Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Sommario

Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

Abstract

I microtubuli sono polimeri del citoscheletro che svolgono un ruolo nella divisione cellulare, cellulari, meccanica e mezzi di trasporto intracellulare. Ciascuna di queste funzioni richiede microtubuli che sono rigidi e dritti abbastanza per occupare una frazione significativa del diametro della cellula. Come risultato, la lunghezza di persistenza microtubuli, una misura della rigidità, è attivamente studiati negli ultimi due decenni ^1. Tuttavia, restano questioni aperte: microtubuli brevi sono 10-50 volte meno rigido rispetto microtubuli lunghi ^2-4, e anche lungo i microtubuli hanno misurato lunghezze persistenza che variano da un ordine di grandezza ^5-9.

Qui, vi presentiamo un metodo per misurare la persistenza lunghezza microtubuli. Il metodo si basa su un saggio microtubuli chinesina-driven scorrimento ^10. Grazie alla combinazione di scarsa marcatura fluorescente dei microtubuli singoli con servizio di monitoraggio singola particella di fluorofori singoli collegati al microtubulo, il Glidintraiettorie g di microtubuli singoli vengono tracciati con precisione a livello di nanometri. La lunghezza di persistenza delle traiettorie è uguale alla lunghezza di persistenza del microtubulo nelle condizioni utilizzate ^11. Una routine di rilevamento automatico viene utilizzato per creare traiettorie microtubuli da fluorofori collegati microtubuli singoli, e la lunghezza di persistenza di tale traiettoria è calcolata utilizzando routine scritte in IDL.

Questa tecnica è attuabile rapidamente, e in grado di misurare la lunghezza di persistenza di 100 microtubuli in un giorno di sperimentazione. Il metodo può essere esteso per misurare la lunghezza di persistenza sotto una varietà di condizioni, tra lunghezza di persistenza in funzione della lunghezza lungo i microtubuli. Inoltre, le routine di analisi utilizzate può essere esteso a miosina basati azione saggi scorrimento, per misurare la lunghezza di persistenza dei filamenti di actina pure.

Introduzione

Il citoscheletro, una rete di biopolimeri presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche, svolge un ruolo nella organizzazione cellulare, trasporto intracellulare, e meccanica delle cellule. Le caratteristiche meccaniche dei biopolimeri del citoscheletro (principalmente actina e microtubuli) svolgono un ruolo significativo nel determinare le caratteristiche meccaniche della cellula nel suo complesso ^12. Poiché meccanica cellule intere possono caratterizzare cellule sane e malate ^13,14 ed è coinvolto nella motilità cellulare ^15, le proprietà meccaniche dei componenti citoscheletrici sottostanti sono un'area attiva di studi....

Protocollo

1. Microtubuli Gliding scorta di saggio Solutions

Preparare in anticipo dosaggio volo a vela.

1. Polimerizzare microtubuli 0,5 mg scarsamente etichettati con brillante organico fluoroforo ^22. La concentrazione etichetta di destinazione è 1 fluoroforo per micrometro di microtubuli, etichettatura o una densità di circa 1 fluoroforo per 1.500 dimeri di tubulina. Conservare a temperatura ambiente, la luce protetta con alluminio, pellicola per un massimo di due settimane.
2. Purificare biotina-chinesina ²¹ a circa 1 pM. Conservare a -80 ° C in aliquote di 5 microlitri per uso in esperimenti singoli.

Risultati

Un'istantanea da un saggio scorrimento è mostrato in Figura 2. Una buona densità microtubuli è microtubuli 1-10 per campo; sostanzialmente più provocherà sbandamento come microtubuli incrociano. Un grafico delle traiettorie 11 microtubuli del dosaggio scorrimento in figura 2 è mostrato in Figura 3. Traiettorie tipiche sono 10-30 micron di lunghezza, alcune traiettorie presentano spazi vuoti dove si incrocia un altro microtubuli. Tali traiettorie possono essere scart.......

Discussione

Misure di lunghezza persistenza sono una buona caratterizzazione delle proprietà meccaniche dei biopolimeri singoli. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli. Come detto nell'introduzione, questo metodo è facilmente esteso ad esaminare le proprietà meccaniche microtubuli in una varietà di condizioni semplicemente variando i reagenti, temperatura o viscosità nella fase finale del saggio planata, 3,9, o da microtubuli polimerizzanti, passo 1,1, in condizi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Imidazolo	Sigma-Aldrich	I2399
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9541
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Biotinilato BSA	Thermo Scientific	29130
Α-caseina	Sigma-Aldrich	C6780
Streptavidina	Thermo Scientific	21125
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	D0632
Paclitaxel	LC Laboratori	P-9600
Glucosio ossidasi	Sigma-Aldrich	G2133
Catalasi	Sigma-Aldrich	C100
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Acquista piccola quantità.
24x60 mm N ° 1 1/2 bicchiere di copertura	VWR	48393-252
22X22 mm N ° 1 bicchiere di copertura	Gold Seal	3306
Grasso per alto vuoto	Dow-Corning	NA
Attrezzatura
TIRF microscopio	Molti	NA	Il microscopio TIRF utilizzato in questo metodo è stato fatto in casa.
IDL (software)	Exelis	NA	Potrebbe sostituire MATLAB, ImageJ, o altri software di analisi dell'immagine.