Summary
ووصف طريقة لقياس طول جمود العاطفة أو استمرار من البوليمرات الحيوية. أسلوب يستخدم كينيسين يحركها مقايسة مزلق أنيبيب تجريبيا لتحديد طول استمرار ميكروتثبول الفردية وقابلة للتكيف مع المقايسات مزلق الأكتين مقرا لها.
Abstract
ميكروتثبول هي البوليمرات هيكل الخلية التي تلعب دورا في انقسام الخلايا، والميكانيكا الخلية، والنقل داخل الخلايا. كل من هذه المهام يتطلب ميكروتثبول التي هي قاسية بما فيه الكفاية وتمتد مباشرة إلى جزء كبير من الإطارات الخلية. ونتيجة لذلك، تم طول استمرار أنيبيب، وهو مقياس لصلابة، ودرس بنشاط على مدى العقدين الماضيين 1. ومع ذلك، تبقى الأسئلة مفتوحة: ميكروتثبول قصيرة هي 10-50 مرات أقل من ميكروتثبول طويلة قاسية 2-4، وميكروتثبول حتى قياس أطوال طويلة والتي تختلف استمرار بأمر من حجم 5-9.
هنا، نقدم طريقة لقياس طول أنيبيب المثابرة. وتستند هذه الطريقة على فحص أنيبيب مزلق كينيسين يحركها 10. من خلال الجمع بين العلامات الفلورية متفرق من ميكروتثبول الفردية مع تتبع جسيم واحد من fluorophores الفردية التي تعلق على أنيبيب، وglidinيتم تعقب مسارات غرام من ميكروتثبول نانومتر واحد مع المستوى من الدقة. طول مسارات استمرار هو نفس طول استمرار أنيبيب وفقا للشروط استخدامها 11. يستخدم روتين تتبع الآلي لخلق مسارات أنيبيب من fluorophores تعلق على ميكروتثبول الفردية، ويتم حساب طول استمرار هذا المسار باستخدام إجراءات مكتوبة في IDL.
هذه التقنية قابلة للتطبيق بسرعة، وقادرة على قياس طول استمرار ميكروتثبول من 100 في يوم واحد من التجريب. ويمكن تمديد طريقة لقياس طول ظل استمرار مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك استمرار طول بوصفها وظيفة من طول الأنابيب الدقيقة جنبا إلى جنب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تمتد إجراءات التحليل المستخدمة لالميوسين القائم على المقايسات مزلق التمثيل، لقياس طول خيوط الأكتين استمرار كذلك.
Introduction
الهيكل الخلوي، وهي شبكة من البوليمرات الحيوية موجودة في الخلايا حقيقية النواة الأكثر، يلعب دورا في تنظيم الخلوية، والنقل داخل الخلايا، والميكانيكا الخلية. الخصائص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية من الهيكل الخلوي (أكتين في المقام الأول وميكروتثبول) تلعب دورا هاما في تحديد الخواص الميكانيكية للخلية كما في 12 كله. منذ ميكانيكا خلية كاملة يمكن أن تميز الخلايا السليمة والمريضة 13،14 وتشارك في الحركة الخلوية 15، وكانت الخواص الميكانيكية للهيكل الخلية الأساسية في مكونات منطقة نشطة للدراسة على مدى العقدين الماضيين 1.
وتتميز بالمرونة (أو تصلب) من البوليمرات الحيوية من طول استمرار، وطول البوليمر الذي ينحني من راديان واحد تقريبا تحت تقلبات الحرارية عند درجة حرارة الغرفة. وقد تم تطوير عدد من التقنيات لقياس طول استمرار 16، لأمثلتقنيات جنيه بالموقع التي تنطوي على الانحناء البوليمر باستخدام تدفق الهيدروديناميكية، والفخاخ البصرية، أو المجالات الكهربائية 4،17،18، وتقنيات قياس السلبي الذي تقلبات البوليمرات الحرة في حل 5،6. القياسات بالموقع، ومع ذلك، تتطلب الاجهزة المتخصصة لتنفيذ القوات المعروفة على مقياس الميكرومتر، وقياسات الحرة تقلب يمكن أن يكون تحديا بسبب نشرها من الطائرة من تركيز المجهر المستخدمة.
