Summary
Een methode om de persistentielengte of buigstijfheid van biopolymeren meten beschreven. De methode gebruikt een kinesine aangedreven microtubule gliding assay experimenteel bepalen de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar aan actine gebaseerde assays glijden.
Abstract
Microtubules cytoskelet polymeren die een rol spelen in celdeling, mechanica en intracellulair transport. Elk van deze functies is microtubules die stijf en recht genoeg om een aanzienlijk deel van de celdiameter overspannen. Daardoor is het microtubule persistentielengte, een maat van stijfheid, actief onderzocht voor de laatste twee decennia 1. Niettemin, open vragen blijven: kort microtubuli zijn 10-50 keer minder stijf dan lange microtubuli 2-4, en zelfs lang microtubuli hebben gemeten persistentie lengten die variëren van een orde van grootte 5-9.
Hier presenteren we een methode om microtubule persistentie lengte te meten. De methode is gebaseerd op een kinesine aangedreven microtubule gliding assay 10. Door het combineren van schaarse fluorescente labeling van individuele microtubuli met enkel deeltje volgen van individuele fluoroforen aan de microtubuli, de gliding trajecten van enkele microtubuli worden bijgehouden met nanometer-niveau precisie. De persistentielengte van de trajecten is hetzelfde als de persistentielengte van het microtubule onder de gebruikte 11. Een geautomatiseerde volgen routine wordt gebruikt microtubule trajecten maken van fluoroforen aan individuele microtubuli, en de persistentielengte van dit traject wordt berekend op basis routines geschreven in IDL.
Deze techniek is snel uitvoerbaar en staat om de persistentielengte van 100 microtubuli in een dag experimenten. De werkwijze kan worden uitgebreid tot persistentielengte meten onder verschillende omstandigheden, waaronder persistentielengte als functie van lengte langs microtubuli. Bovendien kan de gebruikte analyse routines worden uitgebreid tot myosine-based assays werkende glijden, de persistentielengte van actine filamenten maatregel.
Introduction
Het cytoskelet, een netwerk van biopolymeren in de meeste eukaryotische cellen een rol speelt in cellulaire organisatie, intracellulair transport en cel mechanica. De mechanische eigenschappen van de biopolymeren van het cytoskelet (voornamelijk actine en microtubuli) spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de mechanische eigenschappen van de cel als geheel 12. Sinds hele cel mechanica kunnen karakteriseren gezonde en zieke cellen 13,14 en is betrokken bij cellulaire motiliteit 15, zijn de mechanische eigenschappen van de onderliggende cytoskelet componenten al een actief gebied van onderzoek voor de afgelopen twee decennia 1.
De flexibiliteit (of stijfheid) van biopolymeren wordt gekenmerkt door de persistentielengte de lengte polymeer dat bochten met ongeveer een radiaal onder thermische fluctuaties bij omgevingstemperatuur. Een aantal technieken zijn ontwikkeld om persistentielengte 16, voor meten voorble actieve technieken die erin buigen het polymeer met hydrodynamische stroming, optische vallen of elektrische velden 4,17,18 en passieve technieken die fluctuaties van vrije polymeren in oplossing 5,6 meten. De actieve metingen vereisen echter speciale opstellingen om bekende krachten te passen op de micrometer schaal, en de free-fluctuatie metingen kan een uitdaging zijn als gevolg van diffusie uit het vlak van de focus van de gebruikte microscoop.
In dit artikel beschrijven we een complementaire, passief, techniek om de persistentie lengte van microtubuli, een cytoskelet polymeer te meten. De techniek bestaat glijden assays die ervoor zorgen dat het polymeer altijd in het brandvlak 19. Bovendien gaat volgen enkele fluoroforen permanent aan het polymeer van belang, zodat specifieke locaties langs de polymeerketen goed gekarakteriseerd.
Een cartoon van de methode wordt in Figure 1. Kinesine beweegt specifiek in de richting + einde van de microtubuli, dus de microtubuli in een glijdende assay zijn unidirectioneel aangedreven. Het voorste einde van de microtubuli, voorbij de laatste bevestigd kinesine, vrij fluctueren onder de thermische krachten van de omringende oplossing. Omdat de microtubule naar voren gestuwd, het einde fluctueert tot binding aan een nieuwe kinesine molecule verder langs het glaasje bevriest in een bepaalde fluctuatie. Omdat kinesine hecht zeer sterk microtubules wordt de microtubule beperkt tot het pad van het leidende einde volgen. Derhalve zullen de fluctuaties in de bevroren microtubule traject zijn dezelfde als de statistische fluctuaties van het vrije uiteinde van microtubuli 11 en kan dus worden gebruikt om de persistentielengte berekenen volgens conclusie 20
waarbij l p de persistentielengte van het microtubule, θ de hoek is tussen raaklijnen aan de baan gescheiden door een contour lengte s en <> duidt een gemiddelde van alle paren posities gescheiden door een contour lengte s.
De glijdende test zelf maakt gebruik van kinesine gebiotinyleerd aan het opgerolde spoel 21 specifiek gebonden aan het glasplaatje via een streptavidine-biotine koppeling. Deze bevestiging zorgt ervoor dat de motor vrij domeinen bindt aan microtubuli stuwen. Met het oog op microtubuli trajecten volgen, zijn microtubuli dun gelabeld met organische fluoroforen 22,23 - de etiketten moeten worden schaars genoeg dat enkele fluoroforen zijn oplosbaar met behulp van single molecule fluorescentie microscopie. Single fluoroforen worden bijgehouden met behulp van beeldanalyse routines geschreven in IDL. De banen van elk fluorofoor gebonden aan een bepaalde microtubule gecombineerd tot een samengesteld microtubule traject automatisch 24. De raaklijn hoeken θ elk punt langs een traject berekend en uit deze raaklijn loodrecht op <cos s> waarde berekend voor elke contour lengte s. Tot slot worden deze gegevens aanpassen aan Eq. 1 om een persistentielengte extraheren voor een bepaalde microtubule of vele microtubuli in dezelfde assay glijden.
De werkwijze is robuust genoeg om bij microtubuli bereid in een grote verscheidenheid van aandoeningen (met verschillende stabilisatoren of andere kleine moleculen gebonden aan de microtubuli, met gebonden microtubule-geassocieerde eiwitten (MAP's), of met verschillende viskeuze oplossingen). In ons laboratorium werd de techniek gebruikt om de persistentielengte van microtubuli karakteriseren als functie van lengte langs de microtubuli en microtubules met verschillende stabilisatoren. De belangrijkste beperking is dat de microtubuli moet nog sTEUN kinesine motiliteit. Omdat kinesine is een robuuste motor enzym, dit is een vrij losse beperking. Door het vervangen van microtubuli met actine en myosine kinesine een familie enzym kan de persistentielengte van actine wordt gemeten met dezelfde techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microtubuli Zweefvliegen Assay Stock Solutions
Bereid voor op zweefvliegen test.
- Polymeriseren 0,5 mg microtubuli dun gelabeld met heldere organische fluorofoor 22. Het doel etiket concentratie is 1 fluorofoor per micrometer van microtubuli, of een etikettering dichtheid van ongeveer 1 fluorofoor per 1.500 tubuline-dimeren. Bewaren bij kamertemperatuur, licht beschermd met aluminium, folie voor maximaal twee weken.
- Zuiveren biotine-kinesine 21 ongeveer 1 uM. Bij -80 ° C in 5 pi aliquots voor gebruik in afzonderlijke experimenten.
- Bereid de assay buffer (AB) van 50 mM imidiazole, 50 mM kaliumchloride (KCl), 4 mM magnesiumchloride (MgCl2), 2 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), pH 6,7. Steriel filter en bewaar bij 4 ° C.
- Los gebiotinyleerde bovine serum albumine (BSA-biotine) tot 2 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter.Bij -80 ° C in 100 ul aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
- Los streptavidine (SA) tot 10 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 20 pi aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende twee weken.
- Los α-caseïne tot 5 mg / ml in AB. Filter met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 100 ul aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende twee weken.
- Los dithiothreitol (DTT) in gedeïoniseerd water bij 200 mM. Bij -20 ° C in 100 ul aliquots binnen 8 uur na ontdooien. Kan opnieuw worden ingevroren.
- Los paclitaxel (PT) in HPLC-grade dimethylsulfoxide (DMSO) bij 4 mM. Bewaren in 10 ul aliquots bij -80 ° C op lange termijn, -20 ° C op korte termijn. Gebruik binnen 8 uur na ontdooien. Kan opnieuw worden ingevroren.
- Los glucose in gedeïoniseerd water bij 120 mg / ml. Store in 100 ul aliquots bij -20 ° C. Kan opnieuw worden ingevroren.
- Dislossen adenosine trifosfaat (ATP) in gedeïoniseerd water bij 150 mM, pH 7,0. Store in 5 pi aliquots bij -80 ° C binnen 8 uur na ontdooien.
- Bereid 100x zuurstofwegvangende voorraad 25 door het oplossen van 10.000 eenheden glucose-oxidase en katalase 156.000 eenheden in 600 ul totaal assay buffer. Centrifugeer kort in een microcentrifuge om pellet vaste stoffen; filter supernatant met 0,2 micrometer spuitfilter. Bij -80 ° C in 10 pi aliquots gedurende langere tijd bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
2. Microtubuli Zweefvliegen Assay, Same Day Solution Voorbereiding
Bereid de oplossingen 2,1-2,6 op de dag van het experiment. Met wat oefening kun oplossingen 2,2-2,6 worden voorbereid tijdens de flow-cel wassen. Tenzij anders vermeld, houden voorraad oplossingen op ijs.
- Bereid AB, 1 ml assaybuffer met 10 ul DTT stock (AB met 2 mM DTT). Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid bio-BSA buffer, 40 & mu, L van een 1:1 mengsel van de biotine-BSA stock en AB. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid BSA buffer, 645 pl mengen AB met 5,5 ul BSA (1 mg / ml BSA in AB). Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid SA buffer, mengen 57 pl AB met 3 ui streptavidine stock (0,5 mg / ml streptavidine in AB). Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid α-caseïne buffer, mengen 200 ul BSA buffer, 50 pl stock caseïne en 0,8 pi 15 uM ATP (1 mg / ml α-caseïne, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid fluorescentie anti-bleach buffer, 95 pi mengen α-caseïne buffer, 2,5 pl stock glucose, 1 pi 100x zuurstofvanglaag mix, 1 ul paclitaxel stock, 1 pi 2-mercaptoethanol (βME). Voeg βME onder zuurkast. Gebruik fluorescentie anti-bleach buffer binnen 1 uur van voorbereiding. LET OP: βME is zeer giftig en ruikt verschrikkelijk. Zorg ervoor dat u alleen open onder de zuurkast. Bewaar fles in deafwezigheid van licht, licht degradeert βME en zijn vermogen om fotobleken te verminderen.
3. Microtubuli Gliding Assay
- Construct ongeveer vier stromen banen tussen een 24 x 60 mm dekglaasje en 22 x 22 mm dekglaasje onder vacuüm vet, uit een spuit geëxtrudeerd door een pipetpunt, een spacer. Elke stroom rijstrook moet ongeveer 10 ul in volume (schaal volgende delen daarvan) zijn.
- Wassen 10 ul van bio-BSA buffer in elke baan. Incubeer 5 min te laten BSA de vacht van de glazen oppervlakken.
- Was elke baan drie keer met 15 ul BSA-buffer te verwijderen vrij biotine-BSA, terwijl u de schuif oppervlak te blokkeren. Gebruik een Kimwipe of filtreerpapier om buffer te verwijderen uit tegenovergestelde kant van stroom-kamer, en zorg ervoor dat niet toe te staan luchtbellen om te gaan door de stroom kamer.
- Was de 15 ul SA-buffer in elke baan. Wacht 10 minuten, of tot 2 uur. De streptavidine binden aan het oppervlak gebonden biotine-BSA.
- Was elke baan drie keer met 15 ul BSA-buffer om gratis SA te verwijderen terwijl u de schuif oppervlak te blokkeren.
- Was elke baan met 15 ul α-caseïne buffer. α-caseïne helpt verder niet-specifieke binding van kinesine en microtubuli blokkeren het glas.
- Verdun kinesine tot 10 nM in α-caseïne buffer en was elke baan met 15 ul van deze kinesine - α-caseïne-oplossing. Wacht 15 min (of tot een uur) voor de gebiotinyleerde kinesine specifiek binden aan het oppervlak gebonden streptavidine. De kinesine motorische domeinen blijft vrij om te binden microtubuli.
- Verdun paclitaxel tot 40 uM in de kamer-temperatuur α-caseïne buffer, en was elke baan met 15 ul van deze oplossing uit te spoelen vrij kinesine en Aan een aanvoer kamer vooraf te laden met een paclitaxel-oplossing aan microtubuli voorkomen depolymeriseren. Koud ook microtubuli depolymeriseert, dus zorgen dat deze stappen uitgevoerd te maken bij kamertemperatuur met ruimte temperare oplossingen.
- Verdunde fluorescent gelabelde microtubuli 1:100-1:1,000 in fluorescentie anti-bleach-buffer met 1 mM ATP. Was de 15 ul in een rijstrook en neem binnen 30 minuten.
4. Data Collection
- Let op de microtubuli zweefvliegen met behulp van fluorescentie microscopie, een microscoop kan oplossen enkele fluoroforen zoals een commerciële of home-build TIRF installatie vereist 26 (figuur 2).
De microtubules worden aangedreven door de motoren kinesine op het substraat ongeveer 0,5 um / s, afhankelijk van de temperatuur. Als het veld-of-view van de microscoop is 50 urn moeten individuele microtubuli zichtbaar voor ongeveer 100 sec. Stel lichtintensiteit zodat enkele fluoroforen niet photobleach sneller dan 100 sec. Bij gebruik laserexcitatie een vermogensinstelling van ongeveer 3-5 mW geschikt. - Verzamel sequenties van beelden voor analyse. 600 beelden op5 Hz (2 min totaal) werkt goed. Gebruik sequenties lang genoeg dat microtubuli het gehele veld-of-view doorkruisen.
5. Data-analyse
Een IDL routine, get_lp.pro , is bevestigd. Deze routine geeft een persistentielengte waarde op basis van alle microtubuli zweefvliegen in een bepaalde sequentie van beelden. Ofwel het uitvoeren van deze routine op elk beeld reeks, wijzigen intensiteit parameters afhankelijk van uw specifieke microscoop setup, of doe het volgende:
- Houd elke fluorofoor bevestigd aan een microtubule om fluorofoor trajecten te creëren.
- Combineren alle trajecten van fluoroforen op een bepaalde microtubule in een algemeen microtubule traject; herhalen voor elk microtubule in de reeks beelden (figuur 3).
- Bereken de tangens hoek elk punt langs de baan (figuur 4)En berekenen <cos θ s> in Eq. Een door het gemiddelde cosinus van de hoek verschil voor elk paar punten gescheiden door een weglengte s (Figuur 5). Vind de persistentie lengte voor een enkele microtubule of een groep van microtubuli door het aanbrengen van <cos θ s> aan Eq. 1, weging van de afzonderlijke gegevenspunten in de pasvorm van het aantal onafhankelijke waarden van cos θ s die worden gebruikt om het gemiddelde te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een momentopname van een glijdende assay is weergegeven in figuur 2. Een goede microtubuli dichtheid is 1 tot 10 microtubuli per gezichtsveld; aanzienlijk meer zal resulteren in Haperingen als microtubuli elkaar kruisen. Een grafiek van de 11 microtubule trajecten van de glijdende assay in figuur 2 is weergegeven in figuur 3. Typische trajecten zijn 10 tot 30 micrometer lang, sommige trajecten hebben gaten waar een microtubule kruist elkaar. Deze trajecten kunnen worden verwijderd uit de analyse.
Een lange microtubule traject wordt getoond in figuur 4A met bijvoorbeeld raaklijn loodrecht op twee posities langs het traject. Het verschil tussen raaklijn hoeken gescheiden door een vaste afstand wordt gerelateerd aan de persistentielengte, de tangens hoek als functie van de positie langs de microtubuli traject wordt getoond in figuur 4B.
De tangens hoek gegevensvan vele microtubule trajecten wordt gecombineerd tot een persistentielengte berekenen voor alle microtubuli in een bepaald experiment. Figuur 5 toont een grafiek van <cos θ s> versus contour lengte s voor het glijden assay van figuur 2. Bij grote lengte contour waarden heel weinig waarden van cos θ gemeten, waaruit de gemiddelde is zeer variabel. De gewogen fit voldoet aan de korte s, hoge-precisie metingen nauwer dan de lange s, lage precisie data.
De waarde van persistentielengte van deze trajecten 11, 500 ± 40 pm (± standaardfout van het gemiddelde), is representatief voor persistentie lengtes relatief korte microtubules 2. Soortgelijke experimenten geven een reeks persistentie lengte tussen 300 en 1000 urn.
Problemen oplossen
Als microtubuli zijn volledig afwezig, behouase de concentratie van microtubuli in stap 3,9 tot 0,5 mg / ml. Als microtubuli zijn nog steeds vermist, re-polymeriseren microtubuli. Zorg paclitaxel aanwezig in elke oplossing microtubuli verdund in anders microtubuli wordt depolymeriseren.
Als microtubuli zijn vrij verspreiden in oplossing, maar niet te binden aan het oppervlak, verhoging van de kinesine concentratie in stap 3.7 en gebruik maken van AMP-PNP in plaats van ATP om ervoor te zorgen kinesine bindt irreversibel microtubuli. Als microtubuli nog steeds niet binden, nieuwe streptavidine voorraad en buffer, gevolgd door nieuwe biotine-BSA-buffer. Tot slot, zuiveren nieuwe gebiotinyleerde kinesine.
Als microtubuli binden, maar niet bewegen, vervang ATP voorraad met een fris ATP.
Als fluoroforen photobleach te snel, te verminderen lichtintensiteit. Als fluoroforen nog photobleach te snel, de zuurstof opvangsysteem met verse voorraad.
Als fluorophores zijn te zwak, te verhogen lichtintensiteit.
Figuur 1. Tekening van de microtubuli zweefvliegen test. Kinesine enzymen zijn specifiek gebonden aan een dekglaasje met een biotine-streptavidine binding. Microtubuli zijn dun gelabeld met organische fluoroforen. Na toevoeging van ATP worden geduwd door de microtubuli kinesine motoren. De grootste vrije uiteinde van de microtubule fluctueert als gevolg van thermische krachten in oplossing; deze fluctuaties worden gebruikt om de microtubule persistentielengte berekenen. De lengte-omvang van de microtubule onderzocht door deze experimenten is de lengte van het vrije uiteinde.
Figuur 2. Typische microscoop momentopname van een glijdende test, afgenomen via TIRF microscopie. Microtu bules zijn dun ingericht met enkele fluoroforen. Schaalstaaf is 5 pm.
Figuur 3. Microtubule trajecten van de afbeelding die wordt weergegeven in Figuur 2. Elke microtubuli traject combineert veel alleenstaande fluorofoor trajecten (ongeveer 10 gemiddeld), en zijn uitgedund tot een punt per 100 nm.
Figuur 4. Berekenen de raaklijn loodrecht op een baan. (A) Traject van een microtubuli, met bijvoorbeeld tangens hoeken (θ) getoond. (B) Tangent hoek als functie van positie langs de microtubule traject. Deze gegevens worden gebruikt om de gemiddelde hoek in Eq berekenen. 1.
Figuur 5. Berekenen van persistentie lengte van tangens hoeken. (Dots) Grondstuk <cos θ s> versus contour lengte s voor de 11 trajecten weergegeven in figuur 3. (Doorgetrokken lijn) Aanpassen aan Eq. 1. Voor deze groep microtubuli, de persistentielengte is 500 ± 40 pm. Voor lange lengtes contour (boven 10 urn of zo) de data zijn zeer variabel vanwege de beperkte statistieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Persistentielengte metingen een goede karakterisering van de mechanische eigenschappen van individuele biopolymeren. In dit artikel hebben we een methode beschreven voor het meten van de persistentielengte van microtubuli. Zoals vermeld in de inleiding, is deze werkwijze gemakkelijk uitgebreid onderzoek microtubule mechanische eigenschappen in verschillende omstandigheden eenvoudigweg door het variëren van de reagentia, temperatuur of viscositeit in de laatste stap van de assay glijden, 3.9, of door polymerisatie van microtubules, stap 1.1, onder verschillende omstandigheden.
De techniek zelf snel uit te voeren. Zodra stock oplossingen werden vooraf (stap 1) bereid kan een glijdende assay experiment uitgevoerd in 2-3 uur, inclusief maximaal vier variaties in omstandigheden op een microscoopglaasje (de vier banen in stap 3.1). Veel microtubuli kunnen worden onderzocht in elk experiment; typische experimenten in ons laboratorium onderzocht 100 microtubuli per conditie (ongeveer 10 beeld sequenceres per baan, met 10 microtubuli per sequentie). De analyse van grote datasets is eveneens vrij snel. Met wat oefening kan 10 beeldsequenties worden geanalyseerd voor persistentie lengte in een middag of zo met een moderne PC. De snelheidsbepalende stap in de analyse is het tijd om individuele fluoroforen te volgen; nieuwere volgen methoden beloven om deze snelheid te verhogen aanzienlijk 27.
Omdat de werkwijze het volgen enkele fluoroforen van een gegeven microtubule, wordt de nauwkeurigheid van het volgen slechts beperkt door foton verzamelen, en kan op de schaal van nanometers 22, 25. Door gegevens van vele fluoroforen, wordt de nauwkeurigheid verder verbeterd. In principe kan een nog hogere nauwkeurigheid worden bereikt door het aanbrengen van zeer heldere fluorescerende voorwerpen, zoals quantum dots, aan de microtubuli.
Terwijl de precisie van individuele trajecten is heel goed, de onzekerheid in persistentie lengths gemeten met deze techniek (op de schaal van ± 50% voor een enkele microtubule) is nog steeds aanzienlijk. De belangrijkste beperking in nauwkeurigheid van de persistentie lengte metingen is de statistieken die betrokken zijn bij een gemiddelde cos θ s. De contour lengte tussen paar punten s, toeneemt, het aantal onafhankelijke metingen van θ s afneemt L / s, waarbij L de lengte van het traject microtubule onderzocht. Dat de lengte van de microtubule trajecten zou Voor een grotere nauwkeurigheid in persistentielengte metingen.
Een tweede beperking van deze methode is de eis dat gebiotinyleerde kinesine-1 worden gebruikt voor specifieke aanhechting van kinesine aan objectglaasjes. Gebiotinyleerd kinesine moet worden gezuiverd (van E. Coli in ons geval), en kan niet zonder meer worden gekocht uit de kast. Echter, een gemodificeerde zweefvliegen test met behulp van ongebiotinyleerde kinesin worden gebruikt 28; kinesine zware keten eiwit dat geschikt zouden kunnen zijn voor deze techniek is commercieel verkrijgbaar bij cytoskelet (KR01). Het wijzigen van de zweefvliegen test om deze alternatieve kinesine gebruiken zou microtubuli buigstijfheid geen enkele invloed op, en op die manier in staat stellen groepen zonder toegang tot recombinant kinesine eiwitten om deze methode te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken Melissa Klocke voor hulp bereiden Figuur 1 en Anna Ratliff voor het aantonen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door de Research Corporation for Science Advancement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
