जीन वयस्क पशुओं में व्यवहार या neuropathology के बाद पढ़ाई के लिए neuronal संपर्क में तेजी से और लक्षित संशोधनों को सक्षम करने के लिए, E16 पर utero electroporation (IUE) में के माध्यम से प्रांतस्था या चूहे के हिप्पोकैम्पस के विकास के दौरान चालाकी से किया जा सकता है. IUE सफलता के नियंत्रण के लिए vivo इमेजिंग में प्रसव के बाद सह ट्रांसफ़ेक्ट luciferase सक्रिय करने के bioluminescence द्वारा किया जाता है.
Utero electroporation में (IUE) neuronal विकास की जांच के लिए मस्तिष्क में कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन की अनुमति देता है जो एक तकनीक है. अब तक, वयस्क मस्तिष्क में व्यवहार या neuropathology की जांच के लिए IUE का प्रयोग प्रसव के बाद पशुओं में गैर इनवेसिव तकनीक द्वारा IUE अभिकर्मक सफलता की निगरानी के लिए अपर्याप्त तरीके से सीमित कर दिया गया है.
वर्तमान अध्ययन के लिए, E16 चूहों IUE के लिए इस्तेमाल किया गया. भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की intraventricular इंजेक्शन के बाद, चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड की स्थिति के विकास प्रांतस्था या हिप्पोकैम्पस या तो लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण था.
निलय सह इंजेक्शन और 3 डी मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर के साथ एक IVIS स्पेक्ट्रम डिवाइस का उपयोग postnatally में vivo bioluminescence द्वारा anesthetized लाइव P7 पिल्ला में intraperitoneal luciferin इंजेक्शन के बाद ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की एक luciferase जीन की अनुमति दी निगरानी, की electroporation.
<pbioluminescence द्वारा वर्ग = "jove_content"> एरिया परिभाषा स्पष्ट रूप से cortical और हिप्पोकैम्पस electroporations के बीच अंतर और जन्म के बाद 5 सप्ताह का समय समय के साथ longitudinally एक संकेत का पता लगा सकता. इस इमेजिंग तकनीक हमें उम्र के 3 महीने में व्यवहार की जांच करने के लिए प्रदर्शन, बाद में, जैविक प्रभाव ट्रिगर और के लिए आवश्यक ग्रहण ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या के साथ पिल्ले को चुनने के लिए अनुमति दी. एक उदाहरण के रूप में, यह अध्ययन चूहा प्रांतस्था में मानव पूरी लंबाई DISC1 जीन के साथ IUE एम्फ़ैटेमिन अतिसंवेदनशीलता कि नेतृत्व करने को दर्शाता है. सह ट्रांसफ़ेक्ट GFP जन्म के बाद ≥ 6 महीनों में उपस्थित जीन अभिव्यक्ति का संकेत cryosections में पोस्टमार्टम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा न्यूरॉन्स में पता लगाया जा सकता है.हम प्रसव के बाद bioluminescence इमेजिंग चूहों में IUE साथ क्षणिक transfections की सफलता का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है कि समाप्त. Neurodevelopmen दौरान सामयिक जीन जोड़तोड़ के प्रभाव पर जांचवयस्क मस्तिष्क और इसकी कनेक्टिविटी पर टी बहुत मदद कर रहे हैं. कई वैज्ञानिक प्रश्नों के लिए, इस तकनीक पूरक या भी ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग की जगह और व्यवहार तंत्रिका विज्ञान के लिए एक उपन्यास प्रौद्योगिकी प्रदान कर सकते हैं.
यह रिश्तेदार आसानी से सक्षम के चिकित्सकों का अध्ययन सक्षम के बाद से विकासशील मस्तिष्क में जीन की अभिव्यक्ति का एक मॉडुलन की अनुमति देता है, जिसमें utero electroporation (IUE) विधि का विकास, एक को तोड़ने के माध्यम से किया गया है. में एक लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में 1-7 परिवर्तन कृन्तकों में भ्रूण और / या प्रसवकालीन विकास के दौरान एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र प्रभाव neuronal प्रसार, प्रवास, द्रुमायण, और कनेक्टिविटी के लिए गंभीर का प्रदर्शन किया गया. 8-10
एक प्रकार का पागलपन neurodevelopmental असामान्यताएं 11, 12 और इसलिए एक प्रकार का पागलपन के लिए पहचान की उम्मीदवार जीन के कई के लिए उदाहरण के लिए की तरह, सक्षम के चिकित्सकों पर संभावित modulating प्रभाव के लिए जांच कर रहे हैं करने के लिए संबंधित दिया गया है कि तीव्र और जीर्ण लक्षण के साथ एक जटिल मानसिक बीमारी है बाधित में एक प्रकार का पागलपन -1 (DISC1) जीन 13-15.
मस्तिष्क के विकास regulat हैपूर्व, पेरी और प्रसव के बाद विकास की अवधि में भूमिका निभाते हैं जो आनुवंशिक कारणों और पर्यावरण के साथ उनकी बातचीत से एड. विभिन्न व्यवहार विकारों के लिए एक प्रमुख आनुवंशिक जोखिम कारक चूहों 13, 17 में प्रवास दोषों को DISC1 16 जीन. DISC1 पछाड़ना होता है, और IUE द्वारा विकासशील प्रांतस्था में DISC1 अभिव्यक्ति की जोड़ – तोड़ वयस्क चूहों 18 के व्यवहार को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है.
IUE द्वारा मस्तिष्क जीन की अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ के कई फायदे ट्रांसजेनिक पशु लाइनों की पीढ़ी से अधिक 19 है. सबसे पहले, हित के क्षेत्रों के भीतर जीन अभिव्यक्ति महीने के बजाय ट्रांसजेनिक कृंतक लाइनों प्रजनन की कई पीढ़ियों के लिए सप्ताह के भीतर हासिल की है. दूसरा, germline इंजीनियर जानवरों 20 में phenotypes ढाल सकता है कि प्रारंभिक विकास के दौरान प्रतिपूरक तंत्र परहेज कर रहे हैं. केवल एक विशेष सेल आबादी या मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्र, migrati को निशाना बनाने के माध्यम से, तीसरापर या प्रसार मतभेद सीधे गैर उत्परिवर्ती के साथ तुलना में या एकतरफा electroporations चुना जाता है अगर contralateral पक्ष को नियंत्रित किया जा सकता है. दूसरी ओर, IUE प्रमोटर संचालित रचनात्मक / Lox प्रेरित अभिव्यक्ति के समय और एक निश्चित क्षेत्र में केवल कोशिकाओं के एक subpopulation जीन अभिव्यक्ति पैटर्न की पच्चीकारी प्रकार के लिए अग्रणी लक्षित है की शुद्धता नहीं है.
स्थिर, germline ट्रांसजेनिक कृन्तकों के प्रमुख लाभ नगण्य है कि इतने वयस्क कृन्तकों में कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए, एक मस्तिष्क क्षेत्र में कोशिकाओं की सीमित संख्या के एक क्षणिक अभिकर्मक, पर्याप्त, या भी वांछित हो सकता है. वास्तव में, IUE कुछ असामान्य रूप से विकसित कोशिकाओं कोशिकाओं या circuitry के एक पूरे नेटवर्क को प्रभावित कर सकता है कि क्या जांच करने के लिए उपयोगी है. एक और लाभ की वजह से हिट की पच्चीकारी प्रकृति के लिए एक जीन की गैर सेल स्वायत्त प्रभाव का प्रदर्शन करने की क्षमता हो सकती है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों की पीढ़ी अपने बचपन और अभी भी प्रयोग में हैन्यायपालिका मस्तिष्क के विकास के परिणामों के अध्ययन के लिए इस प्रजाति में IUE की उच्च ब्याज की है.
अब तक, वयस्क के रूप में उन जानवरों में हस्तक्षेप परिणामों की जांच के लिए IUE का उपयोग करने का एक प्रमुख बाधा निगरानी electroporation सफलता की कमी है. अब तक, लाइव नवजात चूहे पिल्ले एक उपयुक्त दूरबीन प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे या IVIS स्पेक्ट्रम की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ पकड़ा नहीं जा सका में फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स GFP-सह ट्रांसफ़ेक्ट.
इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एक luciferase संवाददाता जीन सह ट्रांसफ़ेक्ट और IUE मस्तिष्क क्षेत्र के 3 आयामी (3 डी) quantitation द्वारा पिल्ले के bioluminescence रहते इमेजिंग प्रदर्शन किया.
Neurodevelopmental आनुवंशिक हेरफेर, चूहा भ्रूण के पार्श्व वेंट्रिकल में मानव DISC1, luciferase, और GFP युक्त plasmids के एक सह इंजेक्शन का परीक्षण एक बाद में कार्यात्मक परख में इस पद्धति के प्रयोग के प्रदर्शन के लिए एक उदाहरण के रूप में <suएक चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड के साथ electroporation द्वारा पीछा p> 3 प्रदर्शन किया गया था. प्रतिदीप्ति संकेत vivo में प्रसव के बाद के चरणों में पता नहीं किया जा सकता है, सह ट्रांसफ़ेक्ट luciferase जीन द्वारा luciferin चयापचय से व्युत्पन्न एक ठोस bioluminescence संकेत जन्म के बाद पांच सप्ताह तक खोजा गया था. अपर्याप्त या गलत electroporation के साथ पिल्ले IUE जानवरों के काम को सक्षम करने, इस प्रकार, शुरू से पहचान (ब्याज की जीन और नियंत्रण तले) कम परिवर्तनशीलता का मिलान किया electroporated मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ प्रयोगात्मक समूहों के लिए गए थे जिससे electroporated मस्तिष्क क्षेत्र की अनुमति दी मात्रा का ठहराव की 3 डी माप . व्यवहार मानदंड में वयस्क IUE चूहों का उपयोग इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में प्रदर्शन किया गया.
हमारे अध्ययन IUE न्यूरॉन्स मस्तिष्क के एक चुनिंदा क्षेत्र में एक transgene व्यक्त लगे और इस हस्तक्षेप का एक परिणाम के रूप में, इन जानवरों प्रदर्शन किया गड़बड़ी की कार्यक्षमता का संकेत व्यवहार में परिवर्तन प्रदर्शन के साथ वयस्क चूहों उत्पन्न करने के लिए अनुकूल है, यह दर्शाता है कि. इस अध्ययन में, एक उदाहरण के रूप में, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के एक छोटे से हिस्से में एकतरफा DISC1 overexpressing चूहों एम्फ़ैटेमिन के प्रति अतिसंवेदनशीलता (9 चित्रा) से पता चला है.
में vivo bioluminescence इमेजिंग द्वारा electroporation सफलता के लिए चूहों का चयन IUE सेल अभिकर्मक के निहित परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने में प्रभावी था और बाद में जांच के लिए कम अंतर – विषय परिवर्तनशीलता का एक समरूप IUE क्षेत्र के साथ समूहों उत्पन्न करने के लिए आवेदन किया था.
इस अध्ययन में, हम भी यद्यपि, नवजात पशु में सह electroporated GFP प्रेरित प्रतिदीप्ति का पता लगाने के द्वारा कूड़े से electroporated पिल्ले का चयन करने में असमर्थ थेऊ एक ही समय में और एक ही पशुओं में समान रूप से सह electroporated luciferase की एक bioluminescence संकेत luciferin इंजेक्शन (चित्रा 6) के बाद पता लगाया जा सकता है, और न्यूरॉन्स व्यक्त GFP छह महीने की उम्र में अभी भी मस्तिष्क में मौजूद थे. हम चूहे में, luciferase / luciferin प्रतिक्रिया सफल electroporated दिमाग के साथ जानवरों (चित्रा 3) के अंतर करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, निष्कर्ष है कि.
