pelo menos 10 ml. Se o voluntário pode saborear fisiológica durante a NW então a conexão entre a nasofaringe e orofaringe posterior não tem sido adequadamente fechado pela língua do voluntário. Se a maioria dos voluntários engole da salina, explicar o procedimento novamente, enfatizando a empurrar a língua contra o céu da boca. Em seguida, repita o procedimento para aumentar o volume retornado.
Se a NW contém uma substantial quantidade de muco, o melhor é removê-lo antes da centrifugação. Vortex a amostra, de modo a soltar qualquer coisa que possa ser ligado ao muco e, em seguida, remover o máximo dos pedaços grandes quanto possível, durante a remoção, como solução salina pouco quanto possível.
Um estudo anterior EHPC nos EUA foi concluída com segurança e sem eventos adversos 11. Para garantir a segurança permanente da plataforma EHPC, temos um conjunto de um protocolo de emergência, que é baseada em torno de acesso 24 horas para a equipe de pesquisa. Voluntários recebem detalhes de contato, permitindo-lhes o acesso à equipe de pesquisa 24 horas por dia. Qualquer assistência médica necessária é fornecida no Royal Liverpool University Hospital. Como medida adicional de proteção, um comitê de segurança composto por médicos e cientistas de fora do grupo de pesquisa recebe um relatório de segurança semanal. O relatório contém a dose bacteriana cada voluntário recebeu e se algum dos sintomas ou doença foram notificados. Este relatório permite a segurança do diaestudo e de ser criticado externamente sem viés. O comitê de segurança também estão disponíveis 24 horas por dia, no caso improvável de uma emergência.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (Grande prêmio Exploração Desafio da SBG), o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde (NIHR), Centro de Pesquisa Biomédica em Doenças Microbianas, eo NIHR Rede de Pesquisa Global Local. Reconhecemos a NWDA de apoio infra-estrutural. Agradecemos ao Prof J. N Weiser, da Universidade da Pensilvânia e Prof P Hermans, da Universidade de Nijmegen para os isolados de pneumococo. Graças ao Comitê de Segurança EHPC por seu apoio e conselho, a todos os nossos voluntários para a sua participação e Mathieu Bangert para tirar as fotos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Fisher | G/0650/08 | |
| 0.9% Sodium Chloride | B. Braun | 3627667 | |
| Skim milk powder | Fluka | 70166 | |
| Tryptone soya broth | Becton Dickinson | 211768 | |
| Glucose | BDH | 284504S | |
| Columbia Agar with chocolated horse blood | Oxoid | PB0124 | |
| Pneumotest-latex kit | Statens Serum Institut | 51823 |
References
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