Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generatie Topisch transgene Rats door doi: 10.3791/50146 Published: September 24, 2013

Summary

Genen kunnen worden gemanipuleerd tijdens de ontwikkeling van de cortex of de hippocampus van de rat via in utero elektroporatie (IUE) op E16, om snelle en doelgerichte wijzigingen in neuronale connectiviteit mogelijk te maken voor latere studies van gedrag of neuropathologie bij volwassen dieren. Postnatale in vivo beeldvorming voor controle IUE succes uitgevoerd door bioluminescentie activerende co-getransfecteerd luciferase.

Abstract

In utero elektroporatie (IUE) is een techniek die genetische modificatie van cellen kan in de hersenen voor het onderzoeken van neuronale ontwikkeling. Tot dusver is het gebruik van IUE voor het onderzoeken gedrag of neuropathologie in de volwassen hersenen beperkt door onvoldoende werkwijzen voor het bewaken van IUE transfectie succes van niet-invasieve technieken postnatale dieren.

Voor de huidige studie, werden E16 ratten gebruikt voor IUE. Na intraventriculaire injectie van de nucleïnezuren in het embryo, plaatsing van de pincet elektroden was kritisch voor het richten ofwel de ontwikkeling cortex of hippocampus.

Ventriculaire co-injectie en elektroporatie van een luciferase gen toegelaten bewaking van de getransfecteerde cellen postnataal na intraperitoneale luciferine injectie in de verdoofde levende P7 pup in vivo bioluminescentie, met een IVIS Spectrum apparaat met 3D kwantificering software.

DISC1 gen in de cortex rat tot amfetamine overgevoeligheid. Gecotransfecteerd GFP kon worden gedetecteerd in neuronen per post mortem fluorescentie microscopie in cryosecties aangeeft genexpressie sprake is van ≥ 6 maanden na de geboorte.

We concluderen dat de postnatale bioluminescentie beeldvorming maakt een evaluatie van het succes van voorbijgaande transfecties met IUE bij ratten. Onderzoek naar de invloed van actuele gen manipulaties tijdens neurodevelopment op de volwassen hersenen en de connectiviteit wordt aanzienlijk vergemakkelijkt. Voor veel wetenschappelijke vragen, kan deze techniek aanvullen of zelfs vervangen het gebruik van transgene ratten en zorgen voor een nieuwe technologie voor Behavioral Neuroscience.

Introduction

De ontwikkeling van de in utero elektroporatie (IUE) methode die een modulatie van genexpressie kan in de ontwikkelende hersenen is een doorbraak geweest omdat het mogelijk bestuderen neurologische met relatief gemak. 1-7 Veranderingen in de expressie van een doelwitgen in een specifieke regio hersenen tijdens de embryonale en / of perinatale ontwikkeling bij knaagdieren werden aangetoond invloed neuronale proliferatie, migratie, arborization, en connectiviteit kritisch. 8-10

Schizofrenie is een complexe psychische ziekte met acute en chronische symptomen die zijn gerelateerd aan neurologische afwijkingen 11, 12 en dus veel van de geïdentificeerde kandidaatgenen voor schizofrenie worden onderzocht op mogelijke modulerende effecten op neurologische, zoals bijvoorbeeld voor de verstoorde-in-schizofrenie -1 (DISC1) gen 13-15.

Ontwikkeling van de hersenen is regulated door genetische factoren en hun interacties met de omgeving die een rol spelen in de pre-, peri-en postnatale ontwikkeling periodes. Een belangrijke genetische risicofactor voor verschillende gedragsstoornissen is de DISC1 16 gen. DISC1 knockdown leidt tot migratie defecten in muizen 13, 17 en manipulatie van DISC1 expressie in ontwikkelingslanden cortex door IUE is aangetoond dat het gedrag van volwassen muizen 18 beïnvloeden.

Manipuleren hersenen genexpressie door IUE heeft verschillende voordelen 19 via generatie van transgene dieren lijnen. Eerst wordt de genexpressie binnen aandachtsgebieden bereikt binnen enkele weken tot maanden in plaats van verschillende generaties van fokken transgene knaagdieren lijnen. Ten tweede, compensatiemechanismen tijdens de vroege ontwikkeling dat fenotypes kunnen beschermen in-germline gemanipuleerde dieren 20 worden vermeden. Ten derde, door uitsluitend is gericht op een specifieke cel populatie of bepaald gebied van de hersenen, migratiof proliferatie verschillen rechtstreeks worden vergeleken met de niet-mutant of controle contralaterale kant als eenzijdige electroporations gekozen. Anderzijds gaat IUE niet de nauwkeurigheid van promotor aangedreven cre / lox-geïnduceerde timing van expressie slechts een subpopulatie van de cellen in een bepaald gebied wordt gericht waardoor een mozaïek soort genexpressiepatroon.

Voor vele experimentele toepassingen bij volwassen knaagdieren, een tijdelijke transfectie van een beperkt aantal cellen in een hersengebied voldoende of zelfs gewenst zijn, zodat het grote voordeel van stabiele, kiemlijn-transgene knaagdieren verwaarloosbaar. In feite, IUE is nuttig om te onderzoeken of bepaalde abnormale cellen ontwikkelden een heel netwerk van cellen of circuits kunnen beïnvloeden. Een ander voordeel kan de mogelijkheid niet cel-autonome effecten van een gen tonen vanwege de aard van het mozaïek hit. Bovendien is de generatie van transgene en knock-out ratten is nog in de kinderschoenen en het gebruikvan IUE in deze soort voor afwijkende gevolgen ontwikkeling van de hersenen te bestuderen is van groot belang.

Tot nu toe een groot obstakel gebruiken IUE onderzoeken van de interventie gevolgen die dieren volwassenen is het gebrek aan controle elektroporatie succes. Tot dusver GFP-gecotransfecteerd fluorescente neuronen in de levende pasgeboren ratten aangetoond kon niet onder een geschikte binoculaire fluorescentiemicroscoop of met fluorescentie beeldvorming van de IVIS Spectrum gedetecteerd.

Om dit probleem te omzeilen, we gecotransfecteerd een luciferase reportergen en uitgevoerd bioluminescentie beeldvorming van levende pups door 3-dimensionale (3D) kwantificering van de IUE hersengebied.

Als voorbeeld voor het aantonen van de toepasbaarheid van deze methode in een latere functionele test testen van de neurologische genetische manipulatie, een co-injectie van plasmiden die humane DISC1, luciferase en GFP in de laterale ventrikel van rattenembryo in vivo, werd een vaste bioluminescentie signaal afgeleid van luciferine metabolisme door co-getransfecteerd luciferase gen gedetecteerd tot vijf weken na de geboorte. 3D-metingen van de geëlektroporeerd hersengebied toegestaan ​​kwantificering waarbij pups met onvoldoende of misplaatste elektroporatie werden geïdentificeerd vanaf het begin, dus, waardoor de toewijzing van IUE dieren (gen van belang en roerei) om experimentele groepen met matchende geëlectroporeerd hersenen gebieden met een lage variabiliteit . Het gebruik van volwassen ratten in IUE gedragsparadigma's werd aangetoond als een voorbeeld van het nut van dit protocol.

Protocol

Alle dierproeven werden door de verantwoordelijke Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW; 87-51.05.2010.A301) vergunning is verleend overeenkomstig de nationale en Europese wetgeving.

1. In utero Elektroporatie

Deze methode is uitvoerig beschreven in Jupiter de rat door Walantus et al.. 3, alsmede Rice et al.. 4 en wordt hier slechts kort samengevat. Een worpgrootte van 6-8 pups levert een goed resultaat. Er moeten ten minste twee niet-geëlektroporeerde embryo teneinde de totale overleving te verhogen (zie hieronder).

  1. Bereid DNA-mengsel dat 1,5 ug / ul bevat doel-plasmide (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 overexpressie: pCAX 21), 0,5 ug / ul luciferase bevattende plasmide (pCAX), 0,5 ug / ul GFP bevattend plasmide (pCAGGS 22) in 1x PBS-oplossing gekleurd licht blue met Fast groene kleurstof.
  2. Bereid injectienaalden uit glas capillairen met een naald Pipette Puller. En steriliseren chirurgische instrumenten, hetzij in de autoclaaf of incubatie met een basis van alcohol ontsmettingsmiddel (Kodan Tinktur forte).
  3. Dien een pre-operatieve dosis buprenorfine (0,05 mg / kg) 15 minuten voor de operatie een zwangere rat 16 dagen na de bevruchting (E16). Verdoven dan het dier in een isofluraan kamer.
    1. Bij anesthesie, plaats de rat in een liggende positie op een 37 ° C opgewarmd operatie tafel met beademingsmasker verbonden met de anesthesie-apparaat, het gebruik van zuurstof instelling op 0,4 L / min en isofluraan op 1,8%.
    2. Na het scheren van de buik, ontsmet het geschoren gebied drie keer met Kodan Tinktur Forte (een op alcohol gebaseerde desinfecterende).
    3. Bedek de rat met steriele doeken, bloot alleen de geschoren operatie veld.
  4. Voer in utero elektroporatie.
    1. Snijd de buik met een schaar vanr langs de linea alba (~ 2 cm).
    2. Expose de baarmoederhoorns voorzichtig met een ring tang.
    3. Zorg ervoor dat de baarmoeder wand nat te houden met verwarmde steriele PBS gedurende de hele operatie.
    4. Injecteer DNA-oplossing met een dunne glazen naald in een van de laterale ventrikel van het embryo.
    5. Plaats de 7 mm elektrode rond het hoofd van het embryo. Om een cel populatie van de bovenste corticale lagen raken, voeren de IUE op E16 23 en de positie van de positieve elektrode op het halfrond boven de ingespoten ventrikel met een lichte dorsale / zijwaartse tendens. Doelgericht hippocampale cellen veranderen de positieve elektrode plaatsing aan de tegenoverliggende kant van de ventrikel geïnjecteerd met zijdelings enigszins dorsaal (figuur 1).
    6. Voer elektroporatie door vijf 50 msec pulsen bij 55 V met 950 msec breekt met een blokgolf electroporator.
    7. Spaar de eerste embryo in de vaginale einde van elke uterus hoorn om t te verhogenhij overlevingskansen van alle embryo's.
    8. Zet de baarmoeder horens terug in de moeder rat.
    9. Stich de buikwand met een absorbeerbare Vicryl chirurgisch hechtmateriaal.
    10. Sluit de huid met de Vicryl hechtmateriaal of met hechtdraad clips.
    11. Plaats de moeder rat terug in hun kooi en houd hem warm voor 2-3 uur.
    12. Houd de ratten alleen in hun kooi in het dier faciliteit kamer en voeden ad libitum. Ze geven de geboorte tussen E22-24.
    13. Houd de pups rat met hun moeder voor drie weken en scheiden ze daarna geslacht.

2. Bioluminescentie Live-Imaging van de enzymatische luciferasereactie

Deze methode wordt gebruikt om de positie van de in utero getransfecteerde cellen te analyseren. Co-geëlektroporeerde vuurvlieg luciferase cDNA wordt omgezet in actieve luciferase die na metaboliseren D-luciferine tot oxyluciferine, een foton uitzendt (figuur 2 (Figuur 4).

In de huidige studie werd de luciferasetest en bioluminescentie beeldvorming uitgevoerd vanaf P7. Dit tijdstip is gekozen om moeder en pups om te herstellen van de geboorte stress. Bij de eerste werken met de pups op P0, werd overleving van de jongen zwaar getroffen, dat de pups doden werden gevonden of opgegeten door de moeder.

Aanvankelijk rattenpups met succesvolle elektroporatie worden geïdentificeerd door een 2D-bioluminescentie foto met een belichtingstijd van drie minuten. Vervolgens worden positieve pups gebruikt voor het maken van 3D-beelden om de plaats van het geëlektroporeerde gebied specificeren.

  1. Verdun D-luciferine natriumzout in PBS tot een concentratie van 15 mg / ml en steriliseer door filtratie door een steriele spuitfilter.
  2. Weeg de pups.
  3. Neem de pup in een hand met de buik bovenop en strek de buik lichtjes. Injecteer 10 ul / g lichaamsgewicht van luciferine oplossing intraperitoneaal. Voor oudere en wendbaarder degenen, vooraf verdoven de pups met isofluraan in de inductie kamer voor het injecteren de luciferin.
  4. Zet de isofluraan instroom van de XGI-8 Gas Anesthesie-stelsel in het IVIS Spectrum met 3% isofluraan.
  5. Zet de snuit van het dier in de glazen neus kegels van de Anesthesie System.
  6. Houd het dier in een liggende positie totdat deze is in diepe narcose (2-3 min.). Dan verminderen de isofluraan instroom tot 1,5%.
  7. Kies een 2D-bioluminescentie meting om positieve pups van het hele nest te selecteren. Gebruik de volgende instellingen
    Scherm 1
    Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
    1. Stel een checkmark op de Foto met medium binning en F / Stop op 8, maakt de camera een foto van boven na het starten van de meting.
    2. Stel excitatiefilter: block.
    3. Stel Emissie filter: open.
    4. Stel Binning tot medium.
    5. Set F / Stop bij 1.
    6. Stel Stage niveau A.
    7. Stel luminescentie belichtingstijd tot 180 sec.
  8. Voor de creatie van 3D-foto's om beter te kunnen kwantificeren van de geëlektroporeerde gebied van de positieve pups, gebruikt u de volgende DLIT instellingen voor vuurvliegluciferase.
    Scherm 3
    Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
    1. Zet een vinkje op de Foto, de camera neemt een foto van boven na het starten van de meting.
    2. Zet een vinkje op structuur, wordt het oppervlak van het dier gescand door de IVIS vóór de bioluminescentie meting.
    3. Use volgende Emissie filters en belichtingstijd instellingen tot de leeftijd van twee weken:
      Emissiefilter 1: 590 nm, belichtingstijd 300 sec
      Emissiefilter 2: 600 nm, belichtingstijd 240 sec
      Emissiefilter 3: 620 nm, belichtingstijd 180 sec
      Emissiefilter 4: 640 nm, belichtingstijd 120 sec
      Voor ratten ouder dan P20
      Emissiefilter 1: 600 nm, belichtingstijd 300 sec
      Emissiefilter 2: 620 nm, belichtingstijd 300 sec
      Emissiefilter 3: 640 nm, belichtingstijd 300 sec
      Scherm 3
      Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
      Als gevolg van de afname van de signaalsterkte bij oudere dieren, wordt de belichtingstijd vergroot voor de drie beste emissie filters.
    4. Stel Stage niveau B
    5. Stel Binning tot medium.
    6. Set F / Stop op 1
  9. Na de meting, mar k de ratten met een earhole code zij ten opzichte van elkaar te passen aan de IVIS Live-Imaging foto
  10. Aan het eind van de meting, zet isofluraan instroom en houdt de rat op de verwarmde plaat enkele minuten voordat u deze in zijn kooi.

3. Analyse van Bioluminescence Afbeeldingen

De generatie van 3D-beelden, 3D-films en de kwantificering van het volume van de signaalbron wordt gemaakt door de Living Image software vooraf geïnstalleerd op de IVIS Spectrum.

  1. Generatie van 3D-beelden
    1. Eerste, reconstrueren een oppervlakte topografie, daarom stellen drempel tussen 20-30%.
      Scherm 4
      Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
      Scherm 5
      EEN 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
    2. Start DLIT 3D reconstructie met een afbeelding drempel van 10% voor elke golflengte.
      Scherm 7
      Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
      Scherm 8
      Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
      Scherm 9
      Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
    3. Maak 3D-films met de animate button binnen de 3D-werkbalk.
    4. Kies verschillende oriëntaties van het 3D-beeld, evenals het zoomen uitzicht als keyframes en druk op de "Record & #39; knop, het opnemen van de overgang van de ene positie / oriëntatie naar de andere.
      Scherm 10
      Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

4. Behavioral Testen

Behavioral testen werd uitgevoerd om te bepalen of IUE-gemedieerde gen manipulaties bij de rat lange termijn effecten die aanhouden in de volwassenheid kan leiden. In het onderhavige geval is het effect van kortstondige, unilaterale volledige lengte menselijke DISC1 corticale overexpressie na IUE werd onderzocht door motoriek in een open veld (OF), met en zonder een lage dosis van amfetamine, als een specifieke test voor dopamine-gerelateerde gedrag 24. In een soortgelijke procedure uitgevoerd door Niwa et al.. IUE in muizen met behulp DISC1 neerhalen, IUE muizen maar niet controles bleek overgevoeligheidamfetamine 18.

Ratten die in de baarmoeder waren geëlektroporeerd met een DISC1 overexpressie vector werden gehouden onder laboratoriumomstandigheden met 12 uur licht 07:00-19:00 en werden ad libitum. Op leeftijd van 3 maanden, ratten ondergingen gedragstesten.

Voor het kwantificeren van de motoriek als een uitlezing van de amfetamine-effecten, een open-veld van een Tru Scan activiteit gesitueerd in een geluid-en licht-geïsoleerde kamer werd gebruikt. Dit systeem meet de tijdsduur en afstand het dier beweegt, tijd en afstand doorgebracht in de marge of het centrum van het open veld, en grootbrengen gedrag 25.

  1. Op de eerste dag, te testen na injectie met fysiologisch zout
    1. Weeg de dieren.
    2. Intraperitoneaal injecteren 1 ul / g lichaamsgewicht van een zoutoplossing (1x PBS).
    3. Direct na de injectie, zet het dier in het open veld en start de meting van het TruScan systeem. Record voor de 15 min eend onderverdelen gegevens in 3 x 5 min onderdelen.
    4. Leg het dier terug in zijn kooi.
  2. Tweede dag, testen op amfetamine injectie
    1. Weeg de dieren.
    2. Intraperitoneaal injecteren 1 ul / g lichaamsgewicht van een 0,5 mg / ml oplossing amfetamine.
    3. Direct na de injectie zet het dier in het open veld en de meting van het TruScan systeem. Record voor 15 min en verdelen van gegevens in 3 x 5 min onderdelen.
    4. Breng het dier naar de kooi.
  3. Analyseer de motoriek en het grootbrengen gedrag gegenereerd door specifieke Tru Scan software. Maak Grafieken met GraphPad (Prism) en statistieken te berekenen door SPSS Statistics-software.

Representative Results

Figuur 3 toont leven beeldvorming metingen van drie pups rat bij P7 na de injectie van 150 mg luciferine / kg lichaamsgewicht. Verschillen sterkte signaal dat de variabiliteit in de efficiëntie van de IUE zichtbaar. Sterke bioluminescentie signalen werden geregistreerd tot P36 (figuur 4). In figuur 5, de mogelijkheid om corticale (Figuren 5A en 5C) en hippocampus (Figuren 5B en 5D) elektroporatie definiëren door bioluminescentie afgebeeld. Correlatie van de bioluminescentie signaal (figuur 7A) met fluorescentiesignaal na schedel verwijderd (figuur 7B) en de overeenkomstige GFP geëlektroporeerde cellen in cryosectioned hersenen (Figuur 8) en P14 zijn weergegeven in figuren 6-8. Opmerkelijk was geen detectie van een fluorescentiesignaal in levende ratten op elk tijdstip.

tent "> In vivo bioluminescentie beeldvorming maakt benadering discriminatie van verschillende geëlectroporeerd hersengebieden door 2D (figuren 5A en 5B) dat volledig is verbeterd met de DLIT programma van de IVIS Spectrum software genereren van 3D-beelden (figuren 5C en 5D). In de getoonde voorbeelden , elektroporatie van de prefrontale cortex en hippocampus konden worden onderscheiden. Opgemerkt zij dat hoewel gericht op de hippocampus elektroporatie, wat progenitorcellen voor de cortex liggen van de dorsale hippocampus kan worden geraakt (figuur 7).

Ratten eenzijdig in de baarmoeder geëlektroporeerd met pCAX vector in de cortex en vervolgens overexpressie volledige lengte menselijke DISC1 werden onderzocht op zowel spontane en amfetamine geïnduceerde hyperactiviteit als volwassenen. Ratten geëlektroporeerd met pCAX-DISC1 waren overgevoelig zijn voor een lage dosis amfetamine. Deze ratten aanzienlijk verplaatst more na amfetamine behandeling dan na te zoutoplossing injectie, terwijl controle dieren niet (figuur 10).

Figuur 1
Figuur 1. Schema van elektrode positie voor A) cortex elektroporatie en B) hippocampus elektroporatie; groen = geïnjecteerd DNA-Mix in het ventrikel.

Figuur 2
Figuur 2. Luciferasereactie.

Figuur 3
Figuur 3. Luminescentiemeting van P7 ratten na injectie van 150 mg / kg lichaamsgewicht luciferine; blootstellingstijd 180 seconden; A) rat zonder luminescentiesignaal, B) rat met een zwak bioluminescentie signaal; C) rat met een sterk luminescentiesignaal.

Figuur 4
Figuur 4. Tijdslijn van opeenvolgende bioluminescentie metingen van dezelfde rat na injectie van 150 mg / kg luciferine blijk van een groot tijdvenster waar IUE succes kan worden gedetecteerd.

Figuur 5
. Figuur 5 Illustratie van verschillen tussen corticale en hippocampus elektroporatie op P7 A) en B) 2D-foto's;. C) en D) 3D-foto's; A) en C) uit cortex; B) & D) van de hippocampus.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Illustratie van E16 hippocampus elektroporatie van een rat pup op P14 A) 2D-beeld van bioluminescentie B) 3D illustratie van de bioluminescentie signaal C) ontleed hersenen met bioluminescentie signaal D) hersenen met GFP epi-fluorescentie-signaal. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 7
Figuur 7. Detail van een fluorescentie beeld van een 20 um cryo deel van dezelfde P14 rat hersenen geëlektroporeerd met GFP-bevattende plasmide en luciferasevector, kernen kleuring met DAPI, CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = gyrus dentatus; FC = Fasciolarum cinereum.

Video 1. 3D-animatie van een hippocampus geëlektroporeerd rat bij P14.

Figuur 8
Figuur 8. Amfetamine testschema: eerste dag zoutoplossing vóór de 15 min proef, 24 uur later amfetamine injectie vóór het testen in het open veld kamer.

Figuur 9
Figuur 9. Amfetamine test. Staafdiagram dat verplaatste afstand (in cm) van het dier geregistreerd door een TrueScan systeem gedurende 15 minuten Witte balken = controlegroep;. Grijze balken = DISC1 overexpressie groep; controlegroep n = 10; DISC1 overexpressie groep n = 11; ANOVA: geno * behandeling p = 0.043, T-Test voor totale tijd zoutoplossing vs amfetamine ns = niet significant pcontrol = 0.172, pDISC1 = 0,001.

Discussion

Onze studie toont aan dat IUE geschikt is voor volwassen ratten genereren met neuronen die een transgen in een selectief gebied van de hersenen en dat als gevolg van deze interventie, deze dieren gedragsveranderingen vertonen vermelding functionaliteit van de uitgevoerde manipulatie. In deze studie, als voorbeeld, ratten overexpressie DISC1 eenzijdig een klein deel van de prefrontale cortex bleek overgevoeligheid voor amfetamine (figuur 9).

Ratten selecteren voor elektroporatie succes door in vivo bioluminescentie beeldvorming was effectief in het beheersen van de inherente variabiliteit van IUE celtransfectie en werd toegepast op groepen te genereren met een homogene IUE gebied van lage interindividuele variabiliteit voor later onderzoek.

In deze studie hebben we in staat waren om geëlectroporeerd pups uit het nest selecteren door detectie van de co-geëlektroporeerd-GFP geïnduceerde fluorescentie in het pasgeboren dier, zelfs though op hetzelfde moment en in hetzelfde dier een bioluminescentie signaal van de eveneens co-geëlektroporeerde luciferase waargenomen na luciferin injectie (Figuur 6), en het GFP-expressie neuronen waren nog steeds aanwezig in de hersenen op een leeftijd van zes maanden. We concluderen dat in de rat, de luciferase / luciferinreactie is zeer geschikt voor dieren met succesvolle geëlektroporeerd hersenen (Figuur 3) onderscheiden.

De kwantitatieve controle van IUE succes betreft de sterkte van de bioluminescentie signaal dat wordt gemeten door het tellen van fotonen binnen dezelfde belichtingstijd (figuur 3) en komt overeen met de enzymatische activiteit van co-expressie luciferase. Kleine bioluminescentie signalen zijn detecteerbaar met 100-200 tellingen van fotonen, en, bij een straling van ~ 1x10 4 fotonen / sec / cm 2 / steradiaal tonen 1.000-2.000-GFP gekleurde cellen in de histologie in de 6 maanden oude brein rat. De hoogste signaal displegde een uitstraling tot ~ 5x10 6 fotonen / sec / cm 2 / steradiaal en ~ 64.000 telt.

In de Sprague Dawley rat stam zagen we een verzwakking van de bioluminescentie signaal langsrichting met toenemende leeftijd en het signaal verdwenen na de leeftijd van P35 (figuur 4). Op dit moment weten we niet of een van beide de voorbijgaande, plasmide vector-gebaseerde expressie van luciferase vermindert, of als de bioluminescentie signaal verzwakt als gevolg van toenemende hersenen massa, of beide zijn de oorzaken voor het verdwijnen signaal. Voor deze functionele assay volwassen ratten, was de selectie voor gedragsonderzoek alleen gemaakt op basis van de locatie van het signaal, maar niet door bioluminescentie signaalsterkte.

Hoewel 3D kwantitatieve bioluminescentie toezicht toegestaan ​​differentiatie tussen verschillende geëlektroporeerd gebieden (figuur 5), werd de nauwkeurigheid beperkt cellen in de diepte dimension van de hersenen. Figuur 6 toont een voorbeeld van een hippocampus elektroporatie waarbij de bioluminescentie meting in het 2D en het 3D beeld gaf een goede positionering van de elektroporatie. In de ontleed post mortem hersenen, werd een GFP-fluorescentie-signaal gedetecteerd op ongeveer dezelfde positie als de bioluminescentie signaal, waarbij u de juiste afstemming van de hippocampus. Maar histologie blijkt dat ook cellen in de cortex van de dorsale hippocampus was gericht (fig. 7). Dit geeft aan dat de bioluminescentie test is een nuttig instrument om positieve, IUE pups op te sporen en ook om een idee van de geëlektroporeerde gebied hebben, maar uiteindelijk kan beeldvorming niet vervangen post mortem histologie om precies te lokaliseren positief gerichte cellen.

Onze demonstratie geeft belofte voor de toepassing van de IUE technologie om subtiele gerichte manipulaties van de corticale of hippocampus hersengebieden te aberrances simuleren in c genererenortical migratie of andere neurologische gebreken die het volwassen dier kan beïnvloeden. Terwijl bilaterale elektroporatie 26 heeft het voordeel van een grotere waarschijnlijke effect op het gedrag, is er ook sterfte van embryo. Unilaterale elektroporatie werd gekozen om de twee hersenhelften vergelijken met een als een interne controle, alsmede voor het aantonen dat zelfs IUE manipuleren in een eenzijdige, klein gebied volstaat om gedrag te veranderen. IUE-geïnduceerde veranderingen in de architectuur of verbinding tussen neuronen kunnen aldus worden geïnduceerd zonder roepen een laesie en de vereiste gelijke van de te-IUE-gemanipuleerd regio met de juiste gedragstest is afhankelijk van de wetenschappelijke vraag.

Problemen oplossen

Verminderde worpgrootte Er zijn verschillende suggesties met betrekking tot het verhogen van de overlevingskansen van de IUE pups. Ten eerste, het gebruik van zeer dun glas capillairen tijdens elektroporatie om weefsel te minimaliseren lesion wordt aanbevolen. Ten tweede, niet electroporate de eerste embryo in de vaginale einde van elke uterus hoorn: dood van de eerstgeborenen embryo verhoogt de kans op een afbreken van alle andere embryo's. Ten derde, na de geboorte, moederratten doden vaak tot hun nageslacht door perinatale stress. Om extra stress te verminderen, niet beginnen met de live imaging direct na de geboorte, maar wachten tot zeven dagen.

GFP-fluorescentie detectie van de pups

Op een week na de geboorte, geen signaal van de fluorescentie door ofwel met live-verrekijker fluorescentie microscopische beeldvorming of fluorescentie beeldvorming met de IVIS Spectrum (epifluorescentie en transfluorescence modi, want GFP excitatie / emissie: 465/520 nm en 500/540 nm). Het is mogelijk dat zowel de beperkte overdracht van korte golflengte excitatie en emissie licht door weefsel zoals de schedel en de hoge autofluorescentie achtergrond van de huid te voorkomen met behulp van fluorescentie onder described omstandigheden in de rat. Zoals getoond in figuur 6, kan het luciferase signaal in het levende dier worden gedetecteerd in de hersenen ontleed (zonder schedel) en daar een fluorescentiesignaal detecteerbaar (Figuur 6D).

Differentiatie van bioluminescentie in dicht bij elkaar gelegen hersengebieden

Zelfs in de 3D afbeelding de locatie van de bioluminescentie gebied niet kan worden voorspeld tot 100%. Vooral cellen op of onder het voorspelde gebied kan ook per ongeluk worden gericht en getransfecteerd. De exacte positie moet worden gecontroleerd door post mortem (fluorescentie) histologie (zie figuur 7).

Disclosures

De auteurs van deze studie hebben geen financieel belang in deze studie en zijn niet gesponsord door de industrie voor deze studie. Open access vergoedingen werden bijgedragen door PerkinElmer Inc bekendmaking.

Acknowledgments

De auteurs danken Tracy Young-Pearse en Atsushi Kamiya voor het verstrekken van plasmiden.

Dit werk werd gefinancierd door neuron ERANET ontdekken OR en CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) aan CK, en (DE 792/2-4) aan MASS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O
100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  2. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  3. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  4. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  5. Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  7. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
  8. Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  10. Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
  11. Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
  12. Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
  13. Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
  14. Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
  15. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
  16. Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  17. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
  18. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  19. Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. 169-179 (2012).
  20. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
  21. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  22. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
  23. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
  24. Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
  25. Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
  26. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
Generatie Topisch transgene Rats door<em&gt; In de baarmoeder</em&gt; Elektroporatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).More

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter