Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından Published: September 24, 2013 doi: 10.3791/50146
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Neuropathology, Medical School Düsseldorf, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute for Science, 3Center of Behavioral Neuroscience, University of Düsseldorf

Summary

Genler yetişkin hayvanlarda davranış veya nöropatoloji sonraki çalışmalar için nöronal bağlantı hızlı ve hedeflenen değişiklikleri mümkün kılmak için, E16 de utero elektroporasyon (IUE) in ile korteks veya sıçanın hipokampusun gelişimi sırasında manipüle edilebilir. IUE başarı kontrolü için in vivo görüntüleme doğum sonrası ko-transfekte edilmiş lusiferaz aktive biyolüminesans ile gerçekleştirilir.

Abstract

Utero elektroporasyon (IUE) nöronal gelişimi araştırmak için beyindeki hücrelerin genetik değişimine izin veren bir tekniktir. Şimdiye kadar, bir yetişkin beyinde davranış veya nevropatolojisi araştırmak için İEÜ kullanımı postnatal hayvanlarda non-invazif teknikler ile IUE transfeksiyon başarı izlenmesi için yetersiz yöntemlerle sınırlıdır.

Bu çalışma için, E16 sıçanlar İEÜ için kullanıldı. Embriyoların içine nükleik asitlerin intraventriküler enjeksiyonundan sonra, cımbız elektrot yerleştirme gelişmekte korteks veya hipokampus ya da hedefleme için çok önemliydi.

Ventriküler ko-enjeksiyon ve 3D yazılım ile bir miktar IVIS Spectrum cihazı kullanılarak, doğum sonrası in vivo biyoışıldama ile anestezi canlı yavru P7 intraperitoneal lusiferin enjeksiyondan sonra, transfekte edilmiş hücrelerin bir lusiferaz gen izin izlenmesi, elektroporasyonu.

DISC1 IUE amfetaminin aşırı-duyarlılığa yol açtığını gösterir. Co-GFP ile transfekte doğumdan sonraki 6 ay ≥ mevcut gen ekspresyonunu gösteren cryosections post mortem floresan mikroskobu ile nöronlarda tespit edilebilir.

Biz doğum sonrası biyolüminesans görüntüleme sıçanlarda İEÜ ile geçici transfeksiyonlarının başarısını değerlendiren olanak sonucuna varıldı. Neurodevelopmen sırasında topikal gen manipülasyon etkisi üzerinde araştırmalaryetişkin beyin ve onun bağlantısı t büyük ölçüde kolaylaşır. Birçok bilimsel sorular için, bu teknik takviyesi ya da transgenik farelerin kullanımının yerini ve davranışsal nörobilim için yeni bir teknoloji sağlayabilir.

Introduction

Bu göreli kolaylıkla nöro okuyan etkin yana gelişen beyinde gen ekspresyonunun modüle edilmesine izin verir, bir in utero elektroporasyon (IUE) yöntemi geliştirilmesi, bir ara-ile olmuştur. Bir hedef genin ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler 1-7 kemirgenlerde embriyonik ve / veya perinatal gelişim sırasında belirli bir beyin bölgesi etkisi nöronal proliferasyon, göç, arborization ve bağlantı eleştirel bir gösterildi. 8-10

Şizofreni nöro anormallikler 11, 12 ve bu nedenle şizofreni için belirlenen aday genlerin çoğu için, örneğin olduğu gibi, nörolojik gelişim üzerindeki potansiyel modüle etkileri incelenmiştir ile ilgili olmuştur akut ve kronik semptomlar ile karmaşık bir ruhsal hastalıktır kesintiye uğramış-in-şizofreni -1 (DISC1) geni 13-15.

Beyin gelişimi regulat olduğunupre-, peri-ve postnatal gelişim dönemlerinde rol oynar genetik faktörler ve çevre ile olan etkileşimleri tarafından ed. Çeşitli davranış bozuklukları için önemli bir risk faktörü genetik fareler 13, 17 göç kusurlarına DISC1 16 gen. DISC1 demonte yol açar ve İEÜ tarafından gelişmekte kortekste DISC1 ifade manipülasyon yetişkin farelerde 18 davranışını etkisi gösterilmiştir.

İEÜ tarafından beyin gen ifadesini kurgulama çeşitli avantajlar transgenik hayvanların nesil üzerinde 19 vardır. İlk olarak, ilgi alanları içinde gen ekspresyon aydan ziyade transgenik kemirgen hatları ıslah birkaç nesillere hafta içinde elde edilir. İkincisi, germ-mühendislik hayvanlarda 20 fenotipleri kalkan olabilir erken gelişim döneminde telafi edici mekanizmalar kaçınılmalıdır. Yalnızca belirli bir hücre popülasyonu veya beynin belirli bir alan, Migrati hedef aracılığıyla, Thirdveya çoğalması farklar doğrudan olmayan mutant ile karşılaştırıldığında ya da tek taraflı electroporations seçilir ise kontralateral tarafı kontrol edilebilir. Öte yandan, IUE promotör-tahrikli cre / lox kaynaklı ifade zamanlaması ve belirli bir alanda, hücrelerin sadece bir alt gen sentezleme modelinin bir mozaik tür lider hedeflenmektedir doğruluğunu sahip değildir.

Kararlı, tohum çizgisi transgenik kemirgen en önemli avantajı, göz ardı edilebilir, böylece erişkin kemirgenlerde birçok deneysel uygulamalar için, bir beyin bölgesinde hücre sınırlı sayıda geçici transfeksiyon yeterli, ya da arzu edilen olabilir. Aslında, İEÜ bazı anormal gelişmiş hücreler hücreleri veya devrenin tüm ağı etkileyebilir olup olmadığını araştırmak için yararlıdır. Diğer bir avantajı nedeniyle hit mozaik doğaya bir genin olmayan bir hücreye otonom etkilerini göstermek için yeteneği olabilir. Ayrıca, transgenik ve nakavt farelerin üretimi emekleme ve hala kullanımdaanormal beyin gelişimi sonuçları incelemek için bu türün İEÜ yüksek ilgi olduğunu.

Şimdiye kadar, bu gibi yetişkin hayvanlarda müdahale sonuçlarını inceleyen İEÜ kullanmanın önemli bir engel izleme elektroporasyon başarı eksikliğidir. Şimdiye kadar, canlı Yenidoğan sıçan yavrularının uygun bir binoküler flöresanlı bir mikroskop altında ya da IVIS Spectrum floresan görüntüleme ile tespit edilemedi floresan nöronlar GFP-ko-transfekte edildi.

Bu engeli aşmak için, bir lusiferaz raportör geni ile ko-transfekte IUE beyin bölgesinin 3 boyutlu (3D) miktar ölçümleri ile yavruların biyoluminesans canlı görüntüleme gerçekleştirilir.

Nöro genetik manipülasyonu, sıçan embriyo lateral ventrikül içine, insan DISC1, lusiferaz ve GFP ihtiva eden plasmidlerin bir birlikte-enjeksiyon test sonraki bir fonksiyonel deneyde bu yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için bir örnek olarak in vivo doğum sonrası aşamada tespit edilememiştir da, ko-transfekte lüsiferaz geni ile lusiferin metabolizmasından elde edilen katı bir biyoışıldama sinyal doğumdan sonraki beş hafta kadar saptandı. Yetersiz veya yanlış elektroporasyon ile yavrular İEÜ hayvanların atamasını sağlayan, böylece, baştan belirlenen (ilgi gen ve kontrol şifreli) düşük değişkenlik eşleşti elektropore beyin alanları ile deneysel grupta edildi sayede elektroporate beyin alanı izin nicelikleme 3D ölçümleri . Davranışsal paradigmalar yetişkin İEÜ farelerin kullanımı bu protokolün kullanışlılığı bir örnek olarak gösterildi.

Protocol

Ulusal ve Avrupa mevzuatına uygun olarak; Tüm hayvan deneyleri sorumlu Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (87-51.05.2010.A301 LANUV NRW) tarafından yetkilendirilmiştir.

1.. Utero Elektroporasyon

Bu yöntem, Walantus et al. 3 ile fare, hem de Rice et al. 4 için Jüpiter ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve burada sadece kısa bir süre özetlenmiştir. 6-8 yavruların bir DKBKS iyi bir sonuç verir. (Aşağıya bakınız), genel hayatta kalma oranını arttırmak amacıyla, en az iki non-elektroporate embriyolar olmalıdır.

  1. 1.5 ug / ul DNA içeren-bir karışım hazırlayın hedef Plasmid (shRNA: pentr-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 aşın: pCAX 21), 0.5 ug / plazmid (pCAX), 0.5 ug / ul ihtiva eden, GFP Lusiferaz ul 1x PBS çözeltisi hafif lekeli Blu plazmid (pCAGGS 22) ihtiva edenHızlı Yeşil Boya ile e.
  2. İğne Pipet Çektirme cam kılcal üzerinden enjeksiyon iğneleri hazırlayın. Ve alkol bazlı dezenfektan (kodan Tinktur forte) ile otoklav veya inkübasyon yoluyla cerrahi aletleri sterilize.
  3. 15 dakika ameliyattan önce 16 gün fertilizasyon (E16) sonra hamile bir sıçan buprenorfinin (0.05 mg / kg) bir pre-operatif dozunu. Daha sonra izofluran odası içindeki hayvan anestetize.
    1. Anestezi sırasında,% 1.8 0.4 L / dk ve izofluran oksijen ayarını kullanarak, anestezi cihazına bağlı solunum maskesi ile 37 ° C ısıtılmış ameliyat masasında sırtüstü pozisyonda sıçan yerleştirin.
    2. Karın tıraş sonra, traş alanı kodan Tinktur Forte (alkol bazlı dezenfektan) ile üç kez dezenfekte edin.
    3. Sadece traş operasyon alanını açığa steril bezler ile sıçan örtün.
  4. Utero elektroporasyon gerçekleştirin.
    1. Bir Scisso ile karın Cutlinea alba boyunca r (~ 2 cm).
    2. Bir halka forseps ile dikkatlice rahim boynuzları maruz.
    3. Bütün ameliyat sırasında ısındı steril PBS ile ıslak rahim duvarını tutmaya özen gösterin.
    4. Embriyoların lateral ventrikül birine ince bir cam iğne ile DNA çözümü enjekte edilir.
    5. Embriyonun başının etrafında 7 mm elektrot yerleştirin. Üst korteks tabakalarının bir hücre popülasyonu vurmak için, E16 23 de İzmir Ekonomi Üniversitesi'nde gerçekleştirmek ve hafif bir sırt / yanal eğilimi ile enjekte ventrikül yukarıdaki yarımkürede pozitif elektrot yerleştirmek. Hipokampal hücreleri, yan ile enjekte ventrikül göre ters tarafa pozitif elektrot yerleşimi değiştirmek hedeflemek için hafifçe dorsal yönde (Şekil 1).
    6. Bir kare dalga darbe elektroporatörü ile 950 ms sonları ile 55 V beş 50 msn darbelerle Elektroporasvon gerçekleştirin.
    7. T artırmak amacıyla her bir rahim boynuzu vajinal sonunda ilk embriyo yedekO, tüm embriyoların hayatta kalma şansı.
    8. Geri anne fareye rahim boynuzları koyun.
    9. Emilebilen Vicryl cerrahi sütür materyali ile karın duvarı Stich.
    10. Vicryl dikiş malzemesi ile veya dikiş klipleri ile cilt kapatın.
    11. Geri eve kafese anne sıçan yerleştirin ve 2-3 saat süreyle sıcak tutmak.
    12. Hayvan tesis odasında kendi ev kafeste sıçan tutun ve ad libitum besleme. Onlar E22-24 arasında doğurur.
    13. Üç hafta boyunca anneleri ile sıçan yavrular tutmak ve cinsiyete göre daha sonra onları ayırmak.

2. Enzimatik Lusiferaz Reaksiyon ışıldaması Canlı Görüntüleme

Bu yöntem, rahimde transfekte edilmiş hücrelerin konumunu analiz etmek için kullanılır. Co-Electroporated ateşböceği lusiferaz cDNA oxyluciferin D-lusiferin metabolize üzerine, bir foton (Şekil 2 yayan aktif lusiferazın, çevrilir (Şekil 4), yaklaşık 35 gün yaşına kadar bir