IUE सफलता की मात्रात्मक निगरानी एक ही समय जोखिम (चित्रा 3) के भीतर फोटॉनों की गिनती से मापा और सह व्यक्त luciferase के enzymatic गतिविधि से मेल खाती है जो bioluminescence सिग्नल की शक्ति से संबंधित है. लघु bioluminescence संकेतों 6 महीने पुरानी चूहे के मस्तिष्क में ऊतक विज्ञान में ~ 1×10 4 फोटॉनों / सेक / 2 सेमी / steradian शो 1,000-2,000 GFP-दाग कोशिकाओं की एक चमक में, फोटोन के 100-200 मायने रखता द्वारा detectable हैं, और. उच्चतम संकेत dispकी एक चमक रखी ~ 5×10 6 फोटॉनों / सेक / 2 सेमी / steradian और ~ 64,000 गिनती के लिए ऊपर.
इस्तेमाल किया Sprague Dawley चूहा तनाव में, हम बढ़ती उम्र के साथ longitudinally bioluminescence संकेत के एक कमजोर मनाया और संकेत P35 की उम्र (चित्रा 4) से परे गायब हो गया. इस बिंदु पर, हम luciferase की क्षणिक, प्लाज्मिड वेक्टर आधारित अभिव्यक्ति या तो कम हो जाती है, या bioluminescence संकेत वृद्धि के कारण मस्तिष्क जन, या दोनों गायब संकेत के लिए कारण हैं करने के लिए कमजोर है अगर नहीं जानते कि क्या. वयस्क चूहों में मौजूद कार्यात्मक परख के लिए, व्यवहार के अध्ययन के लिए चयन केवल संकेत के स्थान पर आधारित बनाया है, लेकिन नहीं bioluminescence सिग्नल की शक्ति के द्वारा किया गया था.
3 डी मात्रात्मक bioluminescence निगरानी अलग electroporated क्षेत्रों (चित्रा 5) के बीच भेदभाव की अनुमति दी है, भले ही इसके accurateness गहराई पैसा में स्थित कोशिकाओं के लिए सीमित थामस्तिष्क की nsion. 6 चित्रा 2 डी और 3 डी तस्वीर में bioluminescence माप electroporation की एक अच्छी स्थिति जहा पर एक हिप्पोकैम्पस electroporation की एक उदाहरण दिखाता है. विच्छेदित पोस्टमार्टम मस्तिष्क में, एक GFP प्रतिदीप्ति संकेत हिप्पोकैम्पस की सही लक्ष्यीकरण का संकेत है, bioluminescence संकेत के रूप में एक ही स्थिति के बारे में पता चला था. लेकिन ऊतक विज्ञान शो भी हिप्पोकैम्पस के प्रांतस्था पृष्ठीय में कोशिकाओं (चित्रा 7) लक्षित किया गया था. इस bioluminescence परख सकारात्मक, IUE पिल्ले का पता लगाने के लिए और भी electroporated क्षेत्र की एक विचार है, लेकिन, अंत में, इमेजिंग बिल्कुल सकारात्मक लक्षित कोशिकाओं के स्थानीयकरण का पोस्टमार्टम ऊतक विज्ञान की जगह नहीं कर सकते हैं एक उपयोगी उपकरण है कि इंगित करता है.
हमारा प्रदर्शन ग में aberrances अनुकरण करने के लिए cortical या हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क क्षेत्रों की सूक्ष्म लक्षित जोड़तोड़ उत्पन्न करने के लिए IUE प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के लिए वादा इंगित करता हैortical प्रवास या वयस्क जानवर को प्रभावित कर सकते हैं कि अन्य neurodevelopmental दोष. द्विपक्षीय electroporation 26 व्यवहार पर एक संभावना बड़ा प्रभाव का लाभ दिया है, वहीं भ्रूण की अधिक मृत्यु दर भी वहाँ है. एकतरफा electroporation के एक एकतरफा, छोटे क्षेत्र में भी IUE छेड़खानी व्यवहार बदलने के लिए पर्याप्त है कि दिखाने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में एक है, साथ ही साथ दो गोलार्द्धों तुलना करने के क्रम में चुना गया था. न्यूरॉन्स के बीच कनेक्टिविटी या वास्तुकला में IUE प्रेरित परिवर्तन इस प्रकार उचित व्यवहार परीक्षण के साथ एक घाव और होने से IUE छेड़छाड़ क्षेत्र की आवश्यकता मैच evoking बिना प्रेरित किया जा सकता है वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर है.
दोष निवारण
कम कूड़े आकार IUE पिल्ले के अस्तित्व में वृद्धि के बारे में कई सुझाव हैं. सबसे पहले, electroporation के दौरान बहुत पतली कांच capillaries का उपयोग ऊतक lesio कम करने के लिएn सिफारिश की है. दूसरा, प्रत्येक गर्भाशय सींग की योनि अंत में पहली भ्रूण electroporate नहीं है: पहले जन्मे भ्रूण की मौत अन्य सभी भ्रूण की एक गर्भपात की संभावना बढ़ जाती है. तीसरा, जन्म के बाद, माँ चूहों कारण अक्सर प्रसवकालीन तनाव को उनकी संतान का हिस्सा मार डालते हैं. अतिरिक्त तनाव को कम करने के लिए, सही जन्म के बाद रहते इमेजिंग के साथ शुरू नहीं है, लेकिन सात दिनों के लिए प्रतीक्षा करें.
पिल्ले की GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने
एक सप्ताह में जन्म के बाद, IVIS स्पेक्ट्रम के साथ लाइव दूरबीन प्रतिदीप्ति सूक्ष्म इमेजिंग या प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर या तो द्वारा प्रतिदीप्ति का कोई संकेत (epifluorescence और transfluorescence मोड, GFP / उत्तेजना उत्सर्जन के लिए: 465/520 एनएम और 500/540 एनएम). यह त्वचा की खोपड़ी और उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि की तरह ऊतकों के माध्यम से छोटी तरंग दैर्ध्य उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश के सीमित प्रसारण जानकारी के तहत प्रतिदीप्ति का उपयोग रोकने के दोनों संभव है किचूहे में स्थितियां ribed. चित्रा 6 में दिखाया गया है, रहने वाले जानवर में luciferase संकेत भी (खोपड़ी के बिना) विच्छेदित मस्तिष्क में पाया जा सकता है और वहाँ भी एक प्रतिदीप्ति संकेत (चित्रा 6D) detectable है.
निकट दूरी मस्तिष्क क्षेत्रों में bioluminescence का भेदभाव
यहां तक कि 3 डी चित्र में bioluminescence क्षेत्र का स्थान 100% की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है. या भविष्यवाणी क्षेत्र के नीचे के शीर्ष पर विशेष रूप से कोशिकाओं को भी गलती से निशाना बनाया और ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. सही स्थिति (7 चित्र देखें) पोस्टमार्टम (प्रतिदीप्ति) ऊतक विज्ञान के द्वारा नियंत्रित किया जाना है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों plasmids उपलब्ध कराने के लिए ट्रेसी युवा Pearse और Atsushi Kamiya धन्यवाद.
सी.के. करने के लिए, और बड़े पैमाने पर करने के लिए (डे 792/2-4) है, यह काम या और सी.के. (BMBF 01EW1003), DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) को न्यूरॉन Eranet डिस्कवर द्वारा वित्त पोषित किया गया
Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
kodan Tinktur forte | Schülke & Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
Surgical Scissors – sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
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