Gener kan manipuleras under utvecklingen av cortex eller hippocampus hos råtta genom i livmodern elektroporering (IUE) på E16, för att möjliggöra snabba och målinriktade ändringar i nervkopplingar för senare studier av beteende eller neuropatologi hos vuxna djur. Förlossnings in vivo imaging för kontroll av IUE framgång utförs av mareld att aktivera samtransfekterad luciferas.
In utero elektroporering (IUE) är en teknik som tillåter genetisk modifiering av celler in i hjärnan för att undersöka neuronal utveckling. Hittills har användningen av IUE för att undersöka beteende eller neuropatologi i den vuxna hjärnan begränsats av otillräckliga metoder för övervakning av IUE transfektion framgång genom icke-invasiva tekniker i postnatala djur.
För den aktuella studien, var E16 råttor användes för IUE. Efter intraventrikulär injektion av nukleinsyrorna in i embryon, positioneringen av pincett elektroder var kritisk för inriktning antingen framkallnings cortex eller hippocampus.
Ventrikulär samtidig injektion och elektroporation av en luciferasgen tillåten övervakning av de transfekterade cellerna postnatalt efter intraperitoneal luciferin injektion i bedövades levande P7 pup av in vivo bioluminescens, med användning av en IVIS Spectrum enhet med 3D kvantifiering programvara.
<pclass = "jove_content"> Områdes definition av mareld kunde tydligt skilja mellan kortikala och hippocampus electroporations och upptäcka en signal på längden över tid upp till fem veckor efter födseln. Detta bildteknik tillät oss att välja valpar med ett tillräckligt antal transfekterade celler förväntas krävas för att utlösa biologiska effekter och därefter utföra beteende-undersökningar vid 3 månaders ålder. Som ett exempel, visar denna studie att IUE med den humana fullängds DISC1 genen i råttcortex ledde till amfetamin överkänslighet. Samtransfekterad GFP kunde detekteras i nervceller med post mortem fluorescensmikroskopi i kryosnitt indikerar genuttryck närvarande vid ≥ 6 månader efter födseln.Vi drar slutsatsen att postnatal mareld avbildning möjliggör utvärdering av framgången för transienta transfektioner med IUE hos råttor. Undersökningar om inverkan av aktuella genen manipulationer under neurodevelopment på den vuxna hjärnan och dess anslutning i hög grad underlättas. För många vetenskapliga frågor, kan denna teknik komplettera eller ersätta användningen av transgena råttor och tillhandahålla en ny teknik för Behavioral Neuroscience.
Utvecklingen av det i livmodern elektroporering metoden (IUE) som möjliggör en modulering av genuttryck i den växande hjärnan, har varit ett genombrott eftersom det gjorde det möjligt att studera nervsystemets utveckling med relativ lätthet. 1-7 Förändringar i uttrycksnivåer av en mål-gen i en specifik hjärnregion under foster-och / eller perinatal utveckling hos gnagare har visat att kritiskt inflytande neuronal proliferation, migration, arborization, och anslutningsmöjligheter. 8-10
Schizofreni är en komplex psykisk sjukdom med akuta och kroniska symptom som har samband med nervsystemets avvikelser 11, 12 och därför är många av de identifierade kandidatgener för schizofreni undersöks för potentiella modulerande effekter på nervsystemets utveckling, som till exempel för den störs-in-schizofreni -1 (DISC1 genen) 13-15.
Hjärnans utveckling är regleed av genetiska faktorer och deras interaktion med miljön som spelar roll i pre-, peri-och postnatala utvecklingsperioder. En stor genetisk riskfaktor för olika beteendestörningar är de DISC1 16 genen. DISC1 Knockdown leder till migration defekter i möss 13, 17, och manipulation av DISC1 uttryck i framkallnings cortex genom IUE har visats påverka beteendet hos vuxna möss 18.
Manipulering hjärna genuttrycket IUE har flera fördelar 19 över generering av transgena djurlinjerna. Först genuttryck inom intresseområden uppnås inom veckor till månader i stället för flera generationer av avel transgena gnagare linjer. För det andra, är kompensationsmekanismer under tidig utveckling som kan skärma fenotyper i könsceller-engineered djur 20 undviks. För det tredje, genom att rikta endast en specifik cell population eller visst område i hjärnan, migratipå eller spridningsskillnader kan direkt jämföras med den icke-muterade eller kontrollera kontralaterala sidan om unilaterala electroporations väljs. Å andra sidan, betyder IUE inte noggrannheten hos promotordriven cre / lox-inducerad tidpunkten för expression och endast en subpopulation av celler i ett visst område är riktad som leder till en mosaik slags genuttrycksmönstret.
För många experimentella tillämpningar inom vuxna gnagare kan en övergående transfektion av ett begränsat antal celler i en hjärnregion som är tillräcklig, eller ens önskas, så att den stora fördelen av stabila, nedärvda-transgena gnagare är försumbar. I själva verket är IUE nyttigt att undersöka om några onormalt utvecklade celler kan påverka ett helt nätverk av celler eller kretsar. En annan fördel kan vara förmågan att visa icke cell-autonoma effekterna av en gen på grund av den mosaik natur träffen. Dessutom är den generation av transgena och knockout råttor fortfarande i sin linda och användningav IUE i denna art för att studera avvikande konsekvenser hjärnans utveckling är av stort intresse.
Hittills är ett stort hinder för att använda IUE för att undersöka interventions konsekvenser i dessa djur som vuxna bristen på övervakning elektroporation framgång. Hittills GFP-samtransfekterad fluorescerande nervceller i de levande nyfödda råttungar kunde inte upptäckas i en lämplig kikare fluorescensmikroskop eller med fluorescens avbildning av IVIS Spectrum.
För att övervinna detta hinder, vi samtransfekteras en luciferasrapportörgen och utfört mareld live-avbildning av valpar med 3-dimensionell (3D) kvantifiering av IUE hjärnområdet.
Som ett exempel för att visa att tillämpningen av denna metod i ett senare funktionell analys testar den neurodevelopmental genetisk manipulation, en co-injektion av plasmider innehållande mänskligt DISC1, luciferas, och GFP i den laterala ventrikeln av råttembryon <sup> 3 följt av elektroporering med en pincett elektrod utfördes. Medan fluorescens signaler inte kunde detekteras i tiden efter födseln in vivo, var en solid mareld signal kommer från luciferin metabolism genom samtransfekterad luciferasgen upptäckts upp till fem veckor efter födseln. 3D-mätningar av elektrohjärnområdet tillåts kvantifiering innebär att valpar med otillräcklig eller missriktad elektroporation identifierades från början, alltså, så att tilldelningen av IUE djur (gen av intresse och oordning kontroll) till experimentella grupper med matchade elektroporerade hjärnområden med låg variabilitet . Användningen av vuxna IUE råttor i beteende paradigm visades som exempel på nyttan av detta protokoll.
Vår studie visar att IUE är lämpad för att alstra vuxna råttor med neuroner som uttrycker en transgen i ett selektivt område i hjärnan och att det, som ett resultat av detta ingripande, är dessa djur uppvisar beteendeförändringar som indikerar funktionaliteten hos den utförda manipulation. I denna studie, som ett exempel, råttor som överuttrycker DISC1 ensidigt i en liten del av den prefrontala cortex uppvisade överkänslighet mot amfetamin (Figur 9).
Val av råttor för elektroporation framgång genom in vivo mareld avbildning var effektivt i att kontrollera för den inneboende variationen av IUE cell transfektion och tillämpades för att skapa grupper med en homogen IUE område med låg interindividuella variationen för senare undersökningar.
I denna studie kunde vi inte välja elektroporeras valpar från kull genom detektering av co-electroporated GFP-inducerad fluorescens i nyfödda djur, även though vid samma tidpunkt och på samma djur en mareld signal om lika sam-elektro luciferas kunde detekteras efter luciferin injektion (Figur 6), och GFP uttrycka nervceller fanns fortfarande kvar i hjärnan vid en ålder av sex månader. Vi drar slutsatsen att, i råtta, är luciferas / luciferimeaktionen väl lämpad för att skilja djur med framgångsrika electroporated hjärnor (Figur 3).
Den kvantitativa övervakningen av IUE framgång avser styrkan i mareld signal som mäts av grevarna av fotoner inom samma exponeringstid (Figur 3) och motsvarar den enzymatiska aktiviteten av samarbete uttryckt luciferas. Små mareld signaler är detekterbara med 100-200 fall av fotoner, och, vid en strålglans av ~ 1×10 4 fotoner / sek / cm 2 / steradian show 1,000-2,000 GFP-färgade celler i histologi i 6 månader gamla råtthjärna. Den högsta signalen displa en strålglans av upp till ~ 5×10 6 fotoner / sek / cm 2 / steradian och ~ 64.000 räknas.
I Sprague Dawley råttstam som används, observerade vi en försvagning av mareld signalen i längsled med ökande ålder och signalen försvann efter fyllda P35 (Figur 4). Vid det här laget, vet vi inte om antingen övergående, plasmid-vektor-baserade uttryck av luciferas minskar, eller om mareld signalen försvagas på grund av ökad hjärnmassa, eller båda är orsakerna till försvinner signalen. För den nuvarande funktionsanalys i vuxna råttor, var valet för beteendestudier enbart gjort baserat på platsen av signalen, men inte av mareld signalstyrka.
Trots att 3D kvantitativ bioluminescens övervakning tillåten skillnad mellan olika electroporated områden (figur 5), var dess accurateness begränsad för celler som finns i djupet dimension av hjärnan. Figur 6 visar ett exempel på en hippocampal elektroporering där bioluminescens mätning i 2D-och 3D-bild indikerade en god positionering av elektroporation. I det dissekerades efter slakt hjärna var en GFP-fluorescenssignalen detekteras vid ungefär samma position som den bioluminescens, vilket indikerar korrekt inriktning av hippocampus. Men histologi visar att även celler i hjärnbarken rygg av hippocampus hade riktat (Figur 7). Detta indikerar att mareld-analysen är ett användbart verktyg för att upptäcka positiva, IUE valpar och även för att få en uppfattning om den elektro området, men i slutändan, bildhantering kan inte ersätta post mortem histologi att exakt lokalisera positivt riktade celler.
Vår demonstration visar löfte för tillämpningen av den IUE teknik för att generera subtila riktade manipulationer av kortikala eller hippocampus hjärnregioner för att simulera aberrances i c.ortical migration eller andra neurodevelop defekter som kan påverka det vuxna djuret. Även bilaterala elektroporation 26 har fördelen av en sannolikt större effekt på beteendet, det finns också mer dödlighet hos embryon. Ensidig elektroporation valdes för att kunna jämföra de två halvkloten med en som en intern kontroll, samt för att visa att även IUE manipulerande i en ensidig, liten region är tillräckligt för att ändra beteende. IUE-inducerade förändringar i anslutning eller arkitektur mellan nervceller kan således induceras utan att framkalla en skada och det krävs matchen i till-vara-IUE-manipulerade området med lämpligt beteende testet är beroende av den vetenskapliga frågan.
Felsökning
Minskad kullstorlek Det finns flera förslag på att öka överlevnaden för de IUE valpar. Först användningen av mycket tunna glas kapillärer under elektroporering för att minimera vävnads lesion rekommenderas. För det andra, inte electroporate det första embryot till den vaginala änden av varje livmoderhorn: död den förstfödde embryo ökar chanserna för ett avbrytande av alla andra embryon. För det tredje, efter födseln, moderns råttor döda ofta en del av sin avkomma på grund av perinatal stress. För att minska ytterligare stress, börja inte med levande avbildning direkt efter födseln, men vänta i sju dagar.
GFP-fluorescens detektion av valparna
På en vecka efter födseln, ingen signal av fluorescens genom att antingen använda levande kikare fluorescens mikroskopisk avbildning eller fluorescens avbildning med IVIS Spectrum (epifluorescence och transfluorescence lägen, för GFP excitation / emission: 465/520 nm och 500/540 nm). Det är möjligt att båda, den begränsade överföring av kort våglängd excitation och emissionsljuset genom vävnad som skallen och hög autofluorescens bakgrund av huden förhindra användning av fluorescens under described betingelser i råtta. Såsom visas i fig 6, kan luciferas signalen i det levande djuret också detekteras i dissekeras hjärnan (utan skalle) och där, även en fluorescenssignal kan detekteras (fig 6D).
Differentiering av mareld i tätt placerade hjärnområden
Även i 3D illustration platsen för bioluminescens område inte kan förutsägas till 100%. Speciellt celler ovanpå eller under den förutsagda området kan också av misstag riktade och transfekterades. Det exakta läget måste kontrolleras med post mortem (fluorescens) histologi (se figur 7).
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Tracy Young-Pearse och Atsushi Kamiya för att ge plasmider.
Detta arbete har finansierats av NEURON-Eranet upptäcker till OR och CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) till CK, och (DE 792/2-4) till MASS
Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
kodan Tinktur forte | Schülke & Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
Surgical Scissors – sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
|