في هذه المقالة، ونحن تصف، السلبي التكميلية، تقنية لقياس طول استمرار ميكروتثبول، بوليمر هيكل الخلية. والأسلوب الذي ينطوي المقايسات مزلق، والتي تضمن أن يبقى دائما البوليمر في المستوى البؤري 19. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي fluorophores واحدة تتبع تثبت بصورة دائمة على البوليمر في المصالح، بحيث تتميز كذلك مواقع محددة على طول البوليمر.
ويرد كارتون الأسلوب في الارقام ..ه 1. كينيسين يتحرك على وجه التحديد في أواخر + من الأنابيب الدقيقة، بحيث يتم دفع ميكروتثبول مزلق في مقايسة unidirectionally. نهاية الرائدة في مجال أنيبيب، وراء كينيسين مشاركة المرفقة، حر في أن تتقلب تحت قوات الحرارية من الحل المحيطة بها. كما دفعت أنيبيب إلى الأمام، حتى نهاية يتقلب الربط إلى جزيء جديد كينيسين على امتداد شريحة زجاجية يتجمد في تذبذب معين. لأن تعلق كينيسين ميكروتثبول بقوة، يتم تقييد أنيبيب لمتابعة مسار نهاية الرائدة. ولذلك، فإن التقلبات الإحصائية المجمدة في مسار أنيبيب هي نفس التقلبات الإحصائي للنهاية خالية من الأنابيب الدقيقة 11، وبالتالي يمكن استخدامها لحساب طول استمرار فقا إلى 20
حيث L هو طول ع استمرار أنيبيب، θ s هو الزاوية بين الظلال لمسار مفصولة كفاف ق الطول، و<> يدل على متوسط على كل زوج من المواقف مفصولة كفاف ق الطول.
الفحص مزلق نفسه يستخدم المعقدة البيروكسيديز كينيسين في ال 21 ملفوف لفائف ملزمة على وجه التحديد إلى شريحة زجاجية عن طريق الربط streptavidin-البيوتين. هذا المرفق يضمن أن محرك المجالات أحرار في ربط ودفع ميكروتثبول. من أجل تتبع مسارات أنيبيب، وصفت قليلة ميكروتثبول مع fluorophores العضوية 22،23 - التسميات يجب أن تكون كافية متفرق التي لحل fluorophores واحدة باستخدام جزيء واحد المجهري مضان. يتم تعقب fluorophores واحدة باستخدام إجراءات تحليل الصور مكتوب في IDL. مسارات من كل fluorophore منضم إلى هيئة التصنيع العسكري نظرايتم الجمع بين rotubule في مسار مركب 24 أنيبيب تلقائيا. يتم حساب زوايا الظل θ إلى كل نقطة على طول المسار، ومن هذه الزوايا الظل ويتم احتساب <cosθ سبت> قيمة كل كفاف ق الطول. وأخيرا، وتناسب هذه البيانات إلى المعادلة. (1) بغية انتزاع طول استمرار لأنيبيب معين، أو لميكروتثبول كثيرة في نفس الفحص مزلق.
طريقة قوية بما فيه الكفاية للعمل مع ميكروتثبول أعدت في مجموعة متنوعة واسعة من الظروف (مع مختلف وكلاء استقرار أو الجزيئات الصغيرة الأخرى منضمة إلى أنيبيب، مع البروتينات أنيبيب ملزمة المرتبطة (خرائط)، أو مع مجموعة متنوعة من الحلول لزجة). في المختبر، وقد استخدمت هذه التقنية لوصف طول استمرار ميكروتثبول بوصفها وظيفة من طول على طول الأنابيب الدقيقة والأنابيب الدقيقة مع مختلف وكلاء الاستقرار. تقييد الرئيسي هو أن ميكروتثبول يجب أن لا يزال لياليupport كينيسين الحركة. منذ كينيسين هو انزيم محرك قوي، وهذا هو تقييد فضفاضة إلى حد ما. من خلال استبدال الأنابيب الدقيقة مع الأكتين وكينيسين مع انزيم الأسرة الميوسين، يمكن قياس طول استمرار الأكتين باستخدام نفس التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. أنيبيب الانزلاق الفحص حلول للسهم
إعداد مقايسة قبل مزلق.
- تتبلمر ميكروتثبول 0.5 مغ المسمى قليلة مع fluorophore العضوية مشرق 22. تركيز التسمية الهدف هو 1 ميكرون من fluorophore في أنيبيب، أو وضع العلامات من الكثافة ما يقرب من 1 في fluorophore dimers تويولين 1،500. متجر في ضوء الغرفة، ودرجة الحرارة حماية بورق الألمنيوم لمدة تصل إلى أسبوعين.
- تنقية البيوتين-21 في كينيسين حوالي 1 ميكرومتر. المحل في -80 درجة مئوية في 5 ميكرولتر مأخوذة لاستخدامها في التجارب الفردية.
- إعداد مقايسة المخزن المؤقت (AB) من imidiazole 50 مم، 50 مم كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، و 4 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2)، 2 مم جلايكول الإثيلين tetraacetic حمض (EGTA)، ودرجة الحموضة 6.7. تصفية العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- حل الأبقار مصل الزلال المعقدة البيروكسيديز (البيوتين-BSA) إلى 2 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة.المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- حل streptavidin (SA) إلى 10 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 20 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
- حل α-الكازين إلى 5 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
- حل dithiothreitol (DTT) في الماء منزوع الأيونات في 200 ملم. المحل في -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة.
- حل باكليتاكسيل (PT) في الصف HPLC سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في 4 مم. متجر في 10 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C المدى الطويل، -20 ° C على المدى القصير. استخدام في غضون 8 ساعات من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة.
- حل الجلوكوز في الماء منزوع الأيونات في 120 ملغ / مل. مخزن في 100 ميكرولتر مأخوذة في -20 ° C. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة.
- ديسحل الأدينوساين ثلاثي (ATP) في الماء منزوع الأيونات في 150 مم، 7.0 درجة الحموضة. متجر في 5 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان.
- إعداد الأسهم 100X الأكسجين الكسح 25 بحلول حل 10000 أوكسيديز الجلوكوز وحدات وحدات و156،000 الكاتلاز إلى 600 ميكرولتر العازلة الفحص الإجمالي. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج إلى المواد الصلبة بيليه؛ طاف مرشح مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 10 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. أنيبيب الانزلاق الفحص، ونفس إعداد الحل اليوم
إعداد الحلول في 2،1-2،6 في يوم التجربة. مع الممارسة، يمكن إعداد حلول 2،2-2،6 خلال تدفق خلايا الغسيل. ما لم يذكر خلاف ذلك، والحفاظ على حلول الأسهم على الجليد.
- إعداد AB، 1 مل من العازلة مقايسة مع 10 ميكرولتر من DTT الأسهم (AB مع DTT ملم 2). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الحيوي BSA العازلة، 40 & مو؛ لتر من خليط 1:1 من المخزون البيوتين-BSA وAB. تبقي في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد BSA العازلة، خلط 645 ميكرولتر من AB مع 5.5 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل BSA في AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد SA العازلة، والاختلاط 57 ميكرولتر من AB مع 3 streptavidin الأسهم ميكرولتر (0.5 ملغ / مل في streptavidin AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد α-الكازين العازلة، خلط 200 ميكرولتر من العازلة BSA، و 50 ميكرولتر الأسهم الكازين، و 0.8 ميكرومتر ATP ميكرولتر من 15 (1 ملغ / مل α-الكازين، 0.8 ملغ / مل BSA، و 50 نانومتر في ATP AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد مضان مكافحة التبييض العازلة، والاختلاط 95 ميكرولتر العازلة الكازين-α، 2.5 ميكرولتر الجلوكوز المخزون، 1 ميكرولتر مزيج الأكسجين 100X الكسح، 1 ميكرولتر الأسهم باكليتاكسيل، 1 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (βME). إضافة βME تحت غطاء محرك السيارة الدخان. استخدام مضان مكافحة التبييض عازلة داخل 1 ساعة إعداد تنبيه: βME شديد السمية ورائحة فظيعة. تأكد من فتح فقط تحت غطاء محرك السيارة الدخان. متجر في زجاجةغياب الضوء؛ ضوء يحط βME وقدرتها على خفض photobleaching.
3. أنيبيب الانزلاق الفحص
- بناء الممرات حول تدفق الأربع بين ساترة × 24 مم 60 و 22 × 22 مم باستخدام ساترة الشحوم فراغ، مقذوف من حقنة من خلال تلميح ماصة، كفاصل. يجب أن تكون كل حارة تدفق حوالي 10 ميكرولتر من حيث الحجم (حجم اللاحقة وفقا لذلك النطاق).
- يغسل 10 ميكرولتر من العازلة الحيوي BSA في كل حارة. احتضان 5 دقائق للسماح للBSA معطف السطوح الزجاجية.
- يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا البيوتين-BSA، مع الاستمرار في منع سطح الشريحة. استخدام ورق الترشيح أو Kimwipe لإزالة العازلة من الجانب الآخر من الغرفة تدفق، ويجري التأكد من عدم السماح فقاعات الهواء من خلال الذهاب الى غرفة التدفق.
- غسل ميكرولتر 15 SA-العازلة في كل حارة. الانتظار 10 دقيقة، أو ساعة لتصل إلى 2. فإن streptavidin ربط BSA-البيوتين سطح محدد.
- يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا SA مع الاستمرار في منع سطح الشريحة.
- يغسل كل حارة مع 15-α العازلة ميكرولتر الكازين. α-الكازين يساعد منع مزيد غير محددة ملزمة للكينيسين وميكروتثبول على الزجاج.
- تمييع كينيسين إلى 10 نانومتر في α-الكازين العازلة ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا كينيسين - α-الكازين الحل. الانتظار 15 دقيقة (أو ما يصل إلى ساعة واحدة) لكينيسين المعقدة البيروكسيديز لربط تحديدا إلى streptavidin سطح محدد. والمحرك المجالات كينيسين تظل حرة في ربط الأنابيب الدقيقة.
- تمييع باكليتاكسيل إلى 40 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة α-الكازين العازلة، ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا الحل لتغسل كينيسين الحرة ومسبقا تحميل كل غرفة تدفق بمحلول باكليتاكسيل لمنع ميكروتثبول من depolymerizing. depolymerizes الباردة أيضا ميكروتثبول، لذلك تأكد من هذه الخطوات تحدث في درجة حرارة الغرفة مع غرفة temperatuإعادة الحلول.
- تمييع fluorescently المسمى ميكروتثبول 1:100-1:1،000 في مكافحة التبييض العازلة مضان مع ATP مم 1. غسل ميكرولتر 15 في مسار واحد ونلاحظ في غضون 30 دقيقة.
4. جمع البيانات
- مراقبة مزلق باستخدام المجهر مضان ميكروتثبول؛ مطلوب المجهر قادرة على حل واحد fluorophores مثل الإعداد TIRF تجارية أو بناء منزل-26 (الشكل 2).
وينبغي دفع ميكروتثبول من قبل محركات كينيسين على الركيزة في حوالي 0.5 ميكرون / ثانية، اعتمادا على درجة الحرارة. إذا كان الحقل من رأي من المجهر هو 50 ميكرون، وينبغي أن تكون واضحة ميكروتثبول الفردية لحوالي 100 ثانية. تعيين شدة الإضاءة بحيث fluorophores واحد لا photobleach بسرعة أكبر من 100 ثانية. في حالة استخدام الإثارة الليزر، وهو وضع قوة حوالي 3-5 ميغاواط مناسبا. - جمع متواليات من الصور للتحليل. 600 الصور في5 هرتز (2 إجمالي دقيقة) يعمل بشكل جيد. استخدام تسلسل طويلة بما فيه الكفاية أن ميكروتثبول اجتياز كامل مجال للرؤية.
5. تحليل البيانات
روتين IDL، get_lp.pro يتم إرفاق. هذا الروتين بإرجاع قيمة طول استمرار بناء على كل مزلق ميكروتثبول في تسلسل الصور معين. إما تشغيل هذا الروتين في كل تسلسل الصور، وتعديل المعلمات اعتمادا على شدة الإعداد المجهر معينة، أو القيام بما يلي:
- تتبع كل fluorophore تعلق على أنيبيب لخلق مسارات fluorophore.
- الجمع بين جميع المسارات من fluorophores على أنيبيب نظرا إلى مسار أنيبيب الشاملة؛ تكرار لكل أنيبيب في تسلسل الصور (الشكل 3).
- حساب الزاوية الظل الى كل نقطة على طول المسار (الشكل 4)، وحساب <cos θ سبت> في المعادلة. 1 من المتوسط جيب تمام الزاوية من الفرق لكل زوج من نقاط مفصولة ق مسار بطول (الشكل 5). العثور على طول استمرار لأنيبيب واحد أو مجموعة من الأنابيب الدقيقة من قبل <cos المناسب θ سبت> لالمعادلة. 1، الترجيح نقاط البيانات الفردية في مجال التجهيزات من قبل عدد من القيم مستقلة عن كوس θ ق التي يتم استخدامها لحساب المتوسط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد لقطة من الفحص مزلق في الشكل 2. A الكثافة أنيبيب الجيد هو ميكروتثبول 1-10 في مجال الرؤية؛ حد كبير سوف يؤدي إلى مزيد من mistracking كما ميكروتثبول عبر بعضها البعض. ويرد مؤامرة من مسارات أنيبيب 11 من مقايسة مزلق في الشكل 2 في الشكل 3. مسارات نموذجية من 10 إلى 30 ميكرون طويلة، وبعض المسارات لديها ثغرات واحد حيث يعبر أنيبيب آخر. قد يتم تجاهل هذه المسارات من التحليل.
ويرد واحد، مسار طويل أنيبيب في الشكل 4A مع زوايا الظل سبيل المثال في موقعين على طول مسار. ويرتبط الفرق بين زوايا الظل مفصولة مسافة ثابتة لطول الثبات؛ يظهر زاوية الظل بوصفها وظيفة للموقف على طول مسار أنيبيب في الشكل 4B.
البيانات زاوية الظلمن أنيبيب مسارات عديدة يتم الجمع بين لحساب طول استمرار واحد لجميع ميكروتثبول في تجربة معينة. ويبين الشكل 5 قطعة θ <cos ق ق مقابل> طول كفاف لفحص مزلق من الشكل 2. ككل القيم طول كفاف، يتم قياس القيم قليل جدا من كوس θ، وبالتالي متوسط متغير بدرجة كبيرة. تناسب المرجح يتفق مع ليالي قصيرة، عالية الدقة البيانات على نحو أوثق من ليالي طويلة، وانخفاض الدقة البيانات.
