Summary
दृढ़ता लंबाई या biopolymers की flexural कठोरता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है. विधि एक microtubule kinesin संचालित ग्लाइडिंग परख का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक व्यक्ति सूक्ष्मनलिकाएं के हठ लंबाई निर्धारित और actin आधारित ग्लाइडिंग assays के लिए अनुकूल है.
Abstract
सूक्ष्मनलिकाएं cytoskeletal पॉलिमर जो कोशिका विभाजन में एक भूमिका निभाते हैं, सेल यांत्रिकी, और intracellular परिवहन कर रहे हैं. इन कार्यों में से प्रत्येक सूक्ष्मनलिकाएं कि कठोर और सीधे सेल व्यास का एक महत्वपूर्ण अंश अवधि के लिए पर्याप्त हैं की आवश्यकता है. एक परिणाम के रूप में, microtubule दृढ़ता लंबाई, कठोरता का एक उपाय है, सक्रिय रूप से किया गया है पिछले दो दशकों के लिए 1 का अध्ययन किया. बहरहाल, खुला प्रश्न बने हुए हैं: कम सूक्ष्मनलिकाएं 10-50 गुना कम लंबे समय के 2-4 सूक्ष्मनलिकाएं से कड़ी हैं, और भी लंबे सूक्ष्मनलिकाएं दृढ़ता लंबाई जो 5-9 परिमाण के एक आदेश के हिसाब से बदलती मापा है.
यहाँ, हम microtubule दृढ़ता लंबाई को मापने के लिए एक तरीका मौजूद है. विधि एक microtubule kinesin संचालित ग्लाइडिंग 10 परख के आधार पर है. व्यक्ति microtubule करने के लिए संलग्न fluorophores के एक कण ट्रैकिंग, glidin साथ व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं का विरल फ्लोरोसेंट लेबलिंग के संयोजनएकल सूक्ष्मनलिकाएं की छ trajectories नैनोमीटर स्तर सटीक के साथ ट्रैक कर रहे हैं. trajectories के हठ लंबाई microtubule के 11 प्रयोग किया जाता शर्तों के तहत दृढ़ता लंबाई के रूप में एक ही है. एक स्वचालित ट्रैकिंग दिनचर्या व्यक्ति सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़ी fluorophores से microtubule trajectories बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, और इस गति के हठ की लंबाई आईडीएल में लिखा दिनचर्या का उपयोग कर की गणना की है.
इस तकनीक को तेजी से कार्यान्वयन, और प्रयोग के एक दिन में 100 सूक्ष्मनलिकाएं के हठ की लंबाई को मापने के लिए सक्षम है. विधि के साथ सूक्ष्मनलिकाएं लंबाई के एक समारोह के रूप में दृढ़ता की लंबाई, सहित स्थितियों की एक किस्म के तहत दृढ़ता लंबाई को मापने के लिए बढ़ाया जा सकता है. इसके अलावा, विश्लेषण दिनचर्या मायोसिन आधारित अभिनय ग्लाइडिंग assays के लिए बढ़ाया जा सकता है, actin filaments के हठ की लंबाई उपाय के रूप में अच्छी तरह से.
Introduction
cytoskeleton, सबसे कोशिकाओं में पाया biopolymers के एक नेटवर्क, सेलुलर संगठन, intracellular परिवहन और यांत्रिकी सेल में एक भूमिका निभाता है. cytoskeleton (मुख्यतः actin और सूक्ष्मनलिकाएं) biopolymers की यांत्रिक विशेषताओं एक पूरे 12 के रूप में सेल के यांत्रिक विशेषताओं का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. चूंकि पूरे सेल यांत्रिकी स्वस्थ और रोगग्रस्त कोशिकाओं 13,14 विशेषताएँ और सेलुलर गतिशीलता 15 में शामिल है, अंतर्निहित cytoskeletal घटकों के यांत्रिक गुणों के अध्ययन के एक सक्रिय क्षेत्र पिछले दो दशकों के लिए 1 कर दिया गया है.
biopolymers के लचीलेपन (या जकड़न) हठ लंबाई, बहुलक की लंबाई लगभग एक कांति द्वारा परिवेश के तापमान में उतार चढ़ाव थर्मल के तहत झुकता जो विशेषता है. तकनीकों का एक नंबर के लिए हठ 16 examp के लिए लंबाई मापने के लिए विकसित किया गया हैले सक्रिय तकनीकों जो hydrodynamic प्रवाह, ऑप्टिकल जाल, या बिजली क्षेत्रों 4,17,18, और निष्क्रिय तकनीक है जो उपाय 5,6 समाधान में मुक्त पॉलिमर के उतार चढ़ाव का उपयोग बहुलक झुकने शामिल है. सक्रिय माप, तथापि, विशेष setups सुक्ष्ममापी पैमाने पर जाना बलों को लागू करने के लिए आवश्यकता होती है, और मुक्त अस्थिरता माप इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी के ध्यान के विमान के प्रसार की वजह से चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
इस अनुच्छेद में, हम एक पूरक, निष्क्रिय, सूक्ष्मनलिकाएं का दृढ़ता लंबाई, एक cytoskeletal बहुलक को मापने के लिए तकनीक का वर्णन करता है. तकनीक ग्लाइडिंग assays शामिल है, जो यह सुनिश्चित करें कि बहुलक फोकल 19 विमान में हमेशा रहता है. इसके अलावा, यह ट्रैकिंग भी ब्याज की बहुलक के लिए स्थायी रूप से संलग्न fluorophores, इसलिए कि बहुलक के साथ विशिष्ट स्थानों अच्छी तरह से विशेषता शामिल है.
Figur पद्धति का एक कार्टून में दिखाया गया है1 ए. Kinesin + सूक्ष्मनलिकाएं के अंत की ओर विशेष रूप से चलता है, तो एक ग्लाइडिंग परख में सूक्ष्मनलिकाएं unidirectionally प्रेरित कर रहे हैं. microtubule के अग्रणी अंत, पिछले संलग्न kinesin परे, आसपास के समाधान के थर्मल बलों के तहत उतार चढ़ाव के लिए स्वतंत्र है. के रूप में microtubule आगे चालित है, अंत fluctuates एक नया kinesin अणु गिलास स्लाइड के साथ आगे बंधन तक एक भी अस्थिरता में जमा देता है. क्योंकि kinesin सूक्ष्मनलिकाएं बहुत दृढ़ता से देता है, microtubule अग्रणी अंत का रास्ता का पालन करने के लिए विवश है. इसलिए, सांख्यिकीय microtubule प्रक्षेपवक्र में जमे हुए उतार - चढ़ाव 11 सूक्ष्मनलिकाएं के मुक्त अंत के सांख्यिकीय उतार चढ़ाव के रूप में एक ही कर रहे हैं, और इसलिए 20 के अनुसार दृढ़ता लंबाई की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
θ है, जहां पी एल microtubule के हठ की लंबाई है एक समोच्च लंबाई एस द्वारा अलग प्रक्षेपवक्र उभयनिष्ठ के बीच कोण है, और <> का अर्थ है एक समोच्च लंबाई एस द्वारा अलग पदों के सभी जोड़ों पर एक औसत.
ग्लाइडिंग परख ही coiled कुंडल 21 में विशेष रूप से streptavidin-बायोटिन एक कड़ी के माध्यम से गिलास स्लाइड के लिए बाध्य kinesin biotinylated का उपयोग करता है. यह लगाव सुनिश्चित करता है कि मोटर डोमेन बाध्य करने के लिए और प्रेरित करना सूक्ष्मनलिकाएं के लिए स्वतंत्र हैं. आदेश में microtubule trajectories का पालन करने के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं कम जैविक 22,23 fluorophores साथ चिह्नित कर रहे हैं - लेबल काफी विरल है कि एकल fluorophores एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग रिजॉल्वेबल होना चाहिए. एकल fluorophores छवि विश्लेषण आईडीएल में लिखा दिनचर्या का उपयोग ट्रैक कर रहे हैं. प्रत्येक की fluorophore trajectories एक दिया mic करने के लिए बाध्यएक समग्र microtubule स्वचालित रूप से 24 प्रक्षेपवक्र में rotubule संयुक्त रहे हैं. स्पर्शरेखा एक प्रक्षेपवक्र साथ प्रत्येक बिंदु θ कोण की गणना कर रहे हैं, इन स्पर्शरेखा कोणों से <cosθ> मूल्य प्रत्येक समोच्च लंबाई एस के लिए गणना की है. अंत में, इन आंकड़ों Eq के लिए फिट हैं. 1 क्रम में एक दिया microtubule के लिए एक हठ लंबाई निकालने या एक ही ग्लाइडिंग परख में कई सूक्ष्मनलिकाएं के लिए.
