Gener kan manipuleres under udviklingen af cortex eller hippocampus fra rotte via in utero elektroporation (IUE) ved E16, således at hurtige og målrettede ændringer i neuronal tilslutning til senere undersøgelser af adfærd eller neuropatologi hos voksne dyr. Postnatal in vivo-billeddannelse til styring af IUE succes udføres ved bioluminescens aktivere cotransficeret luciferase.
I utero elektroporation (IUE) er en teknik, som giver mulighed for genetisk modificering af celler i hjernen for at undersøge neuronal udvikling. Hidtil har brugen af IUE for at undersøge adfærd eller neuropatologi i den voksne hjerne været begrænset af utilstrækkelige metoder til overvågning af IUE transfektion succes med ikke-invasive teknikker i postnatal dyr.
For den aktuelle undersøgelse blev E16 rotter anvendt til IUE. Efter intraventrikulær injektion af nukleinsyrer i embryoner, anbringelse af pincet elektroder var kritisk for målretning enten cortex udvikle eller hippocampus.
Ventrikulær co-injektion og elektroporation af luciferasegenet tilladt overvågning af de transficerede celler postnatalt efter intraperitoneal luciferin injektion i bedøvede levende P7 pup ved in vivo bioluminescens, ved hjælp af en IVIS Spectrum enhed med 3D kvantificering software.
<pclass = "jove_content"> Area definition af bioluminescens kunne tydeligt skelne mellem kortikale og hippocampus elektroporeringer og registrere et signal langs over tid op til 5 uger efter fødslen. Denne billeddannelse teknik tillod os at vælge hvalpe med et tilstrækkeligt antal transficerede celler antages nødvendig for at udløse biologiske effekter og efterfølgende at udføre adfærdsmæssige undersøgelser ved 3 måneder gammel. Som et eksempel, denne undersøgelse viser, at IUE med den humane fuldlængde DISC1 gen i rotte cortex førte til amfetamin overfølsomhed. Cotransficeret GFP kunne påvises i neuroner ved post mortem fluorescens mikroskopi i kryosektioner angiver genekspression stede på ≥ 6 måneder efter fødslen.Vi konkluderer, at postnatal bioluminescence billedbehandling giver evaluere succesen af forbigående transfektioner med IUE hos rotter. Undersøgelser af indflydelsen af aktuelle gen manipulationer under neurodevelopment på den voksne hjerne og dens tilslutning er lettet. For mange videnskabelige spørgsmål, kan denne teknik supplere eller endog erstatte anvendelsen af transgene rotter og giver en ny teknologi til adfærdsmæssige neuroscience.
Udviklingen af in utero elektroporation (IUE) metode, der giver mulighed for en modulering af genekspression i hjernens udvikling, har været et gennembrud, da den gjorde det muligt at studere nervesystemets udvikling med relativ lethed. 1-7 Ændringer i ekspressionsniveauer af et mål gen i en specifik hjerne region i løbet af embryo-og / eller perinatal udvikling hos gnavere blev påvist til kritisk indflydelse neuronal proliferation, migration, arborization, og tilslutningsmuligheder. 8-10
Skizofreni er en kompleks psykisk sygdom med akutte og kroniske symptomer, der er relateret til neurologiske abnormiteter 11, 12 og derfor er mange af de identificerede kandidatgener for skizofreni undersøges for potentielle modulerende effekter på nervesystemets, som for eksempel for det sprængte-i-skizofreni -1 (DISC1 genet) 13-15.
Hjernens udvikling er reguleed af genetiske faktorer og deres samspil med miljøet, der spiller roller i præ-, peri-og postnatale udviklingsmæssige perioder. En væsentlig genetisk risikofaktor for forskellige adfærdsmæssige forstyrrelser er DISC1 16-genet. DISC1 knockdown fører til migration defekter i mus 13, 17, og manipulation af DISC1 ekspression i den udviklende cortex af IUE har vist sig at påvirke adfærd voksne mus 18.
Manipulering hjernen genekspression ved IUE har flere fordele 19 over frembringelsen af transgene dyr linjer. Først genekspression indenfor områder af interesse nås inden for uger til måneder snarere end flere generationer af ynglende transgene gnavere linjer. For det andet er kompenserende mekanismer i den tidlige udvikling, der kan skjold fænotyper i germline-manipuleret dyr 20 undgås. For det tredje, ved at målrette kun en bestemt celle population eller et bestemt område af hjernen, migratieller spredning forskelle kan sammenlignes direkte med den ikke-mutant eller kontrollere kontralaterale side, hvis ensidige elektroporeringer vælges. På den anden side betyder IUE ikke nøjagtigheden af promotordrevet cre / lox-induceret timingen af ekspression og kun en subpopulation af celler i et bestemt område er målrettet fører til en mosaik slags genekspressionsmønster.
For mange eksperimentelle applikationer i voksne gnavere, kan en forbigående transfektion af et begrænset antal celler i et område af hjernen være tilstrækkeligt eller endog ønsket, således at den største fordel ved stabile kimcellelinje-transgene gnavere er ubetydelig. Faktisk IUE er nyttigt at undersøge, om nogle unormalt udviklede celler kan påvirke et helt netværk af celler eller kredsløb. En anden fordel kan være i stand til at påvise non-celle-autonom virkninger af et gen på grund af den mosaik karakter hit. Desuden generation af transgene og knockout rotter er stadig i sin vorden, og brugaf IUE i denne art for at studere afvigende hjernens udvikling konsekvenser er af stor interesse.
Hidtil en væsentlig hindring for at bruge IUE til undersøgelse interventions konsekvenser i disse dyr som voksne er manglende overvågning elektroporation succes. Hidtil GFP-co-transficeret fluorescerende neuroner i live nyfødte rotteunger kunne ikke påvises under en passende binokulært fluorescensmikroskop eller fluorescens billeddannelse af IVIS Spectrum.
For at overvinde denne hindring, vi co-transficeres en luciferasereportergenet og udført bioluminescence levende billeddannelse af hvalpe med 3-dimensionelle (3D) kvantificering af det IUE hjerne-området.
Som et eksempel til at demonstrere anvendeligheden af denne metode i en senere funktionelt assay teste neuro genmanipulation, en co-injektion af plasmider indeholdende humant DISC1 luciferase, og GFP i den laterale ventrikel i rotteembryoer <sup> 3 efterfulgt af elektroporering med en pincet elektrode blev udført. Mens fluorescenssignaler ikke kunne påvises i postnatale faser in vivo, blev et faststof bioluminescens signal stammer fra luciferin metabolisme ved co-transficeret luciferasegenet påvises op til fem uger efter fødslen. 3D-målinger af elektroporerede hjerne område tilladt kvantificering, hvorved blev identificeret hvalpe med utilstrækkelig eller forlagt elektroporation fra starten, og dermed, så tildelingen af IUE dyr (gen af interesse og krypterede kontrol) til eksperimentelle grupper med matchede elektroporerede hjernen områder med lav variabilitet . Brugen af voksne IUE rotter i adfærdsmæssige paradigmer blev demonstreret som et eksempel på nytten af denne protokol.
Vores undersøgelse viser, at IUE er velegnet til at generere voksne rotter med neuroner, der udtrykker et transgen i et selektivt område af hjernen, og at som et resultat af dette indgreb, disse dyr udviser ændringer i adfærd indikerer funktionaliteten af det udførte manipulation. I denne undersøgelse, som et eksempel, rotter overudtrykker DISC1 ensidigt i en lille del af den præfrontale cortex viste overfølsomhed retning af amfetamin (figur 9).
Valg af rotter for elektroporation succes ved in vivo bioluminescens billeddannelse var effektive til at kontrollere for den iboende variabilitet IUE celletransfektion og blev anvendt til at generere grupper med en homogen IUE område med lav interindividuel variation til senere undersøgelser.
I denne undersøgelse, var vi i stand til at vælge elektroporeres unger fra kuldet ved påvisning af coelektroporeret GFP-induceret fluorescens i nyfødte dyr, selv thoUH på samme tid og i det samme dyr en bioluminescens signal lige så coelektroporeret luciferase kunne påvises efter luciferin injektion (figur 6), og GFP-udtrykkende neuroner stadig var til stede i hjernen i en alder af seks måneder. Vi konkluderer, at rotter, luciferase / luciferin-reaktionen er velegnet til at skelne dyr med vellykkede elektroporeret hjerner (figur 3).
Kvantitativ kontrol af IUE succes angår styrken af bioluminescens signal, som måles ved tællinger af fotoner inden for samme eksponeringstid (figur 3), og svarer til den enzymatiske aktivitet af co-udtrykt luciferase. Små bioluminescens signaler er påviselige ved 100-200 tællinger af fotoner, og på et udstråling ~ 1×10 4 fotoner / sec / cm 2 / steradian show 1.000-2.000 GFP-farvede celler i histologi i 6 måneder gammel rotte hjerne. Den højeste signal displagt en udstråling på op til ~ 5×10 6 fotoner / sek / cm 2 / steradian og ~ 64.000 tæller.
I Sprague Dawley rotte stamme, observerede vi en svækkelse af bioluminescence signal langs med stigende alder, og signalet forsvandt efter en alder af P35 (Figur 4). På dette tidspunkt ved vi ikke, om enten forbigående, plasmid vektor-baseret udtryk for luciferase falder, eller hvis bioluminescence signalet svækkes på grund af stigende hjerne masse, eller begge er årsagerne til den ophørende signal. For den nuværende funktionelle assay i voksne rotter, blev valget for adfærdsmæssige undersøgelser blot lavet baseret på placeringen af signalet, men ikke ved bioluminescens signalstyrke.
Selvom 3D kvantitativ bioluminescens overvågning tilladt differentiering mellem forskellige elektroporeret områder (fig. 5), var dens accurateness begrænset til celler placeret i dybden dimension af hjernen fig. 6 viser et eksempel på en hippocampus elektroporation hvor bioluminescence måling i 2D-og 3D-billede viste en god positionering af elektroporation. I dissekeret post mortem hjerne blev en GFP-fluorescens signal detekteres på omtrent samme position som bioluminescence signal, hvilket indikerer korrekt målretning af hippocampus. Men histologi viser, at også celler i cortex dorsale hippocampus var blevet målet (figur 7). Dette indikerer, at bioluminescence analysen er et nyttigt redskab til at opdage positive, IUE hvalpe og også at have en idé om elektroporerede område, men i sidste ende kan billeddannelse ikke erstatte post mortem histologi til præcis lokalisere positivt målrettede celler.
Vores demonstration viser lovende for anvendelsen af den IUE teknologi til at generere subtile målrettede manipulationer af kortikale eller hippocampus områder af hjernen til at simulere aberrances i cortical migration eller andre neurologiske defekter, der kan påvirke det voksne dyr. Mens bilateral elektroporation 26 har den fordel, at en sandsynlig større effekt på adfærd, er der også mere dødelighed af embryoner. Ensidig elektroporation blev valgt med henblik på at sammenligne de to halvkugler med én som en intern kontrol, samt for at vise, at selv IUE manipulere i en ensidig, lille region er tilstrækkelig til at ændre adfærd. IUE-inducerede ændringer i forbindelse eller arkitektur mellem neuroner kan således være fremkaldt uden at fremmane en læsion og det krævede kamp i den til-være-IUE manipulerede region med den passende adfærdsmæssige test er afhængig af den videnskabelige spørgsmål.
Trouble shooting
Reduceret kuldstørrelse Der er flere forslag vedrørende øget overlevelse IUE hvalpe. Første anvendelsen af meget tynde glaskapillarer under elektroporering for at minimere væv lesioanbefales n. Andet, ikke elektroporere første embryo på vaginal slutningen af hver livmoderhornet: død af den første-fødte foster øger chancerne for en afbryde alle andre embryoner. For det tredje, efter fødslen, moderrotter ofte dræbe en del af deres afkom som følge af perinatal stress. For at reducere yderligere stress, ikke starte med den direkte billedvisning lige efter fødslen, men vente i syv dage.
GFP-fluorescens detektion af hvalpene
På en uge efter fødslen, intet signal af fluorescens ved enten at bruge levende kikkert fluorescens mikroskopiske billeddannelse eller fluorescens billeddannelse med IVIS Spectrum (epifluorescens og transfluorescence modes, for GFP excitation / emission: 465/520 nm og 500/540 nm). Det er muligt, at både den begrænsede overførsel af kortbølget excitering og emission lys gennem vævet som kraniet og den høje autofluorescens baggrund af huden forhindre anvendelse af fluorescens under described betingelser hos rotter. Som vist i figur 6 kan luciferasesignal i levende dyr også påvises i det dissekerede hjernen (uden kraniet), og der, også et fluorescenssignal kan detekteres (figur 6D).
Differentiering af bioluminescens i tætliggende hjerneområder
Selv i 3D illustration placeringen af bioluminescens område, der ikke kan forudsiges til 100%. Især celler oven på eller under den forudsagte område kan også målrettes tilfældigt og transficeret. Den nøjagtige position skal kontrolleres ved post mortem (fluorescens) histologi (se figur 7).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Tracy Young-Pearse og Atsushi Kamiya for at give plasmider.
Dette arbejde blev finansieret af NEURON-ERANET Oplev til OR og CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CK, og (DE 792/2-4) til MASS
Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
kodan Tinktur forte | Schülke & Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
Surgical Scissors – sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
|