Summary
En metod för att mäta längden persistens eller böjstyvhet av biopolymerer beskrivs. Metoden använder en kinesin driven mikrotubulus Gliding analys för experimentellt bestämma persistens längden av individuella mikrotubuli och är anpassningsbar till aktin-baserade glidande analyser.
Abstract
Mikrotubuli är cytoskelettala polymerer som spelar en roll vid celldelning, mekanik cell och intracellulär transport. Var och en av dessa funktioner kräver mikrotubuli som är hård och raka nog för att spänna en betydande del av cellens diameter. Som ett resultat av detta har mikrotubuli uthållighet längd, ett mått på styvhet, har studerats under de senaste två decennierna 1. Trots öppna frågor återstår: korta mikrotubuli är 10-50 gånger mindre stel än långa mikrotubuli 2-4, och även långa mikrotubuli har mätt uthållighet längder som varierar med en storleksordning 5-9.
Här presenterar vi en metod för att mäta längd mikrotubuli uthållighet. Metoden är baserad på en kinesin driven mikrotubulus segelflygning analys 10. Genom att kombinera gles fluorescerande märkning av enskilda mikrotubuli med enstaka partikel spårning av enskilda fluoroforer anslutna till mikrotubuli, den gliding banor av enstaka mikrotubuli spåras med nanometer-nivå precision. Den persistens längd banorna är samma som det fortfarande längden av mikrotubulus under de förhållanden som används 11. En automatiserad spårning rutin används för att skapa banor mikrotubuli från fluoroforer bundna till enskilda mikrotubuli, och ihållande längden av denna bana beräknas med rutiner skrivna i IDL.
Denna teknik är snabbt genomförbar, och kan mäta det fortfarande längd av 100 mikrotubuli i en dag av experimenterande. Metoden kan utsträckas för att mäta persistens längd under en mångfald tillstånd, inklusive persistens längd som en funktion av längden utmed mikrotubuli. Dessutom kan analysen använda rutiner utökas till myosin-baserade verkande glider analyser för att mäta bestående längd aktin filament också.
Introduction
Cytoskelettet, ett nätverk av biopolymerer som finns i de flesta eukaryota celler, spelar en roll vid cellulär organisation, intracellulär transport, och mekanik cell. De mekaniska egenskaperna hos biopolymerer i cytoskelettet (primärt aktin och mikrotubuli) spelar en betydande roll vid bestämning av mekaniska egenskaper hos cellen som helhet 12. Eftersom hela celler mekanik kan karakterisera friska och sjuka celler 13,14 och är involverad i cellulär motilitet 15, har de mekaniska egenskaperna för de underliggande cytoskelettala komponenterna varit en aktiv område av studien under de senaste två decennierna 1.
Flexibilitet (eller styvhet) av biopolymerer kännetecknas av ihållande längd, längden av polymer som böjer av ungefär en radian enligt termiska fluktuationer vid omgivande temperatur. Ett antal tekniker har utvecklats för att mäta persistens längd 16, för exemle aktiva tekniker som innebär att böja polymeren med hydrodynamiskt flöde, optiska fällor eller elektriska fält 4,17,18 och passiva tekniker som mäter svängningarna av fria polymerer i lösning 5,6. De aktiva mätningar kräver dock speciella inställningar för att genomföra kända krafter på mikrometerskala och fria variationer mätningar kan vara en utmaning på grund av diffusion ut ur planet i fokus för den använda mikroskop.
I den här artikeln beskriver vi en kompletterande, passiv, teknik att mäta bestående längden av mikrotubuli, en cytoskelett polymer. Tekniken innebär att glidande analyser som garanterar att polymeren alltid kvar i fokalplanet 19. Dessutom handlar det om spårning enstaka fluoroforer fästa permanent till polymeren av intresse, så att specifika platser längs polymeren väl karakteriserade.
En tecknad av förfarandet visas i Figure 1. Kinesin flyttar specifikt mot + slutet av mikrotubuli, så mikrotubuli i en glidande analys drivs enkelriktat. Den främre änden av mikrotubuli, utöver fast förra kinesin, är fri att fluktuera under termiska krafter den omgivande lösningen. Då mikrotubuli drivs framåt, varierar slutet tills bindning till en ny kinesin molekyl vidare längs glasskiva fryser i en given variation. Eftersom kinesin fäster mikrotubuli mycket starkt är mikrotubuli tvingas att följa den väg den främre änden. Därför, de statistiska fluktuationerna frysta i mikrotubulus bana är desamma som de statistiska fluktuationerna i den fria änden av mikrotubuli 11, och kan därför användas för att beräkna den ihållande längd enligt 20
där l p är det fortfarande längd mikrotubuli är θ s vinkeln mellan tangenterna till banan åtskilda av en kontur längd s och <> betecknar ett genomsnitt över alla par positioner åtskilda av en kontur längd är.
Den glidande analysen själv använder kinesin biotinylerades vid upprullad spiral-21 specifikt bunden till objektglaset genom ett streptavidin-biotin-bindning. Denna fastsättning säkerställer att motorns domänerna är fritt att binda till och driva mikrotubuli. För att följa mikrotubuli banor är mikrotubuli glest märkta med organiska fluoroforer 22,23 - etiketterna skall vara gles nog att enstaka fluoroforer är upplösningen med enkel mikroskopi molekyl fluorescens. Enstaka fluoroforer spåras med hjälp rutiner bildanalys skrivna i IDL. Banorna för varje fluorofor bunden till en viss mikrofonrotubule kombineras till en sammansatt mikrotubuli bana automatiskt 24. Tangenten vinklar θ för varje punkt längs en bana beräknas, från dessa tangent vinklar <cos s> beräknas för varje kontur längd är. Slutligen är dessa data som passar till Ekv. 1 i syfte att extrahera en persistens längd för en given mikrotubuli, eller för många mikrotubuli i samma glidande analys.
Metoden är tillräckligt robust för att arbeta med mikrotubuli framställda i en mängd olika tillstånd (med olika stabiliseringsmedel eller andra små molekyler bundna till mikrotubuli, med bundna tillhörande mikrotubuli proteiner (MAP), eller med en mängd av viskösa lösningar). I vårt labb, har tekniken använts för att karakterisera det fortfarande längden av mikrotubuli som en funktion av längden längs mikrotubuli och mikrotubuli med olika stabiliseringsmedel. Den viktigaste begränsningen är att mikrotubuli måste fortfarande sTÖD kinesin motilitet. Eftersom kinesin är en robust motor enzym, är detta en ganska lös begränsning. Genom att ersätta mikrotubuli med aktin och kinesin med en myosin familj enzym, kan det fortfarande längden av aktin mätas med användning av samma teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrotubuli Gliding Assay stamlösningar
Förbered inför segelflygning analys.
- Polymerisera 0,5 mg mikrotubuli glest märkta med ljus ekologisk fluorofor 22. Målet etikett koncentrationen är 1 fluoroforen per mikrometer av mikrotubuli, eller en märkning densitet på ca 1 fluorofor per 1.500 tubulindimerer. Förvaras vid rumstemperatur, ljus skyddat med aluminium, folie i upp till två veckor.
- Rena biotin-kinesin 21 vid ungefär 1 pM. Lagra vid -80 ° C i 5 | il alikvoter för användning i enskilda experiment.
- Bered analysbufferten (AB) av 50 mM imidiazole, 50 mM kaliumklorid (KCl), 4 mM magnesiumklorid (MgCl 2), 2 mM etylenglykol tetraättiksyra (EGTA), pH 6,7. Sterilfiltrera och lagra vid 4 ° C.
- Lös biotinylerat bovint serumalbumin (biotin-BSA) till 2 mg / ml i AB. Filtrera med 0,2 um sprutfilter.Lagra vid -80 ° C i 100 | il alikvoter under långa perioder, vid 4 ° C under upp till en månad.
- Lös streptavidin (SA) till 10 mg / ml i AB. Filtrera med 0,2 um sprutfilter. Lagra vid -80 ° C i 20 pl alikvoter under långa perioder, vid 4 ° C i upp till två veckor.
- Lös α-kasein till 5 mg / ml i AB. Filtrera med 0,2 um sprutfilter. Lagra vid -80 ° C i 100 | il alikvoter under långa perioder, vid 4 ° C i upp till två veckor.
- Lös ditiotreitol (DTT) i avjoniserat vatten vid 200 mM. Förvaras vid -20 ° C i 100 | il alikvoter ska användas inom 8 timmar för upptining. Kan frysas.
- Lös paklitaxel (PT) i HPLC-kvalitet dimetylsulfoxid (DMSO) vid 4 mM. Lagra i 10 pl alikvoter vid -80 ° C lång sikt, -20 ° C kort sikt. Användning inom 8 timmar efter upptining. Kan frysas.
- Lös glukos i avjoniserat vatten vid 120 mg / ml. Lagra i 100 | il alikvoter vid -20 ° C. Kan frysas.
- Dislösa adenosintrifosfat (ATP) i avjoniserat vatten vid 150 mM, pH 7,0. Förvaras i 5 pl alikvoter vid -80 ° C, använd inom 8 timmar för upptining.
- Förbered 100x syreavlägsnande lager 25 genom att lösa 10.000 enheter glukosoxidas och 156.000 enheter katalas i 600 ul total analysbuffert. Centrifugera kort i en mikrocentrifug för att pelletera fast material, filter supernatanten med 0,2 fim sprutfilter. Lagra vid -80 ° C i 10 pl alikvoter under långa perioder, vid 4 ° C under upp till en vecka.
2. Mikrotubuli Gliding analys, samma dag Solution Förberedelser
Bered lösningar i 2,1-2,6 på dagen för experimentet. Med lite övning kan lösningar 2,2-2,6 beredas under flödescellen tvätt. Om inget annat anges, ha stamlösningar på is.
- Bered AB, 1 ml analysbuffert med 10 | il av DTT lager (AB med 2 mM DTT). Håll vid rumstemperatur.
- Förbered bio-BSA-buffert, 40 & mu, L av en 1:1 blandning av biotin-BSA-lager och AB. Håll vid rumstemperatur.
- Bered BSA-buffert, blanda 645 pl AB med 5,5 pl BSA (1 mg / ml BSA i AB). Håll vid rumstemperatur.
- Bered SA buffert, blanda 57 pl AB med 3 pl streptavidin lager (0,5 mg / ml streptavidin i AB). Håll vid rumstemperatur.
- Framställ α-kasein-buffert, blanda 200 pl BSA-buffert, 50 | il kasein lager, och 0,8 pl 15 pM ATP (1 mg / ml α-kasein, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP i AB). Håll vid rumstemperatur.
- Förbered fluorescens anti-blekmedel buffert, blanda 95 pl α-kasein-buffert, 2,5 pl glukos lager, 1 pl 100x syrefångande blanda, 1 pl paklitaxel lager, 1 pl 2-merkaptoetanol (PME). Lägg PME enligt dragskåp. Använd fluorescens mot blekmedel buffert inom 1 timme av förberedelser VARNING:. PME är mycket giftigt och luktar hemskt. Var noga med att bara öppna under dragskåp. Förvara flaskan ifrånvaro av ljus, ljus försämrar PME och dess förmåga att minska fotoblekning.
3. Mikrotubuli Gliding analys
- Konstruera om fyra flöde körfält mellan en 24 x 60 mm täckglas och 22 x 22 mm täckglas med användning av vakuum fett, extruderade från en spruta genom en pipettspets, som en spacer. Varje flöde körfält bör vara ca 10 ^ i volym (skala efterföljande volymer därefter).
- Tvätta 10 pl av bio-BSA-buffert i varje bana. Inkubera 5 minuter så att BSA för att belägga glasytor.
- Tvätta varje bana tre gånger med 15 pl BSA-buffert för att avlägsna fritt biotin-BSA, medan den fortsätter att blockera glidytan. Använd en Kimwipe eller filterpapper för att avlägsna buffert från motsatt sida av flödeskammaren, är noga med att inte tillåta luftbubblor att gå igenom flödeskammaren.
- Tvätta 15 ^ SA-buffert i varje bana. Vänta 10 minuter, eller upp till 2 timmar. Streptavidin binder till den ytbundna biotin-BSA.
- Tvätta varje bana tre gånger med 15 pl BSA-buffert för att avlägsna fritt SA samtidigt fortsätta att blockera glidytan.
- Tvätta varje bana med 15 ul α-kasein buffert. α-kasein hjälper ytterligare blockera icke-specifik bindning av kinesin och mikrotubuli till glaset.
- Späd kinesin till 10 nM i α-kasein buffert och tvätta varje bana med 15 ul av denna kinesin - α-kasein-lösning. Vänta 15 minuter (eller upp till en timme) för biotinylerade kinesin att binda specifikt till den ytbundna streptavidin. De kinesin motor domäner kommer att förbli fria att binda mikrotubuli.
- Späd paklitaxel till 40 M i rumstemperatur α-kasein buffert och tvätta varje bana med 15 ul av denna lösning för att tvätta ut gratis kinesin och att i förväg ladda varje flödeskammare med en paklitaxel lösning för att förhindra mikrotubuli från depolymerisation. Kalla också depolymeriserar mikrotubuli, så se till att dessa steg sker vid rumstemperatur med rummet temperaturerre lösningar.
- Späd fluorescensmärkta mikrotubuli 1:100-1:1,000 i fluorescens mot blekmedel buffert med 1 mM ATP. Tvätta 15 ^ till en fil och observera inom 30 minuter.
4. Datainsamling
- Beakta mikrotubuli Segelflyg med fluorescensmikroskopi, ett mikroskop kan lösa enkla fluoroforer som en kommersiell eller hem-build TIRF installation krävs 26 (figur 2).
Mikrotubuli bör drivas av kinesin motorerna över substratet vid ca 0,5 pm / s, beroende på temperatur. Om synfältet vy av mikroskopet är 50 um, bör individuella mikrotubuli vara synliga för ungefär 100 sek. Ställ belysningsintensitet så att enskilda fluoroforer inte photobleach snabbare än 100 sek. Om du använder laser excitation är en effektinställning på ca 3-5 mW lämpligt. - Samla sekvenser av bilder för analys. 600 bilder med5 Hz (2 min totalt) fungerar bra. Använd sekvenser tillräckligt länge att mikrotubuli korsa hela fältet-of-view.
5. Dataanalys
En IDL rutin, get_lp.pro , bifogas. Denna rutin returnerar ett värde uthållighet längd baserat på alla mikrotubuli gliding i en given bildsekvens. Antingen kör denna rutin på varje bildsekvens, ändra intensitet parametrar beroende på din mikroskop installationen eller göra följande:
- Spåra varje fluorofor fäst vid en mikrotubuli att skapa fluorofor banor.
- Kombinera alla banor fluoroforer på en given mikrotubuli i en övergripande mikrotubuli bana, upprepa för varje mikrotubuli i bildsekvensen (Figur 3).
- Beräkna tangens vinkel mot varje punkt längs banan (fig 4)Och beräkna <cos θ s> i ekv. 1 genom medelvärdesbildning cosinus för vinkeln skillnaden för varje par av punkter åtskilda av en väg-längd s (fig 5). Hitta envishet längden för en enskild mikrotubuli eller grupp av mikrotubuli genom att montera <cos θ s> till Ekv. 1, viktning av de enskilda datapunkter i passning med antalet oberoende värden på cos θ s som används för att beräkna medelvärdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En ögonblicksbild från en glidande analys visas i figur 2. En bra mikrotubuli densitet är 1-10 mikrotubuli per synfält, betydligt mer kommer att resultera i felspårning som mikrotubuli korsar varandra. En plot av 11 mikrotubuli banor från glidande analysen i fig 2 visas i fig 3. Typiska banor är 10 till 30 um långa, vissa banor har luckor där en mikrotubuli korsar varandra. Dessa banor kan kastas från analysen.
En enda, lång mikrotubuli bana visas i figur 4A med vinklar exempel tangenten vid två positioner längs banan. Skillnaden mellan tangentplan vinklar åtskilda av ett fast avstånd är relaterad till persistens längd, tangenten vinkeln som en funktion av läget längs mikrotubuli bana visas i figur 4B.
Tangent vinkel uppgifterfrån många mikrotubuli banor kombineras för att beräkna en enda persistens längd för alla mikrotubuli i ett givet experiment. Figur 5 visar ett diagram över <cos θ s> kontra kontur längd s för glidande analys av figur 2. Vid stora värden kontur längd, är mycket få värden för cos θ mäts, varför genomsnittet är mycket varierande. Den vägda passning överensstämmer med den korta s hög precision data mer noggrant än den långa s, låg precision data.
Värdet av persistens längd från dessa 11 banor, 500 ± 40 nm (± standardfel för medelvärdet), är representativ för persistens längder för relativt korta mikrotubuli 2. Liknande experiment ger en rad persistens längder mellan 300 och 1.000 | im.
Felsökning
Om mikrotubuli är helt frånvarande, steg omase koncentrationen av mikrotubuli i steg från 3,9 till 0,5 mg / ml. Om mikrotubuli fortfarande saknas, re-polymeriserar mikrotubuli. Se till att paklitaxel är närvarande i varje lösning mikrotubuli späds till, annars mikrotubuli kommer depolymerisera.
Om mikrotubuli är fritt sprida i lösning, men inte bindande för yta, öka kinesin koncentrationen i steg 3,7 och använd AMP-PNP istället för ATP för att kinesin binder mikrotubuli oåterkalleligt. Om mikrotubuli fortfarande inte binda göra nya streptavidin lager och buffert, följt av nya biotin-BSA-buffert. Slutligen, rena nya biotinylerat kinesin.
Om mikrotubuli binder men inte röra, byt ATP-stamlösning med färsk ATP.
Om fluoroforer photobleach för snabbt, minska belysningen intensitet. Om fluoroforer fortfarande photobleach för snabbt ersätta syre spolningssystem med färsk lager.
Om fluorophores är för mörk, öka belysningen intensitet.
Figur 1. Tecknad film av mikrotubuli Gliding analysen. Kinesin enzymer är specifikt bunden till ett täckglas av en biotin-streptavidin-bindning. Mikrotubuli är glest märkta med organiska fluoroforer. Efter tillsats av ATP, är mikrotubuli trycks av kinesin motorerna. Den främre fria änden av mikrotubulus fluktuerar på grund av termiska krafter i lösning, dessa variationer för att beräkna längden mikrotubuli uthållighet. Längden skala av mikrotubulus sonderas av dessa experiment är längden av den fria änden.
Figur 2. Typisk mikroskop ögonblicksbild av en glidande analys tas via TIRF mikroskopi. Microtu bules är glest inredda med enkla fluoroforer. Skala bar är 5 um.
Figur 3. Mikrotubulusmedel banor från bilden som visas i figur 2. Varje mikrotubuli bana kombinerar många enkla fluorofor banor (ca 10 i genomsnitt) och har tunnat till en poäng per 100 nm.
Figur 4. Beräkning av tangentplan vinklar till en bana. (A) bana en mikrotubuli, med exempel tangent vinklar som visas (θ). (B) Tangent vinkel som en funktion av läget längs mikrotubuli bana. Dessa data används för att beräkna den genomsnittliga vinklar som används i Ekv. 1.
Figur 5. Beräkning uthållighet längd från tangent vinklar. (Punkter) Plot of <cos θ s> kontra kontur längd s för de 11 banorna som visas i figur 3. (Heldragen linje) Anpassa till Ekv. 1. För denna grupp av mikrotubuli, är det fortfarande längden 500 ± 40 | im. För långa kontur längder (över 10 pm eller så), uppgifterna är mycket varierande på grund av begränsade statistik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Persistens längdmätning är en god karakterisering av de mekaniska egenskaperna hos de enskilda biopolymerer. I denna artikel, har vi beskrivit en metod för att mäta det fortfarande längden av mikrotubuli. Såsom noterats i inledningen, är denna metod lätt utsträckas till undersöka mikrotubuli mekaniska egenskaper i en mängd olika tillstånd helt enkelt genom att variera reagens, temperatur, eller viskositet i det slutliga steget av glidande analysen, 3,9, eller genom att polymerisera mikrotubuli, steg 1,1, under olika förhållanden.
Tekniken i sig är snabb att utföra. När stamlösningar har upprättats i förväg (steg 1), kan en glidande analys experiment utföras i 2-3 timmar, inklusive upp till fyra variationer i förhållandena på en enda objektglas (de fyra körfält i steg 3,1). Många mikrotubuli kan undersökas i varje experiment, typiska experiment i vårt laboratorium undersöka 100 mikrotubuli per tillstånd (ca 10 bild sekventies per bana, med 10 mikrotubuli per sekvens). Analysen av stora datamängder är också ganska snabbt. Med lite övning kan 10 bildsekvenser analyseras för persistens längd i en eftermiddag eller så med en modern PC. Det hastighetsbegränsande steget i analysen är det dags att spåra enskilda fluoroforer, nyare spårningsmetoder lovar att öka denna hastighet avsevärt 27.
Eftersom metoden omfattar övervakning enstaka fluoroforer bundna till en given mikrotubuli, är precisionen i spårning begränsas endast av fotoner insamling, och kan vara på skalan av nanometer 22, 25. Genom att inkludera data från många fluoroforer, är precisionen förbättras ytterligare. Potentiellt kan ännu högre precision uppnås genom att fästa mycket ljusa fluorescerande objekt, såsom kvantprickar, till mikrotubuli.
Medan precisionen av enskilda banor är ganska bra, osäkerheten i uthållighet lengths mätt med denna teknik (på skalan på ± 50% för en enda mikrotubuli) är fortfarande betydande. Nyckeln begränsning i precision av mätningarna efterlysningsdata längd är statistiken som deltar i genomsnitt cos θ talet. Eftersom konturen längd mellan par av punkter, s, ökar, minskar antalet oberoende mätningar av θ s som L / s, där L är längden av mikrotubuli bana studerade. Ökning av längden av mikrotubuli banor skulle möjliggöra förbättrad precision i mätningarna persistens längd.
En andra begränsning med denna metod är kravet att biotinylerad kinesin-1 kan användas för specifik bindning av kinesin till objektglas. Biotinylerad kinesin måste renas (från E. coli i vårt fall), och kan inte bara köpas från hyllan. Men en modifierad glidande analys med icke biotinylerade anhörigaEsin kan användas 28, kinesin tung kedja-protein som kan vara lämpliga för denna teknik är kommersiellt tillgänglig från cytoskelettet (Kr01). Att modifiera glidande analysen att använda denna alternativa kinesin skulle inte påverka mikrotubuli böjstyvhet på något sätt, och således göra det möjligt för grupper som inte har tillgång till rekombinant kinesin protein att använda denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Melissa Klocke för hjälp att förbereda Figur 1 och Anna Ratliff för att visa protokollet. Detta arbete stöddes av Research Corporation for Science avancemang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