विधि स्थितियों की एक विस्तृत विविधता (अलग स्थिर एजेंट या अन्य छोटे अणुओं microtubule बाध्य microtubule जुड़े प्रोटीन (नक्शे), के साथ या चिपचिपा समाधान की एक किस्म के साथ, बाध्य के साथ) में तैयार सूक्ष्मनलिकाएं साथ काम काफी मजबूत है. हमारी प्रयोगशाला में इस तकनीक सूक्ष्मनलिकाएं का हठ लंबाई विशेषताएँ विभिन्न एजेंटों के साथ स्थिर और सूक्ष्मनलिकाएं, सूक्ष्मनलिकाएं साथ लंबाई के एक समारोह के रूप में इस्तेमाल किया गया है. मुख्य प्रतिबंध सूक्ष्मनलिकाएं अभी भी चाहिए है किupport kinesin गतिशीलता. चूंकि kinesin एक मजबूत मोटर एंजाइम है, यह एक काफी ढीला प्रतिबंध है. Actin और kinesin के साथ एक मायोसिन परिवार एंजाइम के साथ सूक्ष्मनलिकाएं की जगह तक, actin के हठ लंबाई उसी तकनीक का उपयोग मापा जा सकता है.
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Protocol
1. Microtubule ग्लाइडिंग परख स्टॉक Solutions
ग्लाइडिंग परख के आगे तैयार.
- 0.5 मिलीग्राम कम उज्ज्वल जैविक fluorophore 22 के साथ लेबल सूक्ष्मनलिकाएं polymerize. लक्ष्य लेबल एकाग्रता microtubule के सुक्ष्ममापी प्रति 1 fluorophore, या 1500 ट्यूबिलिन dimers प्रति लगभग 1 की fluorophore लेबलिंग घनत्व है. कमरे के तापमान, प्रकाश में स्टोर दो सप्ताह तक के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ रक्षा की.
- लगभग 1 सुक्ष्ममापी पर 21 बायोटिन kinesin शुद्ध. -80 पर स्टोर ° सी अलग - अलग प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए 5 μl aliquots में.
- परख बफर 50 मिमी imidiazole की (एबी), 50 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl), 4 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (2 MgCl), 2 मिमी इथाइलीन ग्लाइकॉल tetraacetic (EGTA) एसिड, पीएच 6.7 तैयार करो. बाँझ फिल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
- Biotinylated गोजातीय सीरम albumin (बायोटिन-BSA) 2 मिलीग्राम / एबी में मिलीलीटर भंग. 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर.-80 पर स्टोर ° लंबी अवधि के लिए 100 μl aliquots में सी, 4 डिग्री सेल्सियस एक महीने के लिए.
- एबी में 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर streptavidin (एसए) को भंग. 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर. -80 पर स्टोर ° लंबी अवधि के लिए 20 μl aliquots में सी, 4 सी ° दो सप्ताह तक के लिए.
- 5 मिलीग्राम / एबी में मिलीलीटर α कैसिइन भंग. 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर. -80 पर स्टोर ° सी लंबी अवधि के लिए 100 μl aliquots में, 4 बजे ° दो सप्ताह तक के लिए सी.
- विआयनीकृत जल में 200 मिमी (डीटीटी) dithiothreitol भंग. -20 डिग्री सेल्सियस में 100 μl aliquots में स्टोर, विगलन के 8 घंटे के भीतर का उपयोग करें. Refrozen किया जा सकता है.
- HPLC ग्रेड डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 4 मिमी, Paclitaxel (पीटी) को भंग. -80 में 10 μl aliquots में स्टोर ° C दीर्घकालिक, -20 ° C अल्पकालिक. विगलन के 8 घंटे के भीतर प्रयोग करें. Refrozen किया जा सकता है.
- 120 मिलीग्राम / एमएल विआयनीकृत पानी में ग्लूकोज भंग. -20 डिग्री सेल्सियस में 100 μl aliquots में स्टोर Refrozen किया जा सकता है.
- जिलेविआयनीकृत जल में 150 मिमी, पीएच 7.0 adenosine triphosphate (एटीपी) को हल. 5 μl aliquots में -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस, विगलन के 8 घंटे के भीतर का उपयोग करें.
- 100x ऑक्सीजन सफाई स्टॉक 600 μl कुल परख बफर में catalase 10,000 इकाइयों ग्लूकोज oxidase और 156.000 इकाइयों को भंग द्वारा 25 तैयार करो. गोली ठोस करने के लिए एक microcentrifuge में संक्षिप्त अपकेंद्रित्र, 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ फिल्टर तैरनेवाला. -80 पर स्टोर ° लंबी अवधि के लिए 10 μl aliquots में सी, 4 डिग्री सेल्सियस एक सप्ताह तक के लिए.
2. Microtubule ग्लाइडिंग परख, उसी दिन समाधान तैयारी
2.1-2.6 में प्रयोग के दिन पर समाधान तैयार करो. अभ्यास के साथ, 2.2-2.6 समाधान प्रवाह सेल वाशिंग के दौरान तैयार किया जा सकता है. जब तक अन्यथा नोट, बर्फ पर शेयर समाधान रखने.
- डीटीटी स्टॉक के 10 μl (2 मिमी डीटीटी के साथ एबी) के साथ अटल बिहारी, परख बफर के 1 मिलीलीटर तैयार. कमरे के तापमान पर रखें.
- जैव BSA बफर, 40 और म्यू तैयार करेंबायोटिन BSA शेयर और एबी के एक 1:1 मिश्रण के एल. कमरे के तापमान पर रखें.
- BSA बफर, 5.5 μl BSA (1 मिलीग्राम एबी / मिलीलीटर BSA) के साथ अटल बिहारी के 645 μl मिश्रण तैयार है. कमरे के तापमान पर रखें.
- SA बफर तैयार, 3 μl streptavidin शेयर (0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर streptavidin एबी में) के साथ अटल बिहारी की 57 μl मिश्रण. कमरे के तापमान पर रखें.
- Α-कैसिइन बफर तैयार, बीएसए बफर, 50 μl कैसिइन स्टॉक और 15 सुक्ष्ममापी एटीपी (1 मिलीग्राम / α-कैसिइन मिलीलीटर, 0.8 मिलीग्राम / मिलीलीटर बीएसए, एबी में 50 एनएम एटीपी) के 0.8 μl 200 μl मिश्रण. कमरे के तापमान पर रखें.
- प्रतिदीप्ति बफर विरोधी ब्लीच तैयार, 95 μl बफर α कैसिइन, 2.5 μl ग्लूकोज स्टॉक, 1 μl 100x ऑक्सीजन सफाई मिश्रण 1 μl Paclitaxel के स्टॉक, 1 μl 2 mercaptoethanol (βME) मिश्रण. धूआं हुड के के तहत βME जोड़ें. तैयारी के 1 घंटे के भीतर प्रतिदीप्ति बफर विरोधी ब्लीच का प्रयोग सावधानी: βME बेहद जहरीला है और भयंकर बदबू आ रही है. धूआं हुड के नीचे ही खोलने के लिए सुनिश्चित हो. स्टोर में बोतलप्रकाश का अभाव, प्रकाश degrades βME और उसके photobleaching को कम करने की क्षमता है.
3. Microtubule ग्लाइडिंग परख
- एक 24 x 60 मिमी coverslip और 22 x 22 मिमी coverslip के बीच चार प्रवाह गलियों वैक्यूम तेल का उपयोग करते हुए, एक विंदुक टिप के माध्यम से एक सिरिंज से extruded एक स्पेसर के रूप में, के बारे में निर्माण. प्रत्येक प्रवाह लेन मात्रा में लगभग 10 μl (पैमाने पर बाद के संस्करणों के अनुसार) होना चाहिए.
- प्रत्येक गली में जैव BSA बफर के 10 μl से धो लें. 5 मिनट सेते BSA सतहों कांच कोट करने के लिए अनुमति देते हैं.
- प्रत्येक लेन 15 μl BSA बायोटिन BSA मुक्त हटाने बफर के साथ तीन बार धोएं, जबकि स्लाइड सतह ब्लॉक करने के लिए जारी है. एक Kimwipe या फिल्टर पेपर का उपयोग करने के लिए प्रवाह चैम्बर के विपरीत दिशा से बफर हटाने, हवाई बुलबुले प्रवाह कक्ष के माध्यम से जाने के लिए करने की अनुमति नहीं करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है.
- प्रत्येक गली में 15 μl एसए बफर धो लें. 10 मिनट, या 2 घंटा रुको. streptavidin सतह बाध्य बायोटिन BSA के लिए बाध्य होगा.
- प्रत्येक लेन 15 μl BSA बफर के साथ तीन बार धोएं मुक्त एसए को दूर करते हुए स्लाइड सतह ब्लॉक जारी.
- 15 μl बफर α कैसिइन साथ प्रत्येक लेन धो लें. α-कैसिइन आगे कांच kinesin की गैर विशिष्ट बंधन और सूक्ष्मनलिकाएं ब्लॉक में मदद करता है.
- Α-कैसिइन बफर में 10 एनएम kinesin पतला और इस kinesin के 15 μl के साथ प्रत्येक लेन धोने α-कैसिइन समाधान. Biotinylated kinesin (या एक घंटे के लिए) के लिए 15 मिनट रुको streptavidin सतह बाध्य करने के लिए विशेष रूप से बाँध. kinesin मोटर डोमेन बाँध सूक्ष्मनलिकाएं के लिए नि: शुल्क रहेगा.
- कमरे के तापमान में 40 सुक्ष्ममापी बफर α कैसिइन Paclitaxel, पतला, और इस समाधान के 15 μl के साथ प्रत्येक लेन धोने के लिए बाहर मुक्त kinesin धोने और एक Paclitaxel के depolymerizing से सूक्ष्मनलिकाएं को रोकने के समाधान के साथ प्रत्येक प्रवाह चैम्बर पूर्व लोड. ठंडा भी सूक्ष्मनलिकाएं depolymerizes, तो कमरे के तापमान पर कमरे temperatu साथ यकीन है कि इन चरणों का होसमाधान कर रहे हैं.
- जलमिश्रित fluorescently प्रतिदीप्ति बफर विरोधी ब्लीच में 1 मिमी एटीपी सूक्ष्मनलिकाएं 1:100-1:1,000 के साथ लेबल. एक गली में 15 μl धो और 30 मिनट के भीतर (नियम आदि का) पालन करना.
4. डेटा संग्रह
- सूक्ष्मनलिकाएं ग्लाइडिंग निरीक्षण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, एक एक वाणिज्यिक या घर के निर्माण TIRF सेटअप के रूप में एक fluorophores को हल करने में सक्षम खुर्दबीन 26 (2 चित्रा) की आवश्यकता है.
सूक्ष्मनलिकाएं kinesin मोटर्स द्वारा सब्सट्रेट पर पहुंचाया जाएगा लगभग 0.5 सुक्ष्ममापी / s तापमान पर निर्भर करता है. यदि खुर्दबीन के क्षेत्र का दृश्य 50 सुक्ष्ममापी है, व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं लगभग 100 सेकंड के लिए दिखाई होना चाहिए. रोशनी तीव्रता सेट इतना है कि एक, fluorophores अधिक 100 सेकंड की तुलना में जल्दी नहीं photobleach. लेजर उत्तेजना का उपयोग अगर, लगभग 3-5 मेगावाट की बिजली की सेटिंग उपयुक्त है. - विश्लेषण के लिए छवियों के दृश्यों ले लीजिए. 600 पर छवियोंहर्ट्ज 5 (2 मिनट कुल) अच्छी तरह से काम करता है. लंबे समय पर्याप्त है कि सूक्ष्मनलिकाएं पूरे क्षेत्र का दृश्य पार दृश्यों का उपयोग करें.
5. डेटा विश्लेषण
आईडीएल दिनचर्या, get_lp.pro , जुड़ा हुआ है. यह दिनचर्या एक हठ लंबाई एक दिया छवि अनुक्रम में सभी सूक्ष्मनलिकाएं ग्लाइडिंग पर आधारित मूल्य देता है. या तो प्रत्येक छवि अनुक्रम पर इस दिनचर्या को चलाने के लिए, तीव्रता मापदंडों अपने विशेष माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर संशोधित, या निम्न कार्य करें:
- प्रत्येक एक fluorophore trajectories बनाने microtubule जुड़े fluorophore हुए.
- (3 चित्रा) छवि अनुक्रम में प्रत्येक microtubule के लिए दोहराने; एक समग्र microtubule प्रक्षेपवक्र में एक दिया microtubule पर सभी fluorophores के trajectories जुडा.
- प्रक्षेपवक्र साथ प्रत्येक बिंदु के लिए स्पर्श कोण (4 चित्रा) की गणनाऔर गणना <cos θ> Eq में. एक पथ लंबाई से अलग अंक (5 चित्रा) के हर जोड़ी के लिए अंतर कोण की कोज्या औसत से 1. एक या सूक्ष्मनलिकाएं की microtubule समूह के लिए θ> Eq फिटिंग <cos द्वारा हठ लंबाई खोजें. 1, भार कि औसत की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि θ स्वतंत्र मूल्यों की संख्या से फिट में व्यक्तिगत डेटा अंक.
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Representative Results
एक ग्लाइडिंग परख से एक स्नैपशॉट चित्रा 2 में दिखाया गया है. एक अच्छा microtubule घनत्व देखने के क्षेत्र के प्रति 1-10 सूक्ष्मनलिकाएं है, अधिक काफी mistracking में परिणाम के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं एक दूसरे के पार जाएगा. 2 चित्रा में ग्लाइडिंग परख से 11 microtubule trajectories के एक भूखंड चित्रा 3 में दिखाया गया है. विशिष्ट trajectories 10 से 30 मीटर लंबे होते हैं, कुछ trajectories अंतराल है जहां एक microtubule दूसरे पार. इन trajectories के विश्लेषण से त्याग किया जा सकता है.
एक एकल, लंबे microtubule प्रक्षेपवक्र प्रक्षेपवक्र साथ दो पदों पर उदाहरण के लिए स्पर्शरेखा कोण के साथ चित्रा 4A में दिखाया गया है. स्पर्शरेखा एक निश्चित दूरी से अलग कोण के बीच अंतर दृढ़ता लंबाई से संबंधित है, microtubule प्रक्षेपवक्र साथ स्थिति के एक समारोह के रूप में स्पर्शरेखा कोण 4B चित्र में दिखाया गया है.
स्पर्शरेखा कोण डेटाकई microtubule trajectories से एक भी प्रयोग में सभी सूक्ष्मनलिकाएं के लिए एक एकल हठ लंबाई की गणना करने के लिए संयुक्त चित्रा 5 चित्रा 2 ग्लाइडिंग परख के लिए <cos θ> बनाम समोच्च लंबाई एस के एक भूखंड से पता चलता है. बड़े समोच्च लंबाई मूल्यों, θ क्योंकि बहुत कुछ मूल्यों मापा जाता है, इसलिए औसत अत्यधिक परिवर्तनशील है. भारित फिट कम है के अनुरूप है, उच्च परिशुद्धता से अधिक बारीकी से लंबी है, डेटा, कम सटीक डेटा.
इन 11 trajectories से दृढ़ता लंबाई 500 ± 40 सुक्ष्ममापी (± मतलब की मानक त्रुटि), की मूल्य अपेक्षाकृत कम 2 सूक्ष्मनलिकाएं के लिए हठ लंबाई के प्रतिनिधि है. इसी तरह के प्रयोगों सुक्ष्ममापी 300 और 1,000 के बीच दृढ़ता लंबाई की एक सीमा दे.
समस्या निवारण
यदि सूक्ष्मनलिकाएं पूरी तरह से अनुपस्थित, increase कदम में सूक्ष्मनलिकाएं की एकाग्रता 3.9 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर. यदि सूक्ष्मनलिकाएं अभी भी लापता हैं, फिर से भाजन सूक्ष्मनलिकाएं. यकीन है कि, Paclitaxel प्रत्येक समाधान में मौजूद है सूक्ष्मनलिकाएं में पतला कर रहे हैं, अन्यथा सूक्ष्मनलिकाएं depolymerize जाएगा.
यदि सूक्ष्मनलिकाएं समाधान में आसानी diffusing लेकिन सतह के लिए बाध्य नहीं कर रहे हैं, 3.7 चरण में kinesin एकाग्रता बढ़ाने के लिए और एएमपी PNP एटीपी के बजाय का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें kinesin सूक्ष्मनलिकाएं irreversibly बांधता. यदि सूक्ष्मनलिकाएं अभी भी नहीं बाँध, नई streptavidin स्टॉक और बफर, नया बफर बायोटिन-BSA द्वारा पीछा कर सकते हैं. अंत में, नए biotinylated kinesin शुद्ध.
यदि सूक्ष्मनलिकाएं बाइंड करने के लिए, लेकिन हिलना मत, ताजा एटीपी के साथ एटीपी स्टॉक समाधान की जगह.
यदि fluorophores के भी जल्दी photobleach, रोशनी तीव्रता को कम. यदि fluorophores अभी भी बहुत जल्दी photobleach ताजा स्टॉक के साथ ऑक्सीजन सफाई प्रणाली की जगह.
यदि fluorophoजोड़कर भी मंद कर रहे हैं, रोशनी की तीव्रता में वृद्धि.
चित्रा 1 microtubule ग्लाइडिंग परख के कार्टून. Kinesin एंजाइमों बायोटिन-streptavidin उठाना द्वारा विशेष रूप से एक coverslip करने के लिए बाध्य कर रहे हैं. सूक्ष्मनलिकाएं कम जैविक fluorophores के साथ लेबल रहे हैं. एटीपी के अलावा पर, सूक्ष्मनलिकाएं kinesin मोटर्स द्वारा धकेल रहे हैं. microtubule के अग्रणी मुक्त अंत समाधान में थर्मल बलों कारण उतार चढ़ाव होता रहता है, इन उतार चढ़ाव microtubule दृढ़ता लंबाई की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन प्रयोगों द्वारा जांच microtubule की लंबाई पैमाने मुक्त अंत की लंबाई है.
चित्रा 2 एक ग्लाइडिंग परख के विशिष्ट सूक्ष्मदर्शी स्नैपशॉट, TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लिया. Microtu bules कम एकल fluorophores के साथ सजाया जाता है. पैमाने बार 5 सुक्ष्ममापी है.
चित्रा 3 छवि अनुक्रम से microtubule trajectories चित्रा 2 में दिखाया गया है. प्रत्येक microtubule प्रक्षेपवक्र कई एकल fluorophore trajectories (औसतन 10) के बारे में जोड़ती है, और 100 एनएम प्रति एक बिंदु thinned किया गया है.
चित्रा 4 एक प्रक्षेपवक्र स्पर्श करने के कोण की गणना. (ए) एक microtubule के उदाहरण स्पर्शरेखा (θ) कोण दिखाया के साथ, प्रक्षेपवक्र. (बी) microtubule प्रक्षेपवक्र साथ स्थिति के एक समारोह के रूप में स्पज्या कोण. इन आंकड़ों को औसत Eq में इस्तेमाल कोण की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. 1.
चित्रा 5 स्पर्शरेखा कोणों से दृढ़ता लंबाई की गणना. 11 3 चित्र में दिखाया लिए trajectories (डॉट्स) <cos θ> बनाम समोच्च लंबाई का प्लॉट. (ठोस लाइन) में फ़िट Eq. 1. सूक्ष्मनलिकाएं के इस समूह के लिए, हठ लंबाई 500 ± 40 सुक्ष्ममापी है. लंबे समय के समोच्च लंबाई (10 सुक्ष्ममापी या तो ऊपर) के लिए, डेटा सीमित के आँकड़ों के कारण अत्यधिक चर रहे हैं.
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Discussion
हठ लंबाई माप व्यक्ति biopolymers के यांत्रिक गुणों का एक अच्छा लक्षण वर्णन कर रहे हैं. इस अनुच्छेद में, हम सूक्ष्मनलिकाएं का हठ लंबाई मापने की एक विधि का वर्णन किया है. इस विधि के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, ग्लाइडिंग परख, 3.9, के अंतिम चरण में अभिकर्मकों, तापमान, दलदलापन या अलग से बस या polymerizing सूक्ष्मनलिकाएं, 1.1 कदम द्वारा आसानी से स्थितियों की एक किस्म में microtubule यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए बढ़ाया है, विभिन्न शर्तों के तहत.
तकनीक ही प्रदर्शन करने के लिए जल्दी है. एक बार शेयर समाधान समय (1 कदम) के आगे तैयार किया गया है, एक ग्लाइडिंग परख प्रयोग 2-3 घंटे में किया जा सकता है, एक एकल खुर्दबीन स्लाइड पर चार शर्तों में बदलाव (3.1 चरण में चार लेन) सहित. कई सूक्ष्मनलिकाएं प्रत्येक प्रयोग में जांच की जा सकती है, हमारी प्रयोगशाला में प्रयोगों ठेठ हालत प्रति 100 सूक्ष्मनलिकाएं (के बारे में 10 छवि sequenc की जांचअनुक्रम प्रति 10 सूक्ष्मनलिकाएं) के साथ लेन प्रति तों. बड़े डेटा सेट का विश्लेषण इसी तरह काफी जल्दी है. अभ्यास के साथ, 10 छवि दृश्यों दृढ़ता लंबाई के लिए एक आधुनिक पीसी के साथ एक या तो दोपहर में विश्लेषण किया जा सकता है. दर सीमित विश्लेषण में कदम व्यक्ति fluorophores को ट्रैक करने के लिए समय है, नए ट्रैकिंग पद्धतियाँ इस गति 27 काफी वृद्धि वादा करता हूँ.
क्योंकि विधि एकल एक दिया microtubule जुड़ी fluorophores ट्रैकिंग शामिल, ट्रैकिंग की शुद्धता ही फोटॉन संग्रह द्वारा सीमित है, और 22 नैनोमीटर, 25 के पैमाने पर किया जा सकता है. कई fluorophores से डेटा सहित, सटीक और सुधार हुआ है. संभवतः भी उच्च परिशुद्धता बहुत उज्ज्वल फ्लोरोसेंट वस्तुओं, क्वांटम डॉट्स के रूप में संलग्न microtubule द्वारा पहुंचा जा सकता है.
जबकि व्यक्तिगत trajectories के सटीक काफी अच्छा है, हठ ले में अनिश्चितताइस तकनीक (एक एकल microtubule के लिए ± 50% के पैमाने पर) के साथ मापा ngths अभी भी महत्वपूर्ण है. दृढ़ता लंबाई माप की शुद्धता में प्रमुख सीमा क्योंकि θ औसत में शामिल किए गए आँकड़ों है. अंक, एस, बढ़ जाती है की जोड़ी के बीच समोच्च लंबाई के रूप में, θ है स्वतंत्र माप की संख्या घटने के रूप में एल / s, जहां एल microtubule प्रक्षेपवक्र की लंबाई है अध्ययन. Microtubule trajectories की लंबाई बढ़ाने दृढ़ता लंबाई माप में सुधार परिशुद्धता के लिए अनुमति होगी.
इस विधि के लिए एक दूसरे सीमा की आवश्यकता है कि biotinylated kinesin 1 kinesin के विशिष्ट खुर्दबीन स्लाइड लगाव के लिए इस्तेमाल किया जा है. Biotinylated kinesin हमारे मामले में ई. कोलाई से शुद्ध होना चाहिए, और बंद नहीं किया जा सकता है बस शेल्फ खरीदा. हालांकि, एक बार संशोधित ग्लाइडिंग परख unbiotinylated परिजनों का उपयोगesin 28 इस्तेमाल किया जा सकता है, kinesin भारी श्रृंखला प्रोटीन जो इस तकनीक के लिए उपयुक्त हो सकता है cytoskeleton (KR01) से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है. ग्लाइडिंग परख को संशोधित करने के लिए इस वैकल्पिक kinesin का उपयोग किसी भी तरह से microtubule flexural कठोरता को प्रभावित नहीं है, और इस तरह रीकॉम्बीनैंट kinesin प्रोटीन के लिए उपयोग के बिना समूहों के लिए इस विधि का उपयोग करने में सक्षम होगा.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
हम सहायता प्रोटोकॉल प्रदर्शन के लिए तैयार करने के लिए चित्रा 1 और अन्ना Ratliff मेलिस्सा KLOCKE धन्यवाद. इस काम के लिए एडवांसमेंट विज्ञान अनुसंधान निगम द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
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