قيمة طول هذه المسارات من استمرار 11، 500 ± 40 ميكرون (± الخطأ المعياري للمتوسط)، هو ممثل أطوال الأنابيب الدقيقة لاستمرار قصيرة نسبيا 2. تجارب مماثلة إعطاء مجموعة من أطوال استمرار ما بين 300 و 1،000 ميكرومتر.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
إذا ميكروتثبول غائبة تماما، increبورصة عمان تركيز ميكروتثبول في الخطوة 3،9 حتي 0،5 ملغ / مل. إذا ميكروتثبول ما زالوا مفقودين، وإعادة تبلمر ميكروتثبول. جعل متأكد من باكليتاكسيل موجود في كل حل يتم تخفيفه إلى ميكروتثبول، وإلا سوف يزيل البلمرة ميكروتثبول.
إذا ميكروتثبول هي نشرها بحرية في حل ولكن ليست ملزمة على السطح، زيادة تركيز كينيسين في الخطوة 3.7 و استخدام AMP-PNP بدلا من ATP لضمان كينيسين يربط ميكروتثبول لا رجعة فيه. إذا ميكروتثبول لا تزال لا تلزم، وجعل جديدة streptavidin الأسهم والعازلة، تليها العازلة البيوتين-BSA الجديد. وأخيرا، تنقية كينيسين المعقدة البيروكسيديز جديدة.
إذا ميكروتثبول ربط ولكن لا تتحرك، ATP استبدال محلول المخزون مع ATP جديدة.
إذا fluorophores photobleach بسرعة كبيرة جدا، والحد من شدة الإضاءة. إذا fluorophores photobleach يزال بسرعة كبيرة جدا، يحل محل نظام الأكسجين الكسح مع الأسهم الجديدة.
إذا fluorophoالدقة هي قاتمة جدا، وزيادة كثافة الإضاءة.
الشكل 1. كارتون للمقايسة مزلق أنيبيب. لا بد على وجه التحديد الانزيمات كينيسين إلى ساترة من الربط البيوتين streptavidin-. وصفت قليلة ميكروتثبول مع fluorophores العضوية. إضافة إلى ATP، يتم دفع الأنابيب الدقيقة من قبل محركات كينيسين. نهاية الرائدة خالية من أنيبيب يتقلب بسبب القوات الحرارية في حل، وتستخدم هذه التقلبات لحساب طول استمرار أنيبيب. طول النطاق من أنيبيب تناقش هذه التجارب هو طول الطرف الحر.
الشكل 2. نموذجي لقطة المجهر لفحص مزلق، اتخذت عبر المجهر TIRF. Microtu زينت قليلة bules مع fluorophores واحد. شريط المقياس 5 ميكرون.
مسارات الرقم أنيبيب 3. من تسلسل الصور هو مبين في الشكل 2. كل مسار يجمع بين العديد من المسارات أنيبيب fluorophore واحد (حوالي 10 في المتوسط)، وقد ضعفت إلى نقطة واحدة لكل 100 نانومتر.
الشكل 4. حساب زوايا الظل الى مسار. (A) مسار واحد أنيبيب، مع زوايا الظل سبيل المثال (θ) مبين. (B) زاوية الظل بوصفها وظيفة للموقف على طول مسار أنيبيب. وتستخدم هذه البيانات لحساب متوسط الزوايا المستخدمة في المعادلة. 1.
الشكل 5. حساب طول استمرار من زوايا الظل. (نقطة) قطعة من ليالي ليالي θ> طول كفاف مقابل <cos للمسارات 11 هو موضح في الشكل 3. (الخط المتواصل) لصالح المعادلة. 1. لهذه المجموعة من الأنابيب الدقيقة، وطول استمرار هو 500 ± 40 ميكرون. لفترات طويلة كفاف (أكثر من 10 ميكرون أو نحو ذلك)، فإن البيانات تختلف اختلافا كبيرا بسبب إحصاءات محدودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قياسات طول استمرار هي توصيف جيد من الخواص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية الفردية. في هذه المقالة، ووصف لنا طريقة لقياس طول استمرار ميكروتثبول. كما لوحظ في المقدمة، ويمتد هذا الأسلوب بسهولة إلى دراسة الخصائص الميكانيكية أنيبيب في مجموعة متنوعة من الظروف ببساطة من خلال تغيير الكواشف، ودرجة الحرارة، أو اللزوجة في الخطوة الأخيرة من الفحص مزلق، 3.9، أو عن طريق بلمرة ميكروتثبول، خطوة 1.1، في ظل ظروف مختلفة.
هذه التقنية نفسها سريعة لتنفيذ. مرة واحدة تم إعداد حلول الأسهم في وقت مبكر (الخطوة 1)، يمكن إجراء فحص تجربة التزلج على الماء في 2-3 ساعة، بما في ذلك ما يصل إلى أربعة اختلافات في الظروف على شريحة المجهر واحدة (أربعة في الممرات الخطوة 3.1). يمكن فحص العديد من الأنابيب الدقيقة في كل تجربة، تجارب نموذجية في المختبر فحص 100 حالة في ميكروتثبول (حوالي sequenc صورة رقم 10وفاق في لين، مع 10 في تسلسل ميكروتثبول). تحليل مجموعات البيانات الكبيرة هو بالمثل سريعة إلى حد ما. مع الممارسة، يمكن تحليل تسلسلات الصور (10) لطول استمرار في فترة بعد الظهر أو نحو ذلك مع PC الحديثة. معدل منظم للخطوة في التحليل هو الوقت المناسب لتتبع fluorophores الفردية، وطرق تتبع أحدث نعد لزيادة هذه السرعة بشكل كبير 27.
لأن الأسلوب ينطوي على تتبع fluorophores واحدة تعلق على أنيبيب معينة، ويقتصر فقط على دقة تتبع من قبل مجموعة فوتون، ويمكن أن تكون على نطاق نانومتر 22 و 25. بما في ذلك البيانات بواسطة من fluorophores كثيرة، زيادة تحسين الدقة. ومن المحتمل أن يتم التوصل إلى الدقة أعلى من ذلك عن طريق ربط الأجسام الفلورسنت مشرق للغاية، مثل نقاط الكم، إلى أنيبيب.
في حين أن المسارات الفردية دقة جيدة جدا، فإن عدم اليقين في استمرار جنيهngths قياس مع هذه التقنية (على مقياس من 50٪ ± لأنيبيب واحد) لا يزال كبيرا. مفتاح القيد في دقة القياسات طول هو استمرار إحصاءات المشاركة في المتوسط كوس θ ق. وطول كفاف بين أزواج من النقاط، s، الزيادات، وعدد من القياسات مستقلة عن θ ق يتناقص مع L / ثانية، حيث L هو طول مسار أنيبيب دراستها. وزيادة طول مسارات أنيبيب تسمح تحسين الدقة في القياسات طول المثابرة.
والقيد الثاني لهذه الطريقة هو شرط المعقدة البيروكسيديز كينيسين-1 يمكن استخدامها لمرفق معين من كينيسين على الشرائح المجهر. يجب تنقية كينيسين المعقدة البيروكسيديز (من كولاي في حالتنا)، ولا يمكن ببساطة يمكن شراؤها من على الرف. ومع ذلك، فإن فحص الأقارب مزلق تعديلها باستخدام unbiotinylatedويمكن استخدام esin 28؛ كينيسين البروتين السلسلة الثقيلة التي قد تكون مناسبة لهذه التقنية متوفرة تجاريا من الهيكل الخلوي (KR01). ومقايسة تعديل مزلق لاستخدام هذا البديل لا يؤثر كينيسين جمود العاطفة أنيبيب بأي شكل من الأشكال، وبالتالي سيمكن الجماعات دون الحصول على البروتين المؤتلف كينيسين لاستخدام هذا الأسلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
Acknowledgments
نشكر ميليسا Klocke للحصول على المساعدة وإعداد الشكل 1 راتليف آنا لبيان البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل هيئة البحوث للتقدم العلوم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
