Summary
持效期长或生物大分子的抗弯刚度的方法来衡量。该方法使用一个动蛋白驱动的微管的滑动测定试验方法来测定的持久性个别微管长度，并是适应actin为基础的滑翔检测。
Abstract
微管是细胞骨架的聚合物在细胞分裂中发挥作用，细胞力学，细胞内的运输。这些函数中的每一个都需要微管僵硬，不够直，跨越了显着的部分的细胞直径。其结果是，微管持续长度，刚度的措施，已积极研究在过去的二十年1。然而，开放式的问题依然存在：短微管的10-50倍比长的微管2-4僵硬，甚至长的微管测量的持久性不同的长度，命令5-9级。
在这里，我们提出了一种方法来衡量微持效期长。该方法是基于对动蛋白驱动的微管滑翔测定10。通过结合稀疏的荧光标记的个人微管的单粒子跟踪个人的微管连接的荧光基团，glidin克轨迹跟踪单微管的纳米级精度。的持久性的轨迹长度是相同的持久性的微管长度的条件下，使用了11。一个自动跟踪例程被用来创建从荧光团连接到个别微管的微管的轨迹，这个轨迹的持续长度计算使用在IDL编写的例程。
此技术是迅速实现的，并且能够在一天的实验测量的持续长度为100微管。该方法可以扩展到在各种条件下，包括沿微管长度的函数的持续长度为测量持久长度。此外，所使用的分析例程可以被扩展到基于肌球蛋白的作用滑翔检测，测量的持久性，以及肌动蛋白丝长度。
Introduction
细胞骨架，大多数真核细胞中发现的生物聚合物网络，起到了重要作用的细胞组织，细胞内运输，细胞力学。细胞骨架的生物聚合物（主要是肌动蛋白和微管）的机械特性，发挥了显着的作用，作为一个整体12在确定的细胞的机械特性。由于整个细胞力学可以表征健康和患病细胞13,14和涉及在蜂窝蠕动15，底层细胞骨架成分的机械性能，在过去的二十年里1是一个活跃的研究领域。
的生物聚合物的弹性（或刚性），其特征在于由持久长度，长度的聚合物，该聚合物由约1弧度弯曲下在环境温度下的热波动。已经开发了许多技术测量持续长度16，用于examp乐活跃的技术，包括弯曲的聚合物水动力流，光学陷阱，或电场4,17,18，和被动的技术，测量波动的自由聚合物溶液中5,6。的活性的测量，但是，需要专门的设置，以实现的微米尺度上的已知的力量，和自由波动测量可以是具有挑战性由于扩散满分使用显微镜的焦点的平面，。
在这篇文章中，我们描述了一种互补的，被动的，技术来衡量的持效期长的微管，细胞骨架聚合物。该技术涉及滑动检测，确保聚合物始终保持在焦平面19。此外，它涉及到跟踪单个荧光基团连接永久的聚合物的利益，使特定的位置沿聚合物很好的特点。
一个卡通的方法显示在FIGURE 1。动蛋白专门向“+”端的微管移动，因此推动单向微管的滑翔试验。超出附加的最后驱动蛋白，微管的前端是自由浮动，根据周围的溶液的热势力。由于微管向前推进，最终波动，直到绑定到一个新的驱动蛋白分子沿玻璃幻灯片冻结在一个给定的波动。由于动蛋白非常重视微管，强烈的约束，微管的前端走的一条路。因此，微管轨迹冻成的统计波动是相同的微管11的自由端的统计波动，并因此可以被用来计算至20所述持续长度
其中 l p是持久性的微管的长度，θs是分离的轮廓长度 s的轨迹的切线之间的夹角，<>表示所有对隔开的轮廓长度 s的位置的平均值。
滑翔试验本身采用动蛋白生物素标记的特异性结合的载玻片上通过链霉亲和素生物素联动的双螺旋21。此附件可确保电机领域是自由结合，推动微管。为了顺应微管的轨迹，人烟稀少标记微管与有机荧光22,23 -标签必须足够稀疏，使用单分子荧光显微镜分辨的单荧光团。单荧光团跟踪使用IDL编写的图像分析程序。每个荧光团的轨迹绑定到一个给定的麦克风rotubule被组合成一个复合的微管轨迹自动24。沿一轨迹的每个点的切线的角度θ计算;从这些切线角度<COSθS>的值计算为每个轮廓长度 s。最后，这些数据是符合式。 1，以便对于一个给定的微管中，提取一个持久长度或许多在同一滑翔测定的微管。
该方法是健壮的，足够的工作与在各种各样的条件下（与不同的稳定剂或其它小分子的微管结合，与绑定微管相关蛋白（MAPs），或与各种粘稠溶液）制备的微管。在我们的实验室中，该技术已被用于表征作为的函数的长度沿不同的稳定剂的微管和微管与微管长度的持久性。主要的限制是微管必须小号支持动蛋白的活力。由于动蛋白是一个强大的电机酶，这是一个相当宽松的限制。通过更换微管与肌动蛋白和驱动蛋白与肌球蛋白家族酶，持效期长的肌动蛋白可以使用相同的技术。
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Protocol
1。微管滑动含量库存解决方案
提前准备的滑翔试验。
- 聚合0.5毫克明亮的有机荧光22标记的微管人烟稀少。目标标签的浓度为1每微米的微管，或荧光标记密度约每1500个微管蛋白二聚体的荧光。储存在室温温度，光照，保护与铝，铝箔，长达两个星期。
- 纯化生物素驱动蛋白21在约1μM。储存在-80℃，在5微升的等分试样用于在个别实验。
- 准备的测定缓冲液（A，B）的50mM imidiazole，50mM的氯化钾（KCl），4 mM氯化镁（MgCl 2）中，2mM的乙二醇四乙酸（EGTA），pH值6.7。无菌过滤器，并储存于4°C。
- 将生物素化的牛血清白蛋白（生物素-BSA溶解）2毫克/毫升在AB。与0.2微米针头式过滤器过滤。储存在-80℃，在长时间的100μl等分试样，在4℃下长达一个月。
- 将链霉亲和素（SA）溶解至10毫克/毫升在AB。与0.2微米针头式过滤器过滤。储存在-80℃下在20微升等份长时间，在4℃下，最多两个星期。
- 将α-酪蛋白溶解至5毫克/毫升，在AB。与0.2微米针头式过滤器过滤。储存在-80℃，在长时间的100μl等分试样，在4℃下进行最多两个星期。
- 在200mM的二硫苏糖醇（DTT）在去离子水中溶解。在100微升等份，储存在-20°C解冻后8小时内使用。可以冷冻。
- 4mM的HPLC级的二甲基亚砜（DMSO）中溶解紫杉醇（PT）。商店在10微升等份，在-80°C长期，-20°C短期。解冻后8小时内使用。可以冷冻。
- 溶解在去离子水中的葡萄糖，在120毫克/毫升。贮存于-20℃下在100μl等份可以冷冻。
- 派息解决的三磷酸腺苷（ATP）在去离子水中，在150mM，pH为7.0。在-80°C存放在5微升等份，解冻后8小时内使用。
- 准备好100倍除氧股票25到600μl总分析缓冲液溶解10,000个单位的葡萄糖氧化酶和过氧化氢 酶156,000单位。短暂离心，离心沉淀固体;上清液用0.2微米针头式过滤器的过滤器。储存在-80℃，于10μl等分长时间，在4℃下最多为一个星期。
2。微管滑翔含量，即日溶液的制备
准备在2.1-2.6的解决方案在实验当天。通过实践，解决方案，准备在2.2-2.6流动池清洗。除非另有说明，在冰上保持库存中的解决方案。
- 准备AB，1毫升测定缓冲液中，用10微升的DTT股票（AB用2mM DTT）。在室温下保存。
- 准备生物BSA缓冲液，40亩; l的生物素-BSA的库存和AB的1:1混合物中。在室温下保存。
- 准备BSA缓冲液中，用5.5微升BSA（1毫克/毫升BSA在AB）645微升AB混合。在室温下保存。
- 准备SA的缓冲液，用3微升的链霉抗生物素蛋白的股票（0.5毫克/毫升链霉抗生物素蛋白在AB）将57微升AB混合。在室温下保存。
- 制备α-酪蛋白的缓冲液，混合200μl的BSA缓冲液中，加入50μl的酪蛋白的库存中，和0.8微升15μMATP（1毫克/毫升α-酪蛋白，0.8毫克/毫升BSA，50 nM的ATP在AB）。在室温下保存。
- 准备荧光防漂白剂缓冲，将95微升α-酪蛋白缓冲，2.5微升葡萄糖股票，1微升100倍的氧清除组合，1微升紫杉醇股票，1微升2 - 巯基乙醇（βME）混合。添加βME下通风柜。使用荧光漂白剂抗缓冲区内1小时的准备。的注意 ：βME是剧毒的，味道很难闻。请务必只在通风橱下打开。在商店瓶没有光亮;的光降解βME和能力，以减少漂白。
3。微管滑翔检测
- 建设24×60毫米盖玻片和22 x 22毫米盖玻片四流道之间采用真空油脂，通过了一套吸头注射器挤出，作为间隔。每个流道应该是约10微升量（规模相应的后续卷）。
- 洗到每一个车道的生物BSA缓冲液10微升。孵育5分钟以允许BSA的涂覆的玻璃表面。
- 每个泳道洗净用15μlBSA缓冲液中，以除去游离的生物素-BSA的3倍，同时继续阻止的滑动表面。使用一个的Kimwipe或滤纸，删除流室对面的缓冲区， 请确保不要让气泡通过流室 。
- SA-15μL缓冲液洗到每个车道。等待10分钟，或最多2个小时。链霉亲和素将绑定到表面结合生物素-BSA。
- 每个泳道洗净三次用15μlBSA缓冲液中，以除去游离的SA，同时继续以阻止滑动表面。
- 每个泳道洗净用15μlα-酪蛋白的缓冲。 α-酪蛋白，可以进一步阻止非特异性结合的动蛋白，微管的玻璃。
- 稀释驱动蛋白10nM的α-酪蛋白的缓冲液中，并用15μl此驱动蛋白 - α-酪蛋白溶液洗每个泳道。等待15分钟（或长达一个小时）的生物素化的驱动蛋白特异性结合的表面结合的链霉抗生物素蛋白。将继续免费绑定微管的驱动蛋白马达域。
- 稀释紫杉醇α-酪蛋白缓冲液在室温（40μM），并用15微升该溶液洗每个泳道洗出自由驱动蛋白和预加载每个流室与紫杉醇溶液，以防止从解聚的微管。冷解聚微管，所以一定要确保这些步骤发生在室温下用房间temperatu重新解决方案。
- 稀释荧光标记微管1:100-1:1,000在1 mM ATP荧光漂白剂抗缓冲。 15μL洗成一个车道，并在30分钟内观察。
4。数据采集
- 用荧光显微镜观察微管滑翔;，显微镜需要能够解决单个荧光基团，如商业或家庭构建TIRF设置的26（ 图2）。
应当由驱动蛋白马达推进微管，在该衬底上在约0.5微米/秒，这取决于温度。如果该字段的视图的显微镜是50微米，单个微管应该是可见的约100秒。设置单荧光基团，使光照强度不超过100秒的光漂白剂更迅速。如果使用激光激发，约3-5毫瓦的功率设置是合适的。 - 收藏报错序列的图像进行分析。 600图像5赫兹（共2分钟）效果很好。使用序列足够长的时间，微管遍历整个视场的。
5。数据分析
一个IDL的常规， get_lp.pro ，连接。此例程返回一个持久性的基础上所有微管滑翔在一个给定的图像序列的长度值。运行这个程序对每一个图像序列，修改强度参数，根据您的特定显微镜设置，或执行以下操作：
- 跟踪每一个荧光团连接到微管的荧光轨迹。
- 合并所有的轨迹的一个给定的微管成一个整体的微管轨迹上的荧光基团，重复的图像序列中的每个微管（ 图3）。
- 计算每个点沿轨迹的切线角度（ 图4）和计算<cosθs的>在方程1，平均每对分离通过的路径长度 s（ 图5）的点的角度差的余弦。找到持久的长度为一个单一的微管或微管组拟合<cosθS>式。 1，单独的数据点中的适合由数量的独立的cosθs的值被用来计算平均加权。
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Representative Results
快照滑翔试验， 如图2所示。一个很好的微管密度为1-10微管，每场来看，大幅度增加将导致错误跟踪，微管相互交叉。甲地积的11个微管从在图2中的滑动检测的轨迹在图3所示。典型的轨迹是10到30微米长，有的轨迹有差距的其中一个微管穿过另一。这些轨迹从分析中可能会被丢弃。
一个单一的，长的微管的轨迹示出在图4A中沿轨迹在两个位置与例如切线夹角。由一个固定的距离分隔的切线夹角之间的差别有关的持续长度，沿着微管轨迹的位置作为一个功能是在图4B所示的切线的角度。
角正切数据从许多微管轨迹相结合来计算一个单独的持久长度图5示出了可用于所有在一个给定的实验的微管。<cosθs的 >与轮廓长度 s滑翔检测图2的曲线图。在大的轮廓长度值，很少的cosθ值计量，因此平均高度可变的。加权拟合符合短期小号 ，高精度的数据更加紧密地渴望着，低精度的数据。
持久性从这些11的轨迹的长度，500±40微米（平均值±标准误差），该值是相对短的微管的长度为2的持久性的代表。类似的实验，300至1000微米的范围内的持久性长度。
故障排除
如果微管是完全不存在的，增量酶的浓度的微管在步骤3.9到0.5毫克/毫升。如果微管人仍下落不明，重新聚合微管。确保紫杉醇是目前每个解决方案中稀释成微管，否则微管解聚。
如果微管的解决方案，但不具约束力的表面自由扩散，增加动蛋白的浓度在3.7步骤和使用AMP-PNP，而不是ATP，以确保动蛋白结合微管不可逆的。如果微管还没有绑定，使新的链霉亲和素股票和缓冲液中，通过新的生物素-BSA缓冲。最后，净化新的生物素化的驱动蛋白。
如果微管结合，但不动，更换新鲜的ATP ATP原液。
如果荧光基团的光漂白速度太快，降低光照强度。如果荧光基团的光漂白速度太快，更换氧清除系统的新货。
如果fluoropho水库光线太暗，增加光照强度。
图1。卡通的微滑翔试验。动蛋白的酶特异性结合的生物素 - 链霉亲和素联动盖玻片。人烟稀少的有机荧光标记微管。加入ATP后，微管推由驱动蛋白电机。的领先的微管的自由端，由于在溶液中的热力波动，这些波动被用来计算微管持续长度。这些实验中所探测的微管的长度规模的自由端的长度。
图2：典型的滑翔试验，通过全内反射荧光显微镜显微镜快照。微管 bules稀疏的装饰与单个荧光基团。比例尺为5μm。
在图2中所示的图3，微管从所述图像序列的轨迹。每个微管轨迹结合许多单个荧光轨迹（约10平均），和已减薄到100nm的每一个点。
图4计算的轨迹的切线的角度。 （A）的轨迹的一个微管中，示例性示出的切线的角度（θ）。 （B）的切线角度沿着微管轨迹的位置作为一个功能。这些数据被用于计算方程中使用的平均角度。 1。
图5。从切线角度计算持效期长。 （ 点 ）为图3中所示的11个轨迹剧情<cosθs的 >的轮廓长度 s。 （ 实线 ）调整到式。 1。这组微管，持效期长为500±40微米。对于长的轮廓的长度（10微米或以上），数据是高度可变的，由于有限的统计数据。
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Discussion
持久性长度测量是个别的生物聚合物的机械性能良好的表征。在这篇文章中，我们已经描述的方法测量微管长度的持久性。如在引言中指出的，这种方法很容易扩展到检查微管的机械性能在各种条件下，简单地通过不同的试剂，温度或粘度的滑动试验中，3.9，在最后步骤中，或通过聚合微管，步骤1.1，在不同的条件下。
技术本身是迅速执行。一旦股票方案已经提前准备的时间（第1步），滑翔检测实验可以在2-3小时，其中包括四个变化的条件下，在一台显微镜幻灯片（四车道的步骤3.1）。许多微管可以检查每个实验的典型实验，在我们的实验室检查100微管的条件（约10图像测序ES，每个通道，每个序列有10微管）。分析大型数据集同样是相当快的。通过练习，10个图像序列进行分析，持效期长的一个下午或一个现代PC。在分析的限速步骤是跟踪单个荧光基团;新的跟踪方法保证速度大幅增加27。
因为该方法涉及跟踪单个荧光团连接到一个给定的微管，跟踪精度只限于由光子收集，并可以在纳米22，25的规模。通过包括数据从许多荧光基团，进一步提高精度。潜在的，甚至更高的精度可以达到非常明亮的荧光物体，如量子点连接，微管。
虽然个人轨迹的精度是相当不错的，持久性的不确定性乐用这种方法测得的ngths（在一个单一的微管规模的±50％）仍然是显着的。持效期长测量精度的限制，关键是统计平均COSθS。作为分， 秒 ，增加的对之间的轮廓长度，θs的独立测量的数目减少为 L / s时， 其中 ，L是微管轨迹长度的研究。增加微管轨道的长度允许的持久长度测量的精度。
这种方法的第二个限制是，生物素化的动蛋白被用于特定的附件驱动蛋白显微镜玻片上的要求。生物素标记的驱动蛋白纯化（从大肠杆菌在我们的例子中），并不能简单地购买现成的。但是，修改后的滑翔试验使用unbiotinylated亲属ESIN可以使用28;驱动蛋白重链蛋白质，可能会对适合这种技术从细胞骨架（KR01）是市售的。修改的滑翔试验，使用此备用动蛋白不会影响微管的抗弯刚度以任何方式，从而使重组动蛋白组没有使用此方法。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们协助准备图1和安娜·拉特利夫证明了协议的感谢梅丽莎克洛克。这项工作是由研究公司的科技进步。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
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