Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generering av Lokalt Transgena råttor genom doi: 10.3791/50146 Published: September 24, 2013

Summary

Gener kan manipuleras under utvecklingen av cortex eller hippocampus hos råtta genom i livmodern elektroporering (IUE) på E16, för att möjliggöra snabba och målinriktade ändringar i nervkopplingar för senare studier av beteende eller neuropatologi hos vuxna djur. Förlossnings in vivo imaging för kontroll av IUE framgång utförs av mareld att aktivera samtransfekterad luciferas.

Abstract

In utero elektroporering (IUE) är en teknik som tillåter genetisk modifiering av celler in i hjärnan för att undersöka neuronal utveckling. Hittills har användningen av IUE för att undersöka beteende eller neuropatologi i den vuxna hjärnan begränsats av otillräckliga metoder för övervakning av IUE transfektion framgång genom icke-invasiva tekniker i postnatala djur.

För den aktuella studien, var E16 råttor användes för IUE. Efter intraventrikulär injektion av nukleinsyrorna in i embryon, positioneringen av pincett elektroder var kritisk för inriktning antingen framkallnings cortex eller hippocampus.

Ventrikulär samtidig injektion och elektroporation av en luciferasgen tillåten övervakning av de transfekterade cellerna postnatalt efter intraperitoneal luciferin injektion i bedövades levande P7 pup av in vivo bioluminescens, med användning av en IVIS Spectrum enhet med 3D kvantifiering programvara.

DISC1 genen i råttcortex ledde till amfetamin överkänslighet. Samtransfekterad GFP kunde detekteras i nervceller med post mortem fluorescensmikroskopi i kryosnitt indikerar genuttryck närvarande vid ≥ 6 månader efter födseln.

Vi drar slutsatsen att postnatal mareld avbildning möjliggör utvärdering av framgången för transienta transfektioner med IUE hos råttor. Undersökningar om inverkan av aktuella genen manipulationer under neurodevelopment på den vuxna hjärnan och dess anslutning i hög grad underlättas. För många vetenskapliga frågor, kan denna teknik komplettera eller ersätta användningen av transgena råttor och tillhandahålla en ny teknik för Behavioral Neuroscience.

Introduction

Utvecklingen av det i livmodern elektroporering metoden (IUE) som möjliggör en modulering av genuttryck i den växande hjärnan, har varit ett genombrott eftersom det gjorde det möjligt att studera nervsystemets utveckling med relativ lätthet. 1-7 Förändringar i uttrycksnivåer av en mål-gen i en specifik hjärnregion under foster-och / eller perinatal utveckling hos gnagare har visat att kritiskt inflytande neuronal proliferation, migration, arborization, och anslutningsmöjligheter. 8-10

Schizofreni är en komplex psykisk sjukdom med akuta och kroniska symptom som har samband med nervsystemets avvikelser 11, 12 och därför är många av de identifierade kandidatgener för schizofreni undersöks för potentiella modulerande effekter på nervsystemets utveckling, som till exempel för den störs-in-schizofreni -1 (DISC1 genen) 13-15.

Hjärnans utveckling är regleed av genetiska faktorer och deras interaktion med miljön som spelar roll i pre-, peri-och postnatala utvecklingsperioder. En stor genetisk riskfaktor för olika beteendestörningar är de DISC1 16 genen. DISC1 Knockdown leder till migration defekter i möss 13, 17, och manipulation av DISC1 uttryck i framkallnings cortex genom IUE har visats påverka beteendet hos vuxna möss 18.

Manipulering hjärna genuttrycket IUE har flera fördelar 19 över generering av transgena djurlinjerna. Först genuttryck inom intresseområden uppnås inom veckor till månader i stället för flera generationer av avel transgena gnagare linjer. För det andra, är kompensationsmekanismer under tidig utveckling som kan skärma fenotyper i könsceller-engineered djur 20 undviks. För det tredje, genom att rikta endast en specifik cell population eller visst område i hjärnan, migratipå eller spridningsskillnader kan direkt jämföras med den icke-muterade eller kontrollera kontralaterala sidan om unilaterala electroporations väljs. Å andra sidan, betyder IUE inte noggrannheten hos promotordriven cre / lox-inducerad tidpunkten för expression och endast en subpopulation av celler i ett visst område är riktad som leder till en mosaik slags genuttrycksmönstret.

För många experimentella tillämpningar inom vuxna gnagare kan en övergående transfektion av ett begränsat antal celler i en hjärnregion som är tillräcklig, eller ens önskas, så att den stora fördelen av stabila, nedärvda-transgena gnagare är försumbar. I själva verket är IUE nyttigt att undersöka om några onormalt utvecklade celler kan påverka ett helt nätverk av celler eller kretsar. En annan fördel kan vara förmågan att visa icke cell-autonoma effekterna av en gen på grund av den mosaik natur träffen. Dessutom är den generation av transgena och knockout råttor fortfarande i sin linda och användningav IUE i denna art för att studera avvikande konsekvenser hjärnans utveckling är av stort intresse.

Hittills är ett stort hinder för att använda IUE för att undersöka interventions konsekvenser i dessa djur som vuxna bristen på övervakning elektroporation framgång. Hittills GFP-samtransfekterad fluorescerande nervceller i de levande nyfödda råttungar kunde inte upptäckas i en lämplig kikare fluorescensmikroskop eller med fluorescens avbildning av IVIS Spectrum.

För att övervinna detta hinder, vi samtransfekteras en luciferasrapportörgen och utfört mareld live-avbildning av valpar med 3-dimensionell (3D) kvantifiering av IUE hjärnområdet.

Som ett exempel för att visa att tillämpningen av denna metod i ett senare funktionell analys testar den neurodevelopmental genetisk manipulation, en co-injektion av plasmider innehållande mänskligt DISC1, luciferas, och GFP i den laterala ventrikeln av råttembryon in vivo, var en solid mareld signal kommer från luciferin metabolism genom samtransfekterad luciferasgen upptäckts upp till fem veckor efter födseln. 3D-mätningar av elektrohjärnområdet tillåts kvantifiering innebär att valpar med otillräcklig eller missriktad elektroporation identifierades från början, alltså, så att tilldelningen av IUE djur (gen av intresse och oordning kontroll) till experimentella grupper med matchade elektroporerade hjärnområden med låg variabilitet . Användningen av vuxna IUE råttor i beteende paradigm visades som exempel på nyttan av detta protokoll.

Protocol

Alla djurförsök har godkänts av den ansvariga Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301) i enlighet med nationell och europeisk lagstiftning.

1. I livmodern elektroporation

Denna metod har beskrivits i detalj i JoVE för råtta genom Walantus et al. Tre, liksom Rice et al. 4 och här sammanfattas under kort tid. En kullstorlek på 6-8 valpar ger ett bra resultat. Det bör finnas minst två icke-electroporated embryon i syfte att öka den totala överlevnaden (se nedan).

  1. Bered-DNA-blandning som innehåller 1,5 ug / ul av mål-Plasmid (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 överuttryck: pCAX 21), 0,5 | ig / | il Luciferase innehållande Plasmid (pCAX), 0,5 pg / pl GFP innehållande plasmiden (pCAGGS 22) i 1x PBS-lösning färgade ljus blue med Fast Green Dye.
  2. Förbered injektionsnålar ur glaskapillärer med en nål pipett avdragare. Och sterilisera kirurgiska instrument, antingen genom autoklavering eller inkubation med ett alkoholbaserat desinfektionsmedel (Kodan Tinktur forte).
  3. Administrera en preoperativ dos av buprenorfin (0,05 mg / kg) 15 minuter före operation till en gravid råtta 16 dagar efter befruktning (E16). Sedan söva djuret i en isofluran kammare.
    1. Vid anestesi, placera råttan i ryggläge på en 37 ° C-värmas operationsbordet med andningsmask kopplad till anestesi enhet med hjälp av inställnings syre vid 0,4 l / min och isofluran på 1,8%.
    2. Efter rakning buken, desinficera det rakade området tre gånger med Kodan Tinktur Forte (ett alkoholbaserat desinfektionsmedel).
    3. Täck råttan med sterila dukar, bara den rakade operationen fältet exponera.
  4. Utför i livmodern elektroporering.
    1. Skär buken med en scissor längs linea alba (~ 2 cm).
    2. Exponera livmoderhornen försiktigt med en ring pincett.
    3. Var noga med att hålla livmodern väggen våt med uppvärmd steril PBS under hela operationen.
    4. Injicera DNA-lösning med en tunn glasnålen i en av den laterala ventrikeln av embryona.
    5. Placera 7 mm elektroden runt huvudet av embryot. Att slå en cellpopulation av övre kortikala skikt, utför IUE vid E16 23 och placera den positiva elektroden på halvsfären ovanför den injicerade kammare med en svag rygg / sido tendens. Om du vill rikta hippocampus celler ändrar positiva elektrodplacering på motsatt sida än den injicerade ventrikeln med sido till lätt rygg riktning (figur 1).
    6. Utför elektroporation av fem 50 ms pulser vid 55 V med 950 ms avbrott med en fyrkantpuls elektroporator.
    7. Spare första embryo i den vaginala änden av varje livmoderhorn för att öka than chanser att överleva i alla embryon.
    8. Sätt tillbaka i moder råtta livmodern hornen.
    9. Stich bukväggen med ett absorber Vicryl kirurgiskt suturmaterial.
    10. Stäng huden med Vicryl suturmaterial eller med suturklämmor.
    11. Placera moder råttan tillbaka in i buren och hålla den varm under 2-3 timmar.
    12. Håll ensamma råttor i sitt hem bur i djuranläggningen rummet och foder ad lib. De föder mellan E22-24.
    13. Håll råttungar med sin mamma i tre veckor och separera dem efteråt efter kön.

2. Bioluminiscens Live avbildning av den enzymatiska luciferasreaktionen

Denna metod används för att analysera positionen för in utero transfekterade celler. Co-elektro eldfluga luciferas cDNA är översatt till ett aktivt luciferas, som vid metaboliserande D-luciferin att oxyluciferin, avger en foton (figur 2 (Figur 4).

I den aktuella studien, var luciferasanalysen och mareld bildbehandling utförs med början på P7. Denna tidpunkt valdes för att låta mor och valpar att återhämta sig från födseln stress. När initialt arbeta med valparna vid P0, var överlevnad drabbats hårt i att valparna hittades döda eller uppätna av mamman.

Initialt är råttungar med framgångsrik elektroporation identifieras av en 2D-mareld bild med en exponeringstid på tre minuter. Därefter positiva valpar som används för att skapa 3D-bilder för att ange platsen för den elektroområdet.

  1. Späd D-luciferin-natriumsalt i PBS till en koncentration av 15 mg / ml och sterilisera den genom filtrering genom ett sterilt sprutfilter.
  2. Väg valparna.
  3. Ta valpen i en hand med buken uppåt och sträcka buken något. Injicera 10 | il / g kroppsvikt av luciferin lösning intraperitonealt. För äldre och mer lättrörliga och kära, pre-söva valparna med isofluran i induktionskammare innan du injicerar luciferin.
  4. Slå på isofluran inflödet av XGI-8 Gas Anesthesia System inom IVIS Spectrum med 3% isofluran.
  5. Sätt nosen av djuret i glaset noskoner i anestesisystemet.
  6. Håll djuret i en liggande position, tills den är i djup anestesi (2-3 min). Då minskar isofluran inflödet till 1,5%.
  7. Välj en 2D-mareld mätning för att välja positiva valpar från hela kullen. Använd följande inställningar
    Skärm 1
    Klicka här för att visa en större bild .
    1. Ställ en checkmark på Fotografera med medelhög binning och F / Stopp vid 8, tar kameran en bild från ovan efter start av mätningen.
    2. Ställ excitationsfilter: block.
    3. Ställ Emissionsfilter: öppen.
    4. Ställ Binning till medium.
    5. Set F / Stopp vid 1.
    6. Scen nivå A.
    7. Ställ luminiscens exponeringstid till 180 sek.
  8. För skapandet av 3D-bilder för att bättre kvantifiera den elektro området från de positiva valpar, använd följande DLIT inställningar för eldfluga luciferas.
    Skärm 3
    Klicka här för att visa en större bild .
    1. Ställ en bock på fotografi, kameran tar ett foto från ovan efter start av mätningen.
    2. Ställ en bock på struktur, är ytan av djuret skannas av IVIS innan den mareld mätningen.
    3. Use efter Utsläpps filter och exponeringstidsinställningar tills de fyller två veckor:
      Emissionsfilter 1: 590 nm, exponeringstid 300 sek
      Emissionsfilter 2: 600 nm, exponeringstid 240 sek
      Emissionsfilter 3: 620 nm, exponeringstid 180 sek
      Emissionsfilter 4: 640 nm, exponeringstid 120 sek
      För råttor äldre än P20
      Emissionsfilter 1: 600 nm, exponeringstid 300 sek
      Emissionsfilter 2: 620 nm, exponeringstid 300 sek
      Emissionsfilter 3: 640 nm, exponeringstid 300 sek
      Skärm 3
      Klicka här för att visa en större bild .
      På grund av den minskade signalstyrkan hos äldre djur, är exponeringstiden förstoras för de tre bästa emissionsfilter.
    4. Ställ Stage nivå B
    5. Ställ Binning till medium.
    6. Set F / Stopp vid 1
  9. Efter mätning, mark k råttorna med en öronöppningen kod för att skilja dem från varandra och att anpassa dem till de IVIS Live Imaging bilder
  10. I slutet av förfarandet mätning, stäng av isofluran tillströmning och hålla råttan på den uppvärmda plattan i några minuter innan han återvände till sin bur.

3. Analys av Bioluminescence Images

Den generation av 3D-bilder, 3D-filmer och kvantifiering av volymen på signalkällan görs av Living Image programvara förinstallerad på IVIS Spectrum.

  1. Generation av 3D-bilder
    1. Först rekonstruera en yttopografi, därför satt tröskel mellan 20-30%.
      Skärm 4
      Klicka här för att visa en större bild .
      Skärm 5
      een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
    2. Starta DLIT 3D-rekonstruktion med en bildtröskel på 10% för varje våglängd.
      Skärm 7
      Klicka här för att visa en större bild .
      Skärm 8
      Klicka här för att visa en större bild .
      Skärm 9
      Klicka här för att visa en större bild .
    3. Skapa 3D-filmer med hjälp av levande knappen i 3D-verktygsfältet.
    4. Välj olika inriktningar av 3D-bilden, liksom zoom åsikter som viktiga ramar och tryck på "Record & #39, knapp, spela in övergången från en position / orientering till en annan.
      Skärm 10
      Klicka här för att visa en större bild .

4. Behavioral Testing

Behavioral tester utfördes för att avgöra om IUE-medierade genen manipulationer i råtta kan initiera långsiktiga effekter som kvarstår i vuxen ålder. I det aktuella enskilda fallet, effekten av övergående, var ensidig fulla längd mänsklig DISC1 kortikala uttryck efter IUE undersöktes genom att testa rörelseförmåga på ett öppet fält (OF), med och utan en låg dos av amfetamin, som ett specifikt test för dopamin-relaterade beteende 24. I ett liknande förfarande som utförs av Niwa et al. I IUE möss med användning DISC1 knockdown, IUE möss men inte kontrollerna visade överkänslighetmed amfetamin 18.

Råttor som i livmodern elektroporerade med en DISC1 överuttryck vektor hölls under laboratorieförhållanden med 12 timmar ljus från 07:00 till 19:00 och utfodrades ad libitum. Vid tre månaders ålder, råttor genomgick beteendetester.

För att kvantifiera rörelse som en avläsning av amfetamineffekter, en öppen fråga om en Tru Scan aktivitetssystem som är beläget i en ljud-och ljus-isolerad kammare användes. Detta system mäter varaktighet tid och avstånd djuret rör sig, tid och distans tillbringade i marginalen eller mitt i det öppna fältet, samt uppfödning beteende 25.

  1. Den första dagen, testar efter koksaltinjektion
    1. Väg djuren.
    2. Injiceras intraperitonealt 1 pl / g kroppsvikt av en saltlösning (1 x PBS).
    3. Direkt efter injektionen placerar djuret i det öppna fältet och starta mätningen av TruScan systemet. Spela in i 15 min end dela data i 3 x 5 min delar.
    4. Sätt tillbaka i sin hembur djuret.
  2. Andra dagen, test på amfetamin injektion
    1. Väg djuren.
    2. Injiceras intraperitonealt 1 pl / g kroppsvikt av en 0,5 mg / ml amfetamin lösning.
    3. Direkt efter injektionen avliva djuret in i den öppna fält och påbörja mätningen av TruScan systemet. Spela in i 15 min och dela data i 3 x 5 min delar.
    4. Tillbaka djuret till sitt hem bur.
  3. Analysera förflyttning och uppfödning beteende genereras av särskild programvara Tru Scan. Skapa diagram med GraphPad (Prism) och beräkna statistik från SPSS Statistics programvara.

Representative Results

Figur 3 visar lever avbildningsmätningar av tre råttungar vid P7 efter injektion av 150 mg luciferin / kg kroppsvikt. Skillnader i signalstyrka indikerar variationen i verkningsgrad IUE är synliga. Starka mareld signaler registrerades tills P36 (Figur 4). I fig. 5 är förmågan att definiera kortikal (figurerna 5A och 5C), och hippocampus (fig. 5B och 5D) elektroporering genom bioluminescens avbildning avbildas. Korrelation av bioluminiscens-signalen (fig. 7A) med dess fluorescenssignal efter skalle avlägsnande (Figur 7B) och motsvarande GFP-electroporated celler i cryosectioned hjärnan (figur 8) på P14 är avbildade i figurerna 6-8. Notera, det inte fanns någon detektering av en fluorescenssignal i levande råttor vid varje tidpunkt.

tält "> In vivo bioluminescens avbildning möjliggör automatisk diskriminering av olika electroporated hjärnområden av 2D (fig. 5A och 5B) som är mycket förbättrad med DLIT program IVIS Spectrum mjukvara generera 3D-bilder (fig 5C och 5D). I de exempel som visas , elektroporering av prefrontala cortex och hippocampus kunde särskiljas. Det bör noteras att samtidigt som man eftersträvar att elektroporera hippocampus, vissa progenitorceller för cortex liggande dorsala hippocampus kan även slå (Figur 7).

Råttor ensidigt i livmodern elektroporerade med pCAX vektorn i cortex och därefter överuttrycker fullängds mänsklig DISC1 undersöktes för både spontana och amfetamin-inducerad hyperaktivitet som vuxna. Råttor elektroporerade med pCAX-DISC1 var överkänslig för en låg dos av amfetamin. Dessa råttor flyttade betydligt more efter amfetaminbehandling än efter att koksaltinjektion, medan kontrolldjuren inte (Figur 10).

Figur 1
Figur 1. Scheme av elektrodläge för A) cortex elektroporation och B) hippocampus elektroporation, grön = injicerat DNA-Mix i ventrikeln.

Figur 2
Figur 2. Luciferas-reaktionen.

Figur 3
Figur 3. Luminescence mätning av P7-råttor efter injektion av 150 mg / kg kroppsvikt luciferine; exponeringstid 180 sek; A) råtta med ingen luminiscens signal; B) från råtta med en svag mareld signal, C) råtta med en stark luminiscens signal.

Figur 4
Figur 4. Tid linje bioluminescence mätningar av samma råtta efter injektion av 150 mg / kg luciferine visar ett stort tidsfönster där IUE framgång kan detekteras i följd.

Figur 5
. Figur 5 Illustration av skillnader mellan kortikala och hippocampus elektroporation vid P7 A) och B) 2D-bilder,. C) och D) 3D-bilder, A) och C) från cortex, B) & D) från hippocampus.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6
Figur 6. Illustration av E16 hippocampus elektroporation av en råttunge i P14 A) 2D-bild av mareld B) 3D illustration av mareld signalen C) dissekeras hjärnan med mareld signal D) hjärna med GFP epi-fluorescenssignal. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 7
Figur 7. Detalj av ett fluorescens-bild från en 20 | am kryo sektion av samma P14 råtthjäma electroporated med GFP innehållande plasmiden och luciferasvektor, kärnor färgning med DAPI, CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3, GD = gyrus dentatus, FC = Fasciolarum cinereum.

Video 1. 3D-animering av en hippocampus elektro råtta vid P14.

Figur 8
Figur 8. Amfetamin testprogram: första dagen koksaltinjektion innan 15 min rättegång, 24 timmar senare amfetamin injektion före testning i det öppna fältet kammaren.

Figur 9
Figur 9. Amfetamin-test. Stapeldiagram som visar rörd avstånd (i cm) av djuret registreras av en TrueScan systemet under 15 min Vita staplar = kontrollgrupp,. Grå staplar = DISC1 overexpressing grupp; kontrollgrupp n = 10; DISC1 överuttryck grupp n = 11, ANOVA: geno * behandling p = 0,043, t-test för total tid saltlösning vs amfetamin ns = ej signifikant pcontrol = 0.172, pDISC1 = 0,001.

Discussion

Vår studie visar att IUE är lämpad för att alstra vuxna råttor med neuroner som uttrycker en transgen i ett selektivt område i hjärnan och att det, som ett resultat av detta ingripande, är dessa djur uppvisar beteendeförändringar som indikerar funktionaliteten hos den utförda manipulation. I denna studie, som ett exempel, råttor som överuttrycker DISC1 ensidigt i en liten del av den prefrontala cortex uppvisade överkänslighet mot amfetamin (Figur 9).

Val av råttor för elektroporation framgång genom in vivo mareld avbildning var effektivt i att kontrollera för den inneboende variationen av IUE cell transfektion och tillämpades för att skapa grupper med en homogen IUE område med låg interindividuella variationen för senare undersökningar.

I denna studie kunde vi inte välja elektroporeras valpar från kull genom detektering av co-electroporated GFP-inducerad fluorescens i nyfödda djur, även though vid samma tidpunkt och på samma djur en mareld signal om lika sam-elektro luciferas kunde detekteras efter luciferin injektion (Figur 6), och GFP uttrycka nervceller fanns fortfarande kvar i hjärnan vid en ålder av sex månader. Vi drar slutsatsen att, i råtta, är luciferas / luciferimeaktionen väl lämpad för att skilja djur med framgångsrika electroporated hjärnor (Figur 3).

Den kvantitativa övervakningen av IUE framgång avser styrkan i mareld signal som mäts av grevarna av fotoner inom samma exponeringstid (Figur 3) och motsvarar den enzymatiska aktiviteten av samarbete uttryckt luciferas. Små mareld signaler är detekterbara med 100-200 fall av fotoner, och, vid en strålglans av ~ 1x10 4 fotoner / sek / cm 2 / steradian show 1,000-2,000 GFP-färgade celler i histologi i 6 månader gamla råtthjärna. Den högsta signalen displa en strålglans av upp till ~ 5x10 6 fotoner / sek / cm 2 / steradian och ~ 64.000 räknas.

I Sprague Dawley råttstam som används, observerade vi en försvagning av mareld signalen i längsled med ökande ålder och signalen försvann efter fyllda P35 (Figur 4). Vid det här laget, vet vi inte om antingen övergående, plasmid-vektor-baserade uttryck av luciferas minskar, eller om mareld signalen försvagas på grund av ökad hjärnmassa, eller båda är orsakerna till försvinner signalen. För den nuvarande funktionsanalys i vuxna råttor, var valet för beteendestudier enbart gjort baserat på platsen av signalen, men inte av mareld signalstyrka.

Trots att 3D kvantitativ bioluminescens övervakning tillåten skillnad mellan olika electroporated områden (figur 5), var dess accurateness begränsad för celler som finns i djupet dimension av hjärnan. Figur 6 visar ett exempel på en hippocampal elektroporering där bioluminescens mätning i 2D-och 3D-bild indikerade en god positionering av elektroporation. I det dissekerades efter slakt hjärna var en GFP-fluorescenssignalen detekteras vid ungefär samma position som den bioluminescens, vilket indikerar korrekt inriktning av hippocampus. Men histologi visar att även celler i hjärnbarken rygg av hippocampus hade riktat (Figur 7). Detta indikerar att mareld-analysen är ett användbart verktyg för att upptäcka positiva, IUE valpar och även för att få en uppfattning om den elektro området, men i slutändan, bildhantering kan inte ersätta post mortem histologi att exakt lokalisera positivt riktade celler.

Vår demonstration visar löfte för tillämpningen av den IUE teknik för att generera subtila riktade manipulationer av kortikala eller hippocampus hjärnregioner för att simulera aberrances i c.ortical migration eller andra neurodevelop defekter som kan påverka det vuxna djuret. Även bilaterala elektroporation 26 har fördelen av en sannolikt större effekt på beteendet, det finns också mer dödlighet hos embryon. Ensidig elektroporation valdes för att kunna jämföra de två halvkloten med en som en intern kontroll, samt för att visa att även IUE manipulerande i en ensidig, liten region är tillräckligt för att ändra beteende. IUE-inducerade förändringar i anslutning eller arkitektur mellan nervceller kan således induceras utan att framkalla en skada och det krävs matchen i till-vara-IUE-manipulerade området med lämpligt beteende testet är beroende av den vetenskapliga frågan.

Felsökning

Minskad kullstorlek Det finns flera förslag på att öka överlevnaden för de IUE valpar. Först användningen av mycket tunna glas kapillärer under elektroporering för att minimera vävnads lesion rekommenderas. För det andra, inte electroporate det första embryot till den vaginala änden av varje livmoderhorn: död den förstfödde embryo ökar chanserna för ett avbrytande av alla andra embryon. För det tredje, efter födseln, moderns råttor döda ofta en del av sin avkomma på grund av perinatal stress. För att minska ytterligare stress, börja inte med levande avbildning direkt efter födseln, men vänta i sju dagar.

GFP-fluorescens detektion av valparna

På en vecka efter födseln, ingen signal av fluorescens genom att antingen använda levande kikare fluorescens mikroskopisk avbildning eller fluorescens avbildning med IVIS Spectrum (epifluorescence och transfluorescence lägen, för GFP excitation / emission: 465/520 nm och 500/540 nm). Det är möjligt att båda, den begränsade överföring av kort våglängd excitation och emissionsljuset genom vävnad som skallen och hög autofluorescens bakgrund av huden förhindra användning av fluorescens under described betingelser i råtta. Såsom visas i fig 6, kan luciferas signalen i det levande djuret också detekteras i dissekeras hjärnan (utan skalle) och där, även en fluorescenssignal kan detekteras (fig 6D).

Differentiering av mareld i tätt placerade hjärnområden

Även i 3D illustration platsen för bioluminescens område inte kan förutsägas till 100%. Speciellt celler ovanpå eller under den förutsagda området kan också av misstag riktade och transfekterades. Det exakta läget måste kontrolleras med post mortem (fluorescens) histologi (se figur 7).

Disclosures

Författarna till denna studie inte har ekonomiska intressen i denna studie och har inte sponsras av industrin för denna studie. Open access arvoden bidragit med PerkinElmer Inc. Publicering.

Acknowledgments

Författarna tackar Tracy Young-Pearse och Atsushi Kamiya för att ge plasmider.

Detta arbete har finansierats av NEURON-Eranet upptäcker till OR och CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) till CK, och (DE 792/2-4) till MASS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O
100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  2. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  3. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  4. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  5. Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  7. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
  8. Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  10. Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
  11. Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
  12. Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
  13. Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
  14. Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
  15. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
  16. Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  17. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
  18. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  19. Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. 169-179 (2012).
  20. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
  21. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  22. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
  23. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
  24. Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
  25. Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
  26. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
Generering av Lokalt Transgena råttor genom<em&gt; I livmodern</em&gt; Elektroporering och<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).More

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter