Summary
Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.
Abstract
I microtubuli sono polimeri del citoscheletro che svolgono un ruolo nella divisione cellulare, cellulari, meccanica e mezzi di trasporto intracellulare. Ciascuna di queste funzioni richiede microtubuli che sono rigidi e dritti abbastanza per occupare una frazione significativa del diametro della cellula. Come risultato, la lunghezza di persistenza microtubuli, una misura della rigidità, è attivamente studiati negli ultimi due decenni 1. Tuttavia, restano questioni aperte: microtubuli brevi sono 10-50 volte meno rigido rispetto microtubuli lunghi 2-4, e anche lungo i microtubuli hanno misurato lunghezze persistenza che variano da un ordine di grandezza 5-9.
Qui, vi presentiamo un metodo per misurare la persistenza lunghezza microtubuli. Il metodo si basa su un saggio microtubuli chinesina-driven scorrimento 10. Grazie alla combinazione di scarsa marcatura fluorescente dei microtubuli singoli con servizio di monitoraggio singola particella di fluorofori singoli collegati al microtubulo, il Glidintraiettorie g di microtubuli singoli vengono tracciati con precisione a livello di nanometri. La lunghezza di persistenza delle traiettorie è uguale alla lunghezza di persistenza del microtubulo nelle condizioni utilizzate 11. Una routine di rilevamento automatico viene utilizzato per creare traiettorie microtubuli da fluorofori collegati microtubuli singoli, e la lunghezza di persistenza di tale traiettoria è calcolata utilizzando routine scritte in IDL.
Questa tecnica è attuabile rapidamente, e in grado di misurare la lunghezza di persistenza di 100 microtubuli in un giorno di sperimentazione. Il metodo può essere esteso per misurare la lunghezza di persistenza sotto una varietà di condizioni, tra lunghezza di persistenza in funzione della lunghezza lungo i microtubuli. Inoltre, le routine di analisi utilizzate può essere esteso a miosina basati azione saggi scorrimento, per misurare la lunghezza di persistenza dei filamenti di actina pure.
Introduction
Il citoscheletro, una rete di biopolimeri presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche, svolge un ruolo nella organizzazione cellulare, trasporto intracellulare, e meccanica delle cellule. Le caratteristiche meccaniche dei biopolimeri del citoscheletro (principalmente actina e microtubuli) svolgono un ruolo significativo nel determinare le caratteristiche meccaniche della cellula nel suo complesso 12. Poiché meccanica cellule intere possono caratterizzare cellule sane e malate 13,14 ed è coinvolto nella motilità cellulare 15, le proprietà meccaniche dei componenti citoscheletrici sottostanti sono un'area attiva di studio per gli ultimi due decenni 1.
La flessibilità (o rigidità) di biopolimeri è caratterizzato dalla lunghezza di persistenza, la lunghezza del polimero che si piega per circa un radianti sotto fluttuazioni termiche a temperatura ambiente. Un certo numero di tecniche sono state sviluppate per misurare la lunghezza di persistenza 16, per exampLe tecniche attive che coinvolgono piegare il polimero attraverso il flusso idrodinamico, trappole ottiche, o campi elettrici 4,17,18, e tecniche passive che misurano le fluttuazioni di polimeri libere in soluzione 5,6. Le misurazioni attivi, tuttavia, richiedono configurazioni specializzate per implementare forze note sulla scala del micrometro, e le misurazioni di fluttuazione libera può essere difficile a causa della diffusione di piano focale del microscopio utilizzato.
In questo articolo, si descrive un complementare, passiva, tecnica per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli, un polimero del citoscheletro. La tecnica prevede saggi volo a vela, che assicurano che il polimero rimane sempre nel piano focale 19. Inoltre, esso comporta il rilevamento fluorofori singoli collegati in modo permanente al polimero di interesse, in modo che punti specifici lungo il polimero sono ben caratterizzati.
Un cartone animato del metodo è illustrato nella Figure 1. Kinesina si muove in particolare verso la fine + di microtubuli, in modo che i microtubuli in un test di volo a vela sono spinti unidirezionale. L'estremità anteriore del microtubulo, oltre l'ultima chinesina collegato, è libero di fluttuare sotto le forze termici della soluzione circostante. Come il microtubulo viene spinto in avanti, fino alla fine oscilla legarsi a una molecola chinesina nuovo più avanti lungo il vetrino si congela in una fluttuazione dato. Poiché chinesina attribuisce microtubuli fortemente, la microtubuli è costretto a seguire il percorso della estremità anteriore. Pertanto, le fluttuazioni statistiche congelati nella traiettoria microtubuli sono le stesse delle fluttuazioni statistiche della estremità libera 11 microtubuli, e può quindi essere utilizzata per calcolare la lunghezza di persistenza secondo 20
dove L è la lunghezza p persistenza del microtubulo, s θ è l'angolo tra tangenti alla traiettoria separate da una lunghezza s contorno, e <> indica una media di tutte le coppie di posizioni separate da una lunghezza s contorno.
Il saggio di scorrimento si utilizza chinesina biotinilato al coiled-coil 21 legato specificamente al vetrino tramite una streptavidina-biotina linkage. Questo accessorio assicura che i domini motore sono liberi di legarsi ai microtubuli e spingere. Al fine di seguire traiettorie microtubuli, microtubuli sono scarsamente etichettati con fluorofori organici 22,23 - le etichette devono essere sparso abbastanza fluorofori singoli sono risolvibili utilizzando singola molecola microscopia a fluorescenza. Fluorofori singole sono monitorati tramite routine di analisi di immagini scritte in IDL. Le traiettorie di ciascun fluoroforo legato ad un determinato microfonorotubule sono combinati in una traiettoria microtubulo automaticamente composito 24. Gli angoli θ tangente ad ogni punto lungo una traiettoria vengono calcolati; da questi angoli tangenti l'<cosθ s> valore viene calcolato per ogni s lunghezza dei contorni. Infine, questi dati sono idonei a Eq. 1 in modo da estrarre una lunghezza di persistenza per un determinato microtubulo, o per molti microtubuli nello stesso dosaggio scorrimento.
Il metodo è abbastanza robusta per lavorare con microtubuli preparati in una varietà di condizioni (con differenti agenti stabilizzanti o altre piccole molecole legate al microtubulo, con proteine legate associati microtubuli (MAP), o con una varietà di soluzioni viscose). Nel nostro laboratorio, la tecnica è stata utilizzata per caratterizzare la lunghezza di persistenza dei microtubuli in funzione della lunghezza lungo i microtubuli ei microtubuli con diversi agenti stabilizzanti. La limitazione principale è che i microtubuli devono ancora sOSTEGNO chinesina motilità. Poiché chinesina è un enzima motore robusto, questa è una restrizione abbastanza sciolto. Sostituendo con actina e microtubuli chinesina con un enzima famiglia miosina, la lunghezza di persistenza di actina può essere misurata utilizzando la stessa tecnica.
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Protocol
1. Microtubuli Gliding scorta di saggio Solutions
Preparare in anticipo dosaggio volo a vela.
- Polimerizzare microtubuli 0,5 mg scarsamente etichettati con brillante organico fluoroforo 22. La concentrazione etichetta di destinazione è 1 fluoroforo per micrometro di microtubuli, etichettatura o una densità di circa 1 fluoroforo per 1.500 dimeri di tubulina. Conservare a temperatura ambiente, la luce protetta con alluminio, pellicola per un massimo di due settimane.
- Purificare biotina-chinesina 21 a circa 1 pM. Conservare a -80 ° C in aliquote di 5 microlitri per uso in esperimenti singoli.
- Preparare il tampone di saggio (AB) di 50 imidiazole mM, 50 mM di cloruro di potassio (KCl), 4 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2), 2 mM di etilene glicole tetraacetico (EGTA), pH 6,7. Filtro sterile e conservare a 4 ° C.
- Sciogliere biotinilato albumina di siero bovino (biotina-BSA) a 2 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa.Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 microlitri per lunghi periodi, a 4 ° C per un mese.
- Sciogliere streptavidina (SA) a 10 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in 20 aliquote pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane.
- Sciogliere α-caseina a 5 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane.
- Sciogliere ditiotreitolo (DTT) in acqua deionizzata a 200 mM. Conservare a -20 ° C in aliquote di 100 pl, da usare entro 8 ore di scongelamento. Può essere ricongelato.
- Sciogliere paclitaxel (PT) in grado HPLC dimetilsolfossido (DMSO) a 4 mM. Conservare in aliquote da 10 pl a -80 ° C lungo termine, -20 ° C a breve termine. Utilizzare entro 8 ore dallo scongelamento. Può essere ricongelato.
- Sciogliere il glucosio in acqua deionizzata a 120 mg / ml. Conservare in aliquote di 100 pl a -20 ° C. Può essere ricongelato.
- Disrisolvere adenosina trifosfato (ATP) in acqua deionizzata a 150 mM, pH 7,0. Conservare in aliquote di 5 pl a -80 ° C, da usare entro 8 ore di scongelamento.
- Preparare 100x magazzino l'assorbimento di ossigeno 25, sciogliendo 10.000 unità di glucosio ossidasi e catalasi 156.000 unità in 600 microlitri di buffer totale del saggio. Centrifugare brevemente in una microcentrifuga per far sedimentare i solidi; sopranatante filtro con filtro 0,2 micron siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote da 10 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per una settimana.
2. Microtubuli Gliding Assay, in giornata Soluzione Preparazione
Preparare le soluzioni in 2,1-2,6 il giorno dell'esperimento. Con la pratica, le soluzioni 2,2-2,6 può essere preparato durante la cella a flusso di lavaggio. Se non diversamente specificato, mantenere le soluzioni di archivi su ghiaccio.
- Preparare AB, 1 ml di tampone con 10 ml di DTT magazzino (AB con 2 mM DTT). Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare bio-BSA, 40 e mu, L di una miscela 1:1 di biotina-BSA magazzino e AB. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare tampone BSA, mescolando 645 ml di AB 5,5 microlitri con BSA (1 mg / ml di BSA in AB). Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare tampone SA, mescolando 57 ml di AB con 3 stock microlitri streptavidina (0,5 mg / ml di streptavidina in AB). Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare α-caseina buffer, mescolando 200 ml di BSA, 50 microlitri archivio di caseina, e 0,8 pl di ATP 15 mM (1 mg / ml α-caseina, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare fluorescenza anti-candeggina tampone, mescolando 95 microlitri α-caseina tampone, 2,5 microlitri archivio di glucosio, 1 mix microlitri ossigeno 100x scavenging, 1 stock paclitaxel pl, 1 ml 2-mercaptoetanolo (βME). Aggiungi βME sotto cappa d'aspirazione. Utilizzare fluorescenza anti-candeggina buffer entro 1 ora di preparazione. ATTENZIONE: βME è altamente tossico e odori terribili. Assicurarsi di aprire solo sotto la cappa aspirante. Conservare nella bottigliaassenza di luce, la luce degrada βME e la sua capacità di ridurre photobleaching.
3. Microtubuli Gliding Assay
- Costruire circa quattro corsie di flusso tra un x 24 60 coprioggetto mm e 22 x 22 mm con l'utilizzo coprioggetto grasso per vuoto, estrusi da una siringa attraverso un puntale, come un distanziatore. Ogni corsia flusso deve essere di circa 10 microlitri di volume (scala volumi successivi di conseguenza).
- Lavare 10 pl di bio-BSA buffer in ogni corsia. Incubare 5 min per permettere BSA per rivestire le superfici di vetro.
- Lavare ogni corsia tre volte con 15 microlitri tampone BSA per rimuovere libera biotina-BSA, pur continuando a bloccare la superficie di scorrimento. Utilizzare un Kimwipe o carta da filtro per rimuovere il tampone dal lato opposto della camera di flusso, assicurandosi di non lasciare bolle d'aria di passare attraverso la camera di flusso.
- Lavare 15 microlitri SA-buffer in ogni corsia. Attendere 10 minuti, o fino a 2 ore. La streptavidina si legano alla superficie è legato biotina-BSA.
- Lavare ogni corsia per tre volte con 15 microlitri di buffer BSA per rimuovere libero SA, pur continuando a bloccare la superficie del vetrino.
- Lavare ogni corsia con 15 microlitri α-caseina buffer. α-caseina aiuta ulteriormente bloccare il legame non specifico di chinesina e microtubuli al vetro.
- Diluire chinesina a 10 nM in α-caseina tampone e lavare ogni corsia con 15 pl di questo chinesina - α-caseina soluzione. Attendere 15 minuti (o fino ad un'ora) per la cinesina biotinilato di legarsi specificamente alla superficie è legato il streptavidina. I domini motore chinesina resteranno liberi di microtubuli si legano.
- Diluire paclitaxel a 40 pM a temperatura ambiente α-caseina tampone, e lavare ogni corsia con 15 pl di questa soluzione per lavare chinesina libero e per pre-caricare ogni camera di flusso con una soluzione di paclitaxel per impedire microtubuli dai depolimerizzante. Freddo depolimerizza anche microtubuli, in modo da assicurarsi che questi passaggi avvengono a temperatura ambiente con temperature ambienteri soluzioni.
- Diluire il marcato in modo fluorescente microtubuli 1:100-1:1,000 della fluorescenza anti-candeggina buffer con 1 mM ATP. Lavare 15 microlitri in una corsia ed osservare entro 30 min.
4. Raccolta dei dati
- Osservare il volo a vela microtubuli mediante microscopia a fluorescenza, un microscopio in grado di risolvere fluorofori singoli come un setup commerciale o casa-build TIRF è richiesto 26 (Figura 2).
I microtubuli devono essere azionati da motori chinesina sul substrato a circa 0,5 micron / s, a seconda della temperatura. Se il campo di vista del microscopio è 50 pm, microtubuli singoli dovrebbero essere visibili per circa 100 sec. Impostare l'intensità di illuminazione in modo che singoli fluorofori non fotosbiancante più velocemente di 100 sec. Se si utilizza eccitazione laser, un livello di potenza di circa 3-5 mW è appropriato. - Raccogliere sequenze di immagini per l'analisi. 600 immagini a5 Hz (2 totale min) funziona bene. Utilizzare sequenze abbastanza a lungo microtubuli che attraversano l'intero campo di vista.
5. Analisi dei dati
Una routine IDL, get_lp.pro , è allegato. Questa routine restituisce un valore di lunghezza di persistenza sulla base di tutte planata microtubuli in una sequenza data immagine. O eseguire questa routine su ogni sequenza di immagini, modificare i parametri di intensità a seconda della configurazione del microscopio particolare, o di effettuare le seguenti operazioni:
- Traccia ogni fluoroforo collegato a un microtubulo per creare traiettorie fluorofori.
- Combinare tutte le traiettorie di fluorofori su un microtubulo data in una traiettoria complessiva microtubuli; ripetere per ogni microtubule nella sequenza di immagini (Figura 3).
- Calcolare l'angolo tangente ad ogni punto lungo la traiettoria (Figura 4), E calcolare <cos θ s> nell'eq. 1 mediando il coseno della differenza di angolo per ogni coppia di punti separati da un percorso di lunghezza s (Figura 5). Trovare la lunghezza di persistenza di un microtubulo o un gruppo di microtubuli <cos montaggio θ s> a Eq. 1, ponderazione singoli punti dati nella forma per il numero di valori indipendenti di cos θ s che sono utilizzati per calcolare la media.
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Representative Results
Un'istantanea da un saggio scorrimento è mostrato in Figura 2. Una buona densità microtubuli è microtubuli 1-10 per campo; sostanzialmente più provocherà sbandamento come microtubuli incrociano. Un grafico delle traiettorie 11 microtubuli del dosaggio scorrimento in figura 2 è mostrato in Figura 3. Traiettorie tipiche sono 10-30 micron di lunghezza, alcune traiettorie presentano spazi vuoti dove si incrocia un altro microtubuli. Tali traiettorie possono essere scartati dall'analisi.
Una singola traiettoria lungo microtubuli è mostrato in Figura 4A con angoli tangenti esempio a due posizioni lungo la traiettoria. La differenza tra gli angoli tangenti separati da una distanza fissa è legata alla lunghezza persistenza; l'angolo tangente in funzione della posizione lungo la traiettoria microtubulo è mostrato nella Figura 4B.
I dati di angolo tangentedalle traiettorie microtubuli molti è combinato per calcolare una sola lunghezza di persistenza per tutti microtubuli in un dato esperimento. Figura 5 mostra un diagramma di <cos θ s> s rispetto alla lunghezza del profilo per il dosaggio scorrimento della figura 2. A grandi valori di lunghezza del profilo, valori molto pochi cos θ sono misurati, da cui la media è molto variabile. La misura ponderata conforme al s breve, ad alta precisione dei dati più da vicino rispetto alla s lunga, bassa precisione dei dati.
Il valore della lunghezza di persistenza da queste traiettorie 11, 500 ± 40 micron (± errore standard della media), rappresentativa della persistenza di microtubuli lunghezze relativamente brevi 2. Esperimenti simili danno una gamma di lunghezze di persistenza tra 300 e 1.000 micron.
Risoluzione dei problemi
Se microtubuli sono completamente assenti, incrementiASE la concentrazione dei microtubuli nel passaggio 3,9-0,5 mg / ml. Se microtubuli sono ancora mancanti, ri-polimerizzano microtubuli. Assicurarsi paclitaxel che è presente in ogni soluzione microtubuli sono diluiti in, in caso contrario si depolimerizzano microtubuli.
Se microtubuli sono liberamente diffondendo in soluzione ma non vincolante alla superficie, aumentare la concentrazione chinesina al punto 3.7 e utilizzare AMP-PNP invece di ATP per garantire chinesina microtubuli si lega in maniera irreversibile. Se microtubuli ancora non impegnano in alcun modo, fanno nuove azioni streptavidina e buffer, seguito da nuovi biotina-BSA buffer. Infine, purificare nuovo chinesina biotinilato.
Se microtubuli si legano, ma non spostare, sostituire soluzione stock ATP con fresco ATP.
Se fluorofori fotosbiancante troppo in fretta, ridurre l'intensità di illuminazione. Se fluorofori ancora fotosbiancante troppo velocemente, sostituire il sistema di assorbimento dell'ossigeno con nuovo ceppo.
Se fluorophores sono troppo debole, aumentare l'intensità di illuminazione.
Figura 1. Cartoon del saggio microtubuli volo a vela. Enzimi chinesina sono specificamente legato ad un vetrino da un legame biotina-streptavidina. I microtubuli sono scarsamente etichettati con fluorofori organici. Dopo aggiunta di ATP, microtubuli sono spinti dai motori chinesina. L'estremità anteriore libera del microtubulo fluttua a causa di forze termiche in soluzione; queste fluttuazioni sono utilizzati per calcolare la lunghezza di persistenza microtubuli. La lunghezza scala del microtubulo sondate da questi esperimenti è la lunghezza dell'estremità libera.
Figura 2. Istantanea microscopio tipica di un saggio di volo a vela, preso tramite microscopia TIRF. Microtu bules sono scarsamente decorate con fluorofori singoli. Barra di scala è di 5 micron.
Figura 3. Traiettorie microtubuli dalla sequenza di immagine mostrato in Figura 2. Ogni traiettoria microtubuli combina molte traiettorie fluorofori singole (circa 10 in media), e sono stati diluiti in un punto per 100 nm.
Figura 4. Calcolo degli angoli tangenti ad una traiettoria. (A) Traiettoria di un microtubulo, con angoli esempio tangenti (θ) indicate. (B) angolo tangente in funzione della posizione lungo la traiettoria microtubuli. Questi dati vengono utilizzati per calcolare gli angoli medi utilizzati in Eq. 1.
Figura 5. Calcolo lunghezza di persistenza da angolazioni tangenti. (Puntini) Plot di <cos θ s> s rispetto alla lunghezza del profilo per le traiettorie 11 mostrati nella Figura 3. (Linea continua) Adatta alla Eq. 1. Per questo gruppo di microtubuli, la lunghezza di persistenza è di 500 ± 40 um. Per lunghezze di contorno lunghi (superiori a 10 micron o giù di lì), i dati sono molto variabili a causa di statistiche limitate.
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Discussion
Misure di lunghezza persistenza sono una buona caratterizzazione delle proprietà meccaniche dei biopolimeri singoli. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli. Come detto nell'introduzione, questo metodo è facilmente esteso ad esaminare le proprietà meccaniche microtubuli in una varietà di condizioni semplicemente variando i reagenti, temperatura o viscosità nella fase finale del saggio planata, 3,9, o da microtubuli polimerizzanti, passo 1,1, in condizioni diverse.
La stessa tecnica è veloce da eseguire. Una volta soluzioni madre sono state preparate in anticipo (step 1), un esperimento dosaggio scorrimento può essere eseguito in 2-3 ore, compresi fino a quattro variazioni delle condizioni su un vetrino da microscopio singolo (i quattro corsie in fase 3.1). Microtubuli Molti possono essere esaminate in ogni esperimento, esperimenti tipici nel nostro laboratorio esaminare 100 microtubuli per condizione (circa 10 sequenziazione immaginees per corsia, con 10 microtubuli per sequenza). L'analisi di grandi insiemi di dati è anche abbastanza veloce. Con la pratica, 10 sequenze di immagini possono essere analizzati per la lunghezza di persistenza in un pomeriggio o giù di lì con un PC moderno. Il fattore limitante per l'analisi è il momento di tracciare fluorofori individuali, metodi di monitoraggio più recenti promettono di aumentare questa velocità sostanzialmente 27.
Poiché il metodo comporta il rilevamento fluorofori singolo connesso ad un microtubulo dato, la precisione di rilevamento è limitata soltanto da collezione fotone, e può essere sulla scala dei nanometri 22, 25. Includendo dati da molti fluorofori, la precisione è ulteriormente migliorata. Potenzialmente, una precisione ancora maggiore potrebbe essere raggiunto fissando oggetti fluorescenti molto luminosi, quali punti quantici, per il microtubulo.
Mentre la precisione dei percorsi individuali è abbastanza buona, l'incertezza nella persistenza lengths misurati con questa tecnica (sulla scala di ± 50% per un singolo microtubulo) è ancora significativo. La limitazione fondamentale nella precisione delle misure della lunghezza di persistenza sono le statistiche coinvolte nella media cos θ s. Poiché la lunghezza del profilo tra coppie di punti, s, aumenta, il numero di misure indipendenti di θ s diminuisce L / s, dove L è la lunghezza della traiettoria microtubuli studiato. Aumentando la lunghezza delle traiettorie microtubuli consentirebbe una migliore precisione nella misura della lunghezza di persistenza.
Una seconda limitazione di questo metodo è il requisito che chinesina-1 biotinilato essere utilizzato per il fissaggio specifico di chinesina di vetrini da microscopio. Chinesina biotinilato deve essere purificato (da E. Coli nel nostro caso), e non può essere semplicemente acquistato dallo scaffale. Tuttavia, un dosaggio modificato volo a vela con parenti unbiotinylatedesin possono essere utilizzati 28; proteine chinesina catena pesante che potrebbe essere adatto per questa tecnica è commercialmente disponibile da Cytoskeleton (KR01). Modifica del saggio di scorrimento per usare questo chinesina alternativo non inciderebbe rigidezza flessionale microtubuli in alcun modo, e sarebbe quindi consentire ai gruppi che non hanno accesso alla proteina ricombinante chinesina per utilizzare questo metodo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Melissa Klocke per l'assistenza preparare la figura 1 e Anna Ratliff per dimostrare il protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal Research Corporation per il Progresso della Scienza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
