Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generering af Topisk Transgene rotter ved doi: 10.3791/50146 Published: September 24, 2013

Summary

Gener kan manipuleres under udviklingen af cortex eller hippocampus fra rotte via in utero elektroporation (IUE) ved E16, således at hurtige og målrettede ændringer i neuronal tilslutning til senere undersøgelser af adfærd eller neuropatologi hos voksne dyr. Postnatal in vivo-billeddannelse til styring af IUE succes udføres ved bioluminescens aktivere cotransficeret luciferase.

Abstract

I utero elektroporation (IUE) er en teknik, som giver mulighed for genetisk modificering af celler i hjernen for at undersøge neuronal udvikling. Hidtil har brugen af ​​IUE for at undersøge adfærd eller neuropatologi i den voksne hjerne været begrænset af utilstrækkelige metoder til overvågning af IUE transfektion succes med ikke-invasive teknikker i postnatal dyr.

For den aktuelle undersøgelse blev E16 rotter anvendt til IUE. Efter intraventrikulær injektion af nukleinsyrer i embryoner, anbringelse af pincet elektroder var kritisk for målretning enten cortex udvikle eller hippocampus.

Ventrikulær co-injektion og elektroporation af luciferasegenet tilladt overvågning af de transficerede celler postnatalt efter intraperitoneal luciferin injektion i bedøvede levende P7 pup ved in vivo bioluminescens, ved hjælp af en IVIS Spectrum enhed med 3D kvantificering software.

DISC1 gen i rotte cortex førte til amfetamin overfølsomhed. Cotransficeret GFP kunne påvises i neuroner ved post mortem fluorescens mikroskopi i kryosektioner angiver genekspression stede på ≥ 6 måneder efter fødslen.

Vi konkluderer, at postnatal bioluminescence billedbehandling giver evaluere succesen af ​​forbigående transfektioner med IUE hos rotter. Undersøgelser af indflydelsen af ​​aktuelle gen manipulationer under neurodevelopment på den voksne hjerne og dens tilslutning er lettet. For mange videnskabelige spørgsmål, kan denne teknik supplere eller endog erstatte anvendelsen af ​​transgene rotter og giver en ny teknologi til adfærdsmæssige neuroscience.

Introduction

Udviklingen af in utero elektroporation (IUE) metode, der giver mulighed for en modulering af genekspression i hjernens udvikling, har været et gennembrud, da den gjorde det muligt at studere nervesystemets udvikling med relativ lethed. 1-7 Ændringer i ekspressionsniveauer af et mål gen i en specifik hjerne region i løbet af embryo-og / eller perinatal udvikling hos gnavere blev påvist til kritisk indflydelse neuronal proliferation, migration, arborization, og tilslutningsmuligheder. 8-10

Skizofreni er en kompleks psykisk sygdom med akutte og kroniske symptomer, der er relateret til neurologiske abnormiteter 11, 12 og derfor er mange af de identificerede kandidatgener for skizofreni undersøges for potentielle modulerende effekter på nervesystemets, som for eksempel for det sprængte-i-skizofreni -1 (DISC1 genet) 13-15.

Hjernens udvikling er reguleed af genetiske faktorer og deres samspil med miljøet, der spiller roller i præ-, peri-og postnatale udviklingsmæssige perioder. En væsentlig genetisk risikofaktor for forskellige adfærdsmæssige forstyrrelser er DISC1 16-genet. DISC1 knockdown fører til migration defekter i mus 13, 17, og manipulation af DISC1 ekspression i den udviklende cortex af IUE har vist sig at påvirke adfærd voksne mus 18.

Manipulering hjernen genekspression ved IUE har flere fordele 19 over frembringelsen af transgene dyr linjer. Først genekspression indenfor områder af interesse nås inden for uger til måneder snarere end flere generationer af ynglende transgene gnavere linjer. For det andet er kompenserende mekanismer i den tidlige udvikling, der kan skjold fænotyper i germline-manipuleret dyr 20 undgås. For det tredje, ved at målrette kun en bestemt celle population eller et bestemt område af hjernen, migratieller spredning forskelle kan sammenlignes direkte med den ikke-mutant eller kontrollere kontralaterale side, hvis ensidige elektroporeringer vælges. På den anden side betyder IUE ikke nøjagtigheden af ​​promotordrevet cre / lox-induceret timingen af ​​ekspression og kun en subpopulation af celler i et bestemt område er målrettet fører til en mosaik slags genekspressionsmønster.

For mange eksperimentelle applikationer i voksne gnavere, kan en forbigående transfektion af et begrænset antal celler i et område af hjernen være tilstrækkeligt eller endog ønsket, således at den største fordel ved stabile kimcellelinje-transgene gnavere er ubetydelig. Faktisk IUE er nyttigt at undersøge, om nogle unormalt udviklede celler kan påvirke et helt netværk af celler eller kredsløb. En anden fordel kan være i stand til at påvise non-celle-autonom virkninger af et gen på grund af den mosaik karakter hit. Desuden generation af transgene og knockout rotter er stadig i sin vorden, og brugaf IUE i denne art for at studere afvigende hjernens udvikling konsekvenser er af stor interesse.

Hidtil en væsentlig hindring for at bruge IUE til undersøgelse interventions konsekvenser i disse dyr som voksne er manglende overvågning elektroporation succes. Hidtil GFP-co-transficeret fluorescerende neuroner i live nyfødte rotteunger kunne ikke påvises under en passende binokulært fluorescensmikroskop eller fluorescens billeddannelse af IVIS Spectrum.

For at overvinde denne hindring, vi co-transficeres en luciferasereportergenet og udført bioluminescence levende billeddannelse af hvalpe med 3-dimensionelle (3D) kvantificering af det IUE hjerne-området.

Som et eksempel til at demonstrere anvendeligheden af ​​denne metode i en senere funktionelt assay teste neuro genmanipulation, en co-injektion af plasmider indeholdende humant DISC1 luciferase, og GFP i den laterale ventrikel i rotteembryoer in vivo, blev et faststof bioluminescens signal stammer fra luciferin metabolisme ved co-transficeret luciferasegenet påvises op til fem uger efter fødslen. 3D-målinger af elektroporerede hjerne område tilladt kvantificering, hvorved blev identificeret hvalpe med utilstrækkelig eller forlagt elektroporation fra starten, og dermed, så tildelingen af ​​IUE dyr (gen af ​​interesse og krypterede kontrol) til eksperimentelle grupper med matchede elektroporerede hjernen områder med lav variabilitet . Brugen af ​​voksne IUE rotter i adfærdsmæssige paradigmer blev demonstreret som et eksempel på nytten af ​​denne protokol.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af den ansvarlige Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301) i overensstemmelse med national og europæisk lovgivning.

1.. In utero Elektroporation

Denne metode er blevet beskrevet i detaljer i JOVE for rotten ved Walantus et al. 3. samt Rice et al. 4 og her samlet kun kortvarigt. Et kuld størrelse på 6-8 unger giver et godt resultat. Der bør være mindst to ikke-elektroporerede embryoner med henblik på at øge den samlede overlevelse (se nedenfor).

  1. Forbered DNA-blanding, der indeholder 1,5 mg / ul target-plasmid (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 overekspression: pCAX 21), 0,5 ug / ul Luciferase indeholdende plasmid (pCAX), 0,5 ug / ul GFP indeholdende plasmid (pCAGGS 22) i 1x PBS-opløsning farvede lys blue med Fast Green Dye.
  2. Forbered kanyler ud af glaskapillarer med en nål Pipette Puller. Og sterilisere kirurgiske instrumenter enten ved autoklavering eller inkubation med en alkohol-baseret desinfektionsmiddel (Kodan Tinktur forte).
  3. Administrere en præoperativ dosis af buprenorphin (0,05 mg / kg) 15 minutter før kirurgi til en gravid rotte 16 dage efter befrugtning (E16). Derefter bedøver dyret i en isofluran kammer.
    1. Efter anæstesi, placere rotte i liggende stilling på en 37 ° C opvarmet operation bord med åndedrætsværn tilsluttet anæstesi enhed ved hjælp af ilt omgivelser på 0,4 L / min, og isofluran på 1,8%.
    2. Efter barbering maven, desinficere det barberede område tre gange med Kodan Tinktur Forte (en alkohol-baseret desinfektionsmiddel).
    3. Dæk rotten med sterile klude, udsætter kun de barberede operation felt.
  4. Udfør i livmoderen elektroporation.
    1. Skær maven med en scissor langs linea alba (~ 2 cm).
    2. Expose Uterushornene omhyggeligt med en ring pincet.
    3. Sørge for at holde livmoderen væg våd med varmet steril PBS under hele operationen.
    4. Injicere DNA-opløsning med en tynd glas nål i en af ​​de laterale ventrikel af embryonerne.
    5. Anbring 7 mm elektrode omkring hovedet af embryoet. At ramme en celle population af øvre kortikale lag, udføre IUE på E16 23 og den positive elektrode på halvkugle over det injicerede ventrikel med en svag ryg / lateral tendens. At målrette hippocampusceller ændre den positive elektrode placering til den modsatte side end den injicerede ventrikel med sideforskydning til let dorsal retning (figur 1).
    6. Udfør elektroporation af fem 50 msek impulser ved 55 V med 950 msek bryder med en firkantet bølge puls elektroporator.
    7. Spare første embryo på vaginal ende af hver livmoderhornet for at øge than chancer for overlevelse af alle embryoner.
    8. Sæt livmoderhornene tilbage til moderen rotter.
    9. Stich bugvæggen op med en absorberbar Vicryl kirurgisk suturmateriale.
    10. Luk huden med Vicryl sutur materiale eller med sutur klip.
    11. Placer mor rotte tilbage i hjemmet bur og holde det varmt for 2-3 timer.
    12. Hold rotterne alene i deres hjem bur i dyreanlægget rum og foder ad libitum. De føder mellem E22-24.
    13. Hold rotteunger med deres mor i tre uger, og adskille dem bagefter efter køn.

2. Bioluminescens Levende Imaging af den enzymatiske luciferasereaktionen

Denne metode anvendes til at analysere den position in utero transficerede celler. Coelektroporeret ildflueluciferase cDNA omsættes til aktiv luciferase, som ved metaboliske D-luciferin at oxyluciferin, udsender en foton (figur 2 (figur 4).

I den foreliggende undersøgelse blev luciferaseassayet og bioluminescence billedbehandling udført starter ved P7. Dette tidspunkt blev valgt til at tillade mor og unger til at komme sig efter fødslen stress. Ved første arbejder med hvalpene på P0 blev ungernes overlevelse hårdt ramt på, at hvalpene blev fundet døde eller spist af moderen.

I første omgang er rotteunger med vellykket elektroporation identificeret ved et 2D-bioluminescence billede med en eksponeringstid på tre minutter. Efterfølgende positive hvalpe bruges til at skabe 3D-billeder for at angive placeringen af ​​den elektroporerede område.

  1. Fortynd D-luciferin natriumsalt i PBS til en koncentration på 15 mg / ml og steriliseres ved filtrering gennem et sterilt sprøjtefilter.
  2. Hvalpene vejes.
  3. Tag hvalpen i den ene hånd med maven på toppen og strække maven lidt. Injicer 10 ul / g legemsvægt af luciferin opløsning intraperitoneal. For ældre og mere adrætte dem, pre-bedøve hvalpene med isofluran i induktion kammer inden injektion luciferin.
  4. Tænd for isofluran tilstrømning af XGI-8 Gas Anæstesi system i IVIS Spectrum med 3% isofluran.
  5. Sæt snude i glasset næse kegler Anæstesi System.
  6. Hold dyret i en liggende stilling, indtil det er i dyb anæstesi (2-3 min.) Så reducere isofluran tilstrømning til 1,5%.
  7. Vælg et 2D-bioluminescens måling for at vælge positive hvalpe fra hele kuldet. Brug følgende indstillinger
    Skærm 1
    Klik her for at se større figur .
    1. Indstil en checkmark om fotografi med medium Binning og F / Stop på 8, tager kameraet et billede fra oven efter start målingen.
    2. Indstil exciteringsfilter: blok.
    3. Indstil Emission filter: åben.
    4. Sæt Binning til medium.
    5. Set F / Stop ved 1.
    6. Set Stage niveau A.
    7. Indstil luminescens eksponeringstid til 180 sek.
  8. Til oprettelse af 3D-billeder for bedre at kvantificere elektroporerede område fra de positive unger bruge følgende DLIT indstillingerne for ildflueluciferase.
    Skærm 3
    Klik her for at se større figur .
    1. Sæt et flueben på Foto, tager kameraet et billede fra oven efter start målingen.
    2. Sæt et flueben på Struktur, er overfladen af ​​dyret scannet af IVIS forudgående bioluminescence måling.
    3. USE efter Emission filtre og eksponering tidsindstillinger indtil en alder af to uger:
      Emission filter 1: 590 nm, eksponeringstid 300 sek
      Emission filter 2: 600 nm, eksponeringstid 240 sek
      Emission filter 3: 620 nm, eksponeringstid 180 sek
      Emission filter 4: 640 nm, eksponeringstid 120 sek
      For rotter er ældre end P20
      Emission filter 1: 600 nm, eksponeringstid 300 sek
      Emission filter 2: 620 nm, eksponeringstid 300 sek
      Emission filter 3: 640 nm, eksponeringstid 300 sek
      Skærm 3
      Klik her for at se større figur .
      På grund af faldet i signalstyrke i ældre dyr, er eksponeringstiden udvidet til de tre bedst emissionsfiltre.
    4. Set Stage B-niveau
    5. Sæt Binning til medium.
    6. Set F / Stop ved 1
  9. Efter målingen, mar k rotterne med en earhole kode til at skelne dem fra hinanden, og for at matche dem til IVIS Live-Imaging billeder
  10. Ved afslutningen af ​​målingen, slukke isofluran tilstrømning og holde rotten på den varmes plade i nogle minutter før den returneres til dens bur.

3. Analyse af bioluminescens Images

Den generation af 3D-billeder, 3D-film og kvantificering af mængden af ​​signalkilden er lavet af Living Billede software pre-installeret på IVIS Spectrum.

  1. Generering af 3D-billeder
    1. Først rekonstruere en overflade topografi, derfor sætte tærsklen mellem 20-30%.
      Skærm 4
      Klik her for at se større figur .
      Skærm 5
      een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
    2. Start DLIT 3D rekonstruktion med et billede grænse på 10% for hver bølgelængde.
      Skærm 7
      Klik her for at se større figur .
      Skærm 8
      Klik her for at se større figur .
      Skærm 9
      Klik her for at se større figur .
    3. Opret 3D-film ved hjælp af animere knappen inde i 3D-værktøjslinjen.
    4. Vælge forskellige orienteringer af 3D-billedet, samt zoome synspunkter som centrale rammer og tryk på 'Record & #39, knap, registrering overgangen fra en position / orientering til en anden.
      Skærm 10
      Klik her for at se større figur .

4.. Behavioral Testing

Behavioral test blev udført med henblik på at afgøre, om IUE-medierede gen manipulationer i rotter kunne indlede langsigtede virkninger, der fortsat ind i voksenalderen. I den nuværende særlige tilfælde, effekten af ​​forbigående, ensidig fuld længde human DISC1 kortikale overekspression efter IUE blev undersøgt ved at teste bevægelse i et åbent område (AF), med og uden en lav dosis af amfetamin, som en specifik test for dopamin-relaterede adfærd 24. I en lignende procedure udføres af Niwa et al. I IUE mus under anvendelse DISC1 knockdown, IUE mus, men ikke kontrol viste overfølsomhedamfetamin 18.

Rotter, der blev i livmoderen elektroporerede med en DISC1 overudtrykker vektor blev afholdt under laboratorieforhold med 12 timers lys fra 07:00 til 07:00 og blev fodret ad libitum. Efter 3 måneders alderen, rotterne adfærdsmæssige test.

Til kvantificering af bevægelse som en udlæsning af amfetamin effekter, en open-feltet i en Tru Scan aktivitet, der er beliggende i et lyd-og lys-isolerede kammer blev brugt. Dette system måler varigheden og afstand dyret bevæger sig, tid og distance tilbragt i margenen eller midten af det åbne område, samt opdræt adfærd 25.

  1. På den første dag, teste efter saltvand injektion
    1. Dyrene vejes.
    2. Indsprøjtes intraperitonealt 1 ul / g legemsvægt af en saltopløsning (1x PBS).
    3. Lige efter injektion, aflive dyret i den åbne område og begynde måling af TruScan system. Optag i 15 min end underinddele data i 3 x 5 min dele.
    4. Aflive dyret tilbage i sit eget bur.
  2. Anden dag, test på amfetamin indsprøjtning
    1. Dyrene vejes.
    2. Indsprøjtes intraperitonealt 1 ul / g legemsvægt af en 0,5 mg / ml amfetamin opløsning.
    3. Lige efter injektion aflive dyret i den åbne område og begynde måling af TruScan system. Optag i 15 minutter og underinddele data i 3 x 5 min dele.
    4. Sende dyret tilbage til sit hjem bur.
  3. Analysere bevægelse og opdræt adfærd genereret af specifikke Tru Scan software. Opret Grafer med GraphPad (Prism) og beregne statistikker SPSS Statistics software.

Representative Results

Figur 3 viser lever imaging målinger af tre rotteunger ved P7 efter injektion af 150 mg luciferin / kg legemsvægt. Forskelle i signalstyrke angiver variation i effektiviteten af ​​IUE er synlige. Stærke bioluminescens signaler registreres, indtil P36 (figur 4). I figur 5 er mulighed for at definere kortikale (5A og 5C) og hippocampus (figur 5B og 5D) elektroporation ved bioluminescens imaging afbildet. Korrelation af bioluminescens signal (figur 7A) med fluorescenssignalet efter kraniet fjernelse (figur 7B), og de ​​tilsvarende GFP-elektroporeret celler i cryosectioned hjernen (figur 8) på P14 er afbildet i figur 6-8. Of note, var der ingen detektion af et fluorescenssignal i levende rotter på noget tidspunkt.

telt "> In vivo bioluminescens imaging giver omtrentlige diskrimination af forskellige elektroporerede områder i hjernen ved 2D (5A og 5B), som er væsentligt forbedret med DLIT program IVIS Spectrum software genererer 3D-billeder (figur 5C og 5D). I de viste eksempler , elektroporering af den præfrontale cortex og hippocampus kunne skelnes. Det skal bemærkes, at der sigtes til at elektroporere hippocampus nogle progenitorceller til cortex liggende dorsale hippocampus kan også blive ramt (figur 7).

Rotter ensidigt utero elektroporeret med pCAX vektor i cortex og efterfølgende overudtrykker humane fuldlængde DISC1 blev undersøgt for både spontan og amfetamin-induceret hyperaktivitet som voksne. Rotter elektroporeret med pCAX-DISC1 var overfølsomme over for en lav dosis af amfetamin. Disse rotter flyttet væsentligt more efter amfetamin behandling end efter at saltvand injektion, hvorimod kontroldyr ikke (Figur 10).

Figur 1
Figur 1. Ordning af elektrode position for A) cortex elektroporation og B) hippocampus elektroporation, grøn = injiceret DNA-Mix i ventrikel.

Figur 2
Figur 2. Luciferasereaktionen.

Figur 3
Figur 3. Luminescence måling af P7-rotter efter injektion af 150 mg / kg legemsvægt luciferin; eksponeringstid 180 sek A) rotte uden luminescenssignal, B) rotte med en svag bioluminescens signal, C) rotte med en stærk luminescenssignal.

Figur 4
Figur 4.. Tid linje på hinanden følgende bioluminescens målinger af den samme rotte efter injektion af 150 mg / kg luciferin viser et stort tidsvindue hvor IUE succes kan påvises.

Figur 5
. Figur 5 Illustration af forskelle mellem kortikale og hippocampus elektroporation på P7 A) og B) 2D billeder;. C) & D) 3D billeder; A) & C) fra cortex, B) & D) fra hippocampus.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Klik her for at se større figur.

Figur 6
Figur 6. Illustration af E16 hippocampus elektroporation af en rotte hvalp på P14 A) 2D-billede af bioluminescens B) 3D-illustration af bioluminescence signal C) dissekeret hjerne med bioluminescence signal D) hjerne med GFP epi-fluorescens-signalet. Klik her for at se større figur .

Figur 7
Figur 7. Detalje af en fluorescens-billede fra en 20 um cryo afsnit af samme P14 rottehjerne elektroporeret med GFP indeholdende plasmid og luciferasevektor kerner farvning med DAPI, CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = dentatgyrus, FC = Fasciolarum cinereum.

Video 1. 3D-animation af en hippocampus elektroporerede rotte på P14.

Figur 8
Figur 8. Amfetamin testprogram: første dag saltvand injektion før 15 min retssag, 24 timers senere amfetamin injektion før testning på åben mark kammeret.

Figur 9
Figur 9. Amfetamin test. Søjlediagram, som viser flyttet afstand (i cm) af dyret registreret af en TrueScan systemet over 15 min Hvide søjler = kontrolgruppe. Grå søjler = DISC1 overudtrykkende gruppe; kontrolgruppe n = 10; DISC1 overekspression gruppe n = 11; ANOVA: geno * behandling p = 0,043, T-Test for den samlede tid saltvand vs amfetamin ns = ikke signifikant pcontrol = 0,172, pDISC1 = 0,001.

Discussion

Vores undersøgelse viser, at IUE er velegnet til at generere voksne rotter med neuroner, der udtrykker et transgen i et selektivt område af hjernen, og at som et resultat af dette indgreb, disse dyr udviser ændringer i adfærd indikerer funktionaliteten af ​​det udførte manipulation. I denne undersøgelse, som et eksempel, rotter overudtrykker DISC1 ensidigt i en lille del af den præfrontale cortex viste overfølsomhed retning af amfetamin (figur 9).

Valg af rotter for elektroporation succes ved in vivo bioluminescens billeddannelse var effektive til at kontrollere for den iboende variabilitet IUE celletransfektion og blev anvendt til at generere grupper med en homogen IUE område med lav interindividuel variation til senere undersøgelser.

I denne undersøgelse, var vi i stand til at vælge elektroporeres unger fra kuldet ved påvisning af coelektroporeret GFP-induceret fluorescens i nyfødte dyr, selv thoUH på samme tid og i det samme dyr en bioluminescens signal lige så coelektroporeret luciferase kunne påvises efter luciferin injektion (figur 6), og GFP-udtrykkende neuroner stadig var til stede i hjernen i en alder af seks måneder. Vi konkluderer, at rotter, luciferase / luciferin-reaktionen er velegnet til at skelne dyr med vellykkede elektroporeret hjerner (figur 3).

Kvantitativ kontrol af IUE succes angår styrken af bioluminescens signal, som måles ved tællinger af fotoner inden for samme eksponeringstid (figur 3), og svarer til den enzymatiske aktivitet af co-udtrykt luciferase. Små bioluminescens signaler er påviselige ved 100-200 tællinger af fotoner, og på et udstråling ~ 1x10 4 fotoner / sec / cm 2 / steradian show 1.000-2.000 GFP-farvede celler i histologi i 6 måneder gammel rotte hjerne. Den højeste signal displagt en udstråling på op til ~ 5x10 6 fotoner / sek / cm 2 / steradian og ~ 64.000 tæller.

I Sprague Dawley rotte stamme, observerede vi en svækkelse af bioluminescence signal langs med stigende alder, og signalet forsvandt efter en alder af P35 (Figur 4). På dette tidspunkt ved vi ikke, om enten forbigående, plasmid vektor-baseret udtryk for luciferase falder, eller hvis bioluminescence signalet svækkes på grund af stigende hjerne masse, eller begge er årsagerne til den ophørende signal. For den nuværende funktionelle assay i voksne rotter, blev valget for adfærdsmæssige undersøgelser blot lavet baseret på placeringen af ​​signalet, men ikke ved bioluminescens signalstyrke.

Selvom 3D kvantitativ bioluminescens overvågning tilladt differentiering mellem forskellige elektroporeret områder (fig. 5), var dens accurateness begrænset til celler placeret i dybden dimension af hjernen fig. 6 viser et eksempel på en hippocampus elektroporation hvor bioluminescence måling i 2D-og 3D-billede viste en god positionering af elektroporation. I dissekeret post mortem hjerne blev en GFP-fluorescens signal detekteres på omtrent samme position som bioluminescence signal, hvilket indikerer korrekt målretning af hippocampus. Men histologi viser, at også celler i cortex dorsale hippocampus var blevet målet (figur 7). Dette indikerer, at bioluminescence analysen er et nyttigt redskab til at opdage positive, IUE hvalpe og også at have en idé om elektroporerede område, men i sidste ende kan billeddannelse ikke erstatte post mortem histologi til præcis lokalisere positivt målrettede celler.

Vores demonstration viser lovende for anvendelsen af ​​den IUE teknologi til at generere subtile målrettede manipulationer af kortikale eller hippocampus områder af hjernen til at simulere aberrances i cortical migration eller andre neurologiske defekter, der kan påvirke det voksne dyr. Mens bilateral elektroporation 26 har den fordel, at en sandsynlig større effekt på adfærd, er der også mere dødelighed af embryoner. Ensidig elektroporation blev valgt med henblik på at sammenligne de to halvkugler med én som en intern kontrol, samt for at vise, at selv IUE manipulere i en ensidig, lille region er tilstrækkelig til at ændre adfærd. IUE-inducerede ændringer i forbindelse eller arkitektur mellem neuroner kan således være fremkaldt uden at fremmane en læsion og det krævede kamp i den til-være-IUE manipulerede region med den passende adfærdsmæssige test er afhængig af den videnskabelige spørgsmål.

Trouble shooting

Reduceret kuldstørrelse Der er flere forslag vedrørende øget overlevelse IUE hvalpe. Første anvendelsen af ​​meget tynde glaskapillarer under elektroporering for at minimere væv lesioanbefales n. Andet, ikke elektroporere første embryo på vaginal slutningen af ​​hver livmoderhornet: død af den første-fødte foster øger chancerne for en afbryde alle andre embryoner. For det tredje, efter fødslen, moderrotter ofte dræbe en del af deres afkom som følge af perinatal stress. For at reducere yderligere stress, ikke starte med den direkte billedvisning lige efter fødslen, men vente i syv dage.

GFP-fluorescens detektion af hvalpene

På en uge efter fødslen, intet signal af fluorescens ved enten at bruge levende kikkert fluorescens mikroskopiske billeddannelse eller fluorescens billeddannelse med IVIS Spectrum (epifluorescens og transfluorescence modes, for GFP excitation / emission: 465/520 nm og 500/540 nm). Det er muligt, at både den begrænsede overførsel af kortbølget excitering og emission lys gennem vævet som kraniet og den høje autofluorescens baggrund af huden forhindre anvendelse af fluorescens under described betingelser hos rotter. Som vist i figur 6 kan luciferasesignal i levende dyr også påvises i det dissekerede hjernen (uden kraniet), og der, også et fluorescenssignal kan detekteres (figur 6D).

Differentiering af bioluminescens i tætliggende hjerneområder

Selv i 3D illustration placeringen af ​​bioluminescens område, der ikke kan forudsiges til 100%. Især celler oven på eller under den forudsagte område kan også målrettes tilfældigt og transficeret. Den nøjagtige position skal kontrolleres ved post mortem (fluorescens) histologi (se figur 7).

Disclosures

Forfatterne til denne undersøgelse ikke har økonomisk interesse i denne undersøgelse og er ikke blevet sponsoreret af industrien i denne undersøgelse. Åben adgang gebyrer bidrog med PerkinElmer Inc. efterfølgende offentliggørelse.

Acknowledgments

Forfatterne takker Tracy Young-Pearse og Atsushi Kamiya for at give plasmider.

Dette arbejde blev finansieret af NEURON-ERANET Oplev til OR og CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CK, og (DE 792/2-4) til MASS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O
100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  2. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  3. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  4. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  5. Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  7. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
  8. Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  10. Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
  11. Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
  12. Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
  13. Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
  14. Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
  15. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
  16. Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  17. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
  18. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  19. Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. 169-179 (2012).
  20. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
  21. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  22. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
  23. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
  24. Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
  25. Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
  26. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
Generering af Topisk Transgene rotter ved<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescens Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).More

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter