Summary
Vi har udviklet en selvstændig flydende celle, som muliggør billeddannelse gennem væsker ved brug af et transmissionselektronmikroskop. Dynamiske processer i nanopartikler i væsker kan blive afsløret i realtid med sub-nanometer opløsning.
Abstract
Den seneste udvikling for in situ transmissionselektronmikroskopi, som giver billeddannelse gennem væsker med høj rumlig opløsning, har tiltrukket betydelige interesser på tværs af forskningsfelter materialevidenskab, fysik, kemi og biologi. Den nødvendig teknologi er en flydende celle. Vi fabrikere flydende celler med tynde visning windows gennem en sekventiel microfabrication proces, herunder siliciumnitrid membran deposition, fotolitografisk mønstring, wafer ætsning, celle limning osv. En flydende celle med dimensionerne af en regelmæssig TEM gitter der passer i ethvert standard TEM prøveholderen . Omkring 100 nanoliter reaktionsopløsning fyldes i reservoirerne og omkring 30 picoliter væske suges ind i visningsvinduer ved kapillær kraft. Derefter cellen forseglet og anbragt i et mikroskop til in situ billeddannelse. I TEM, går elektronstrålen gennem det tynde væskelag indlagt mellem to siliciumnitrid membraner. Dynamisk proccesser af nanopartikler i væsker, såsom nukleær og vækst af nanokrystaller, diffusion og samling af nanopartikler, osv., er blevet afbildet i realtid med sub-nanometer opløsning. Vi har også anvendt denne metode til andre forskningsområder, f.eks billeddannende proteiner i vand. Flydende celle TEM er klar til at spille en vigtig rolle i afsløringen dynamiske processer af materialer i deres arbejdsmiljø. Det kan også medføre stor virkning i studiet af biologiske processer i deres naturlige miljø.
Introduction
Studiet af kemiske reaktioner i væsker i realtid og billedbehandling biologiske materialer i deres eget miljø har været af betydelige interesser på tværs af forskningsområder 1-5. På grund af den høje rumlige opløsning transmissionselektronmikroskopi (TEM), billeddannelse gennem væsker ved brug TEM har tiltrukket en masse opmærksomhed 4,5. Imidlertid har det været en stor udfordring til billede flydende prøver ved anvendelse af TEM, eftersom den konventionelle mikroskop anvendes i et højvakuum miljø. Desuden har flydende prøver at være tynd nok til at tillade elektronstrålen at gå igennem. Williamson et al. Seks rapporterede, at billeddannelse af elektrokemisk deponering af Cu kan opnås med 5 nm opløsning ved hjælp af en elektrokemisk flydende celle betjenes i et TEM. De Jonge et al. 1 var i stand til at afbilde biologiske prøver gennem statusindikatorer mikrometer tyk vand ved hjælp af en scanning (S) TEM. Den lave kontrast for de biologiske prøver var ikkerejst som et problem, da guld nanopartikler blev brugt som markører for billeddannelse. Den tykke flydende prøve var ikke et problem enten siden STEM billedbehandlingstype blev brugt og nanometer opløsning blev opnået. Vi har for nylig udviklet en selvstændig flydende celle, som giver real tid TEM billeddannelse af kolloide nanopartikler i væsker med subnanometer opløsning 5,7. Disse nyudviklede flydende celler, som tilbyder forbedret opløsning og hurtigere TEM imaging (30 frames per sekund, der ikke er opnået med høj opløsning STEM billeddannelse), gjort det muligt at studere kolloide nanopartikel dynamik i væsker. De flydende celler passer i en standard TEM holder og kan betjenes som almindelige TEM prøver. En lille mængde væske (ca. 30 picoliters) kan undersøges in situ under en udvidet kemisk reaktion. Forskellige billedbehandling og analytisk (dvs. energi-dispersiv X-ray spektroskopi) teknikker kan anvendes. Da den samlede tykkelse af ruden (herunder membranerog væskelaget) kan styres til 100 nm og derunder, har direkte billeddannelse af biologiske prøver (dvs. proteiner) i flydende vand uden guld nanopartikel markører også blevet opnået 8.
I de seneste to årtier har der været betydelige resultater på synteser og anvendelser af kolloide nanokrystaller 9-11. Men forståelsen af, hvordan nanopartikler nucleate, vokse og interagerer med hinanden i væsker er stort set empirisk og hovedsagelig baseret på ex situ analyser 11-13. Vores udvikling af flydende celle TEM giver en unik platform til at studere de dynamiske processer af nanopartikler i væsker in situ 5,7,14,15.
Vi fremstille en selvstændig flydende celle ved anvendelse af ultratynde siliciumskiver (100 um) ved en sekventiel microfabrication proces. Det omfatter aflejring af siliciumnitrid membran, fotolitografisk mønstring, wafer ætsning, spacer aflejring, og cellebinding, er osv. Ca. 50 nanoliter af reaktionsopløsningen fyldt i et reservoir, som trækkes ind i cellen ved kapillær kraft. Vi fylder det andet reservoir med yderligere 50 nanoliter af væsken. Derefter cellen forseglet og fyldt i mikroskopet til in situ-imaging. Inde i mikroskopet, klemt væsken mellem to siliciumnitrid membraner (samlet omkring 30 picoliter) kan undersøges. Når elektronstrålen passerer gennem det tynde væskelag, kan dynamiske processer af nanopartikler i væsker monitoreres i realtid. Nukleering og vækst af nanopartikler kan induceres af elektronstrålen i nogle tilfælde 5,7 eller reaktioner kan udløses af en ekstern varmekilde 14,16. Når elektronstrålen tab er af interesse, bør lav elektronstråle strøm (dosis) anvendes.
Da flydende-celler er fremstillet af silicium microfabrication processer og i store partier, variationer i membranen eller væsketykkelse mellem individuelle flydende celler kan være smal L6. Enhver forsker, der har grundlæggende microfabrication træning kan med held lave flydende celler. Den flydende håndtering teknik og in situ TEM operation kan også beherskes efter praksis. Det bemærkes, at udover anvendelse af siliciumnitrid membraner som visningsvinduer, kan andre materialer, såsom siliciumdioxid, silicium eller carbon (herunder graphene) anvendes som membranen vinduet samt 17-19. Da vores flydende celler under anvendelse af små visning vinduer, dvs, 1 x 50 um, uden udbuling af membranerne er observeret. Og det flydende celle er også robust at betjene, dvs under 1% af flydende celler har brudt vinduer under eksperimenterne. Desuden kan tykkelsen af væskelaget også fleksibelt indstilles ved at ændre tykkelsen af det afsatte indium spacer. Under prøveforberedelse, kan en forseglet væske celle opretholde væsker i flere dage uden lækage. Den lille mængde væske kanundersøges i adskillige timer under elektronstrålen, der tillader undersøgelse af en udvidet kemisk reaktion i realtid.
Hidtil har vi visualiserede mange unikke dynamiske processer af nanopartikler i væsker, for eksempel, vækst og sammensmeltning af Pt nanopartikler 5,15, diffusion af nanopartikler i tynde væsker 20,21, vækst udsving i Bi nanopartikler 14, og væksten af Pt 3 fe nanorods fra nanopartikel byggesten 7, osv. Desuden har vi også anvendt denne metode til andre områder, f.eks billedbehandling proteiner i flydende vand med 2,7 nm opløsning 8. Sammenfattende har vores flydende celle TEM teknik vist sig at være en meget værdifuld udvikling for studiet af en lang række grundlæggende spørgsmål i materialelære, fysik, kemi og biologi. Vi mener, at der stadig er stor plads til fremtidige tekniske fremskridt og anvendelser af den flydende TEM, og det vil helt sikkert være en stor IMPAct på et bredt spektrum af videnskabelige forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabrication af flydende celler
- Forbered siliciumskiver (p-doteret, 100 um i tykkelse og 4 tommer i diameter) og rense vafler anvendelse af en standard wafer bad rengøringsproceduren.
- Deposit lav-stress siliciumnitrid tynde film (20 nm i tykkelse) på begge sider af silicium wafers ved lavtryks kemisk dampafsætning (LPCVD) metoden. Et brugerdefineret udviklet opskrift anvendes til udfældning, som tillader væksten af silicium-rige nitrid (sin x, x <4/3).
- Fremstille nederste chip (2,6 x 2,6 mm, 3 mm i diameter) med et vindue (1 × 50 um) og den øverste chip (2,6 x 2,6 mm, 3 mm i diameter) med et vindue (1 × 50 um) og to reservoirer (0,6 × 1,2 × 0,1 mm) ved at følge en sekvens af standard fabrikation processer, herunder fotolitografisk mønsterdannelse, plasmaætsning af sin x membran (ved hjælp af SF 6 som den aktive gas), KOH våd etching af den eksponerede siliciumskiven, osv. Vi bruger den mest almindelige fotolitografisk proces, såsom spincoating af et fotoresist (positiv fotoresist med omdrejningstal på 3.000 rpm i 1 min; tykkelsen af fotoresisten er omkring 1 um), UV-eksponering under Cr maske af flydende celler, litografiske mønster ved hjælp af fremkalder og fixer (deioniseret vand), osv. Der er forskellige valg af fotoresisten for spin-coating og bygherren for mønster. Og kan de tilsvarende parametre for processerne også variere. Da træk ved mønsteret er forholdsvis store (hundrede um eller større), fremgangsmåden er let at opnås. The KOH-opløsning fremstilles ved opløsning af kaliumhydroxid strøm i deioniseret vand med kaliumhydroxid: vand vægtforhold på 01:02. The KOH-opløsning holdes ved 80 ° C under ætsning. En ætsningsproces på 1 um pr minut kan opnås. SiN x membran er en ideel beskyttende maske for KOH ætsning af silicium. Siden etching linier anvendes, er individuelle brikker forbindes med tynde linjer af ætset wafer efter KOH ætsning. Stykker af chips let kan adskilles fra skiven ved hjælp af skarpe pincet til efterfølgende processer. Nr. terninger er der behov.
- Deposit indium spacer på den flade side af den nederste chip. Først gøre litografiske mønster af chipsene ved at følge lignende proces i 1,3. For at hjælpe håndtering af chips, stick individuelle chips (kan være et stykke af flere chips) på en tynd glasplade med fotoresist og lad det lufttørre i 5 minutter før spincoating, UV eksponering osv. For det andet, skal du rense mønstrede chips ved O 2 plasmarensning ved 50 watt i 1 min; tredje deponering indium tynd film med en tykkelse på 100 nm på chippen under anvendelse af en fordamper, tredje, lift-off proces udføres for at generere indium spacer.
- Binding bunden og toppen chips sammen. Vi først tilslutter to siliciumnitrid visningsvinduer af bunden og toppen chips under et optisk microscoPE og anvende et tryk på omkring 0,1 MPa ved hjælp af en klemme. Det kræver praksis med henblik på præcist at justere vinduerne oven på hinanden. Efterfølgende er væsker celler bagt i en vakuumovn ved 120 ° C i 1 time. Endelig er vi opsamle cellerne og gemme som forberedte celler i en vakuumdesikkator til fremtidig brug.
Hele produktionsprocessen er vist i figur 1.. Vi gennemfører alle fremstillingsprocesser ved nanofabrikation Lab ved University of California, Berkeley.
2. Fremstilling af reaktionsopløsninger
Vi forbereder reaktionsopløsninger for vækst PT 3 Fe nanorods som et eksempel. Platin (II)-acetylacetonat (20 mg / ml) og jern (II)-acetylacetonat (20 mg / ml) blev opløst i en opløsningsmiddelblanding af pentadecan og oleylamin (7:3 vol / vol) eller en blanding af pentadecan, oleylamin, og oliesyre (06:03:01 vol / vol / vol) anvendes til sammenligning af surfactant virkninger.
3. Indlæse reaktionsopløsninger
- 50 nl af reaktionsopløsningen fyldes i et af reservoirerne i en flydende celle ved anvendelse af en sprøjte og Teflon nanorør (indkøbt fra Cole-Parmer, IL). Derefter bliver det andet reservoir fyldes på samme måde.
- Ca. 30 pl af reaktionsopløsningen trækkes ind i cellen ved kapillarkraft og danner et flydende lag (~ 100 nm) anbragt mellem to siliciumnitrid membraner i vinduet.
- Det flydende celle efterfølgende forsegles ved hjælp af en tynd kobber dæksel (~ 50 um TEM gitter med en enkelt slids 0,6 mm diameter hul, som blev indkøbt fra Tedd Pella, Inc.). Vakuum fedt blev påført på den ene side af dækslet og epoxy blev anvendt til at forsegle kanten af den flydende celle. Den totale tykkelse af den endelige flydende cellen er ca 250 til 300 um.
4. Indlæse Flydende celler i TEM
- En JEOL 3010 TEM drives ved 300 kV og en FEI monochromated F20 UT Tecnai drevet ved 200 kV anvendes til in situ billeddannelse.
- Det flydende celle er indlæst i mikroskopet som en standard TEM prøve til billeddannelse.
5. Real Time TEM Imaging
- Tune mikroskop til en perfekt høj opløsning TEM billeddannelse tilstand, og en strålestrøm densitet på 1-8 x 10 5 A / m 2 opretholdes under real-time imaging.
- For PTFE-system, kan nukleering og vækst af nanopartiklerne initieres ved at støbe en elektronstråle på væskelaget.
- VirtualDub software kombineret med Gatan DigitalMicrograph software er udnyttet til at optage nanopartikel dynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at bruge flydende celle TEM metoden, har vi visualiseret løsningen vækst i PT 3 Fe nanorods fra nanopartikel byggesten. Figur 2 viser sekventielle billeder skildrer den vækstforløb af en Pt 3 Fe nanorod i forskellige løsningsmodeller forhold. False farve proces ved hjælp af Photoshop blev ansat til at fremhæve de nanopartikler.
Når opløsningsmiddelblandingen i pentadecan og oleylamin (7:3 vol / vol) blev anvendt, kan tre forskellige stadier af vækst identificeres (figur 2A). For det første er mange små nanopartikler dannes, når Pt og Fe precursorer reduceres med elektronstråle-bestråling. Nogle af dem vokse med monomer vedhæftet fil, mens andre gennemgår koalescens. For det andet er korte nanopartikel kæder dannes via nanopaticle interaktioner. For det tredje som-dannede korte nanopartikler kæder fungerer som byggesten til at danne relativt lange snoede nanopartikel kæder. Når en blanding af pentadecan, oleylamin, og oliesyre (06:03:01 vol / vol / vol) blev anvendt, er snoede nanopartikel kæder dannes først, og derefter nanopartikel kæder glatte og danner en enkelt-krystallinske nanorods inden for en kort periode (figur 2B).
Sammenfattende har vi vist dannelsen af monokrystallinske nanorods via væksten af snoede polykrystallinsk nanopartikel kæder fra formen-rettet nanopartikel vedhæftet efterfulgt af glatning, orientering og form rettelser af de byggesten. Statistik og kvantificering af nanopartikler dynamik fra den real-time scanning er af stor betydning for forståelsen af og kontrol med hierarkiske nanomaterialer vækst og selvsamling for funktionelle udstyr 7.
Figur 1.
Figur 2. Væksten af Pt 3 fe nanorods i et flydende celle under udsættelse for elektronstrålen. (A) Sekventielle TEM-billeder viser udviklingen fra den første kernedannelse og vækst i den molekylære forstadieopløsningen på et senere stadium af nanowire dannelse af form-dirigeret nanopartikel fastgørelse. En opløsningsmiddelblanding af pentadecan og oleylamin (7:3 vol / vol) blev anvendt. (B) Dannelse af snoet Pt 3 Fe nanorods og den efterfølgende glatning processen. (A) Sekventiel TEM-billeder af væksten af en kort Pt 3 Fe nanorod. (B) Sekventielle TEM-billeder der viser væksten af en lang Pt 3 Fe nanorod. En opløsningsmiddelblanding af pentadecan, oleylamin og oliesyre (06:03:01 vol / vol / vol) blev anvendt. I både (A) og (B), er tiden vist som min: sek, og den første er vilkårligt 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle fremstillingsprocesser er blevet gjort i det rene rum, hvor halvlederkomponenter er lavet.
Før afsætning af indium, er O 2 plasma rensning af spånerne nødvendigt at fjerne den organiske rest på overfladen. Således kan en høj kvalitet indium spacer opnås, hvilket kan forbedre binding af øverste og nederste chips, og udbyttet af lækage frie flydende celler.
Siliciumnitrid visning vinduer med ultratynde, membrandannende på omkring 13 nm tykke er nøglen til at opnå høj rumlig opløsning. Ved håndtering af sådanne flydende celler, der særlig omhu nødvendig for at undgå at bryde membranen under fabrikation samt eksperimenter. For eksempel er pincet med en flad forreste anbefales. Og kan i løbet af membranen renseprocessen, lavt strømforbrug og dosis af O 2 plasma indarbejdes (dvs. 30 Walt i 20-30 sek.) Da vækstkinetik kan være meget afhængig af elektronstrålen valutaert densitet, opretholder den samme elektronstråle strømtæthed mens billeddannelse er vigtig. Den flydende celle TEM metoden ikke kun gør det muligt at studere vækstdynamik nanokrystaller i opløsning i realtid, men giver også mulighed for at afsløre andre dynamiske processer (dvs. diffusion af nanopartikler i væsker, flydende dråbe dynamik, osv.). Desuden giver det en lovende vej til at visualisere biologiske processer i det naturlige miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Zheng takker Prof. A. Paul Alivisatos og Dr. Ulrich Dahmen for personer diskussioner under den tidlige udvikling af EM flydende celler. Hun er taknemmelig for den støtte fra DOE Office of Science Early Career Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Platinum(II) acetylacetonate | Aldrich | 523038 | |
| Iron(II) acetylacetonate | Aldrich | 413402 | |
| pentadecane | Aldrich | P3406 | |
| oleylamine | Aldrich | O7805 | |
| oleic acid | Sigma | O4137 | |
| Equipment | |||
| TEM | JEOL | JEOL 3010 | |
| Monochromated TEM | FEI | F20 UT Tecnai | |
References
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nature Nanotechnology. 6, 695-704 (2011).
- Sun, Y. G. Watching nanoparticle kinetics in liquid. Mater. Today. 15, 140-147 (2012).
- Tao, F., Salmeron, M. In Situ Studies of Chemistry and Structure of Materials in Reactive Environments. Science. 331, 171-174 (2011).
- de Jonge, N., Poirier-Demers, N., Demers, H., Peckys, D. B., Drouin, D. Nanometerresolution electron microscopy through micrometers-thick water layers. Ultramicroscopy. 110, 1114-1119 (2010).
- Zheng, H., et al. Observation of Single Colloidal Platinum Nanocrystal Growth Trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nature Materials. 2, 532-536 (2003).
- Liao, H. -G., Cui, L., Whitelam, S. Real-Time Imaging of Pt3Fe Nanorod Growth in Solution. Science. 336, 1011-1014 (2012).
- Mirsaidov, U. M., Zheng, H., Casana, Y., Matsudaira, P. Imaging Protein Structure in Water at 2.7 nm Resolution by Transmission Electron Microscopy. Biophysical Journal. 102, L15-L17 (2012).
- Yin, Y. D., et al. Formation of hollow nanocrystals through the nanoscale Kirkendall Effect. Science. 304, 711-714 (2004).
- Kan, S., Mokari, T., Rothenberg, E., Banin, U. Synthesis and size-dependent properties of zinc-blende semiconductor quantum rods. Nature Materials. 2, 155-158 (1038).
- Peng, X. G., et al. Shape control of CdSe nanocrystals. Nature. 404, 59-61 (2000).
- Skrabalak, S. E., et al. Gold Nanocages: Synthesis, Properties, and Applications. Accounts of Chemical Research. 41, 1587-1595 (2008).
- Zhang, Q. B., Xie, J. P., Yang, J. H., Lee, J. Y. Monodisperse Icosahedral Ag, Au, and Pd Nanoparticles: Size Control Strategy and Superlattice Formation. Acs Nano. 3, 139-148 (2009).
- Xin, H. L., Zheng, H. In Situ Observation of Oscillatory Growth of Bismuth Nanoparticles. Nano Letters. 12, 1470-1474 (2012).
- Murray, C. B. Watching Nanocrystals Grow. Science. 324, 1276-1277 (2009).
- Xin, H. L., et al. Revealing Correlation of Valence State with Nanoporous Structure in Cobalt Catalyst Nanoparticles by In Situ Environmental TEM. ACS Nano. 6, 4241-4247 (2012).
- Daulton, T. L., Little, B. J., Lowe, K., Jones-Meehan, J. In situ environmental celltransmission electron microscopy study of microbial reduction of chromium(VI) using electron energy loss spectroscopy. Microscopy and Microanalysis. 7, 470-485 (2001).
- Mohanty, N., Fahrenholtz, M., Nagaraja, A., Boyle, D., Berry, V. Impermeable Graphenic Encasement of Bacteria. Nano Letters. 11, 1270-1275 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-Resolution EM of Colloidal Nanocrystal Growth Using Graphene Liquid Cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Zheng, H., Claridge, S. A., Minor, A. M., Alivisatos, A. P., Dahmen, U. Nanocrystal Diffusion in a Liquid Thin Film Observed by in Situ Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 9, 2460-2465 (2009).
- Park, J., et al. Direct Observation of Nanoparticle Superlattice Formation by Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy. Acs Nano. 6, 2078-2085 (2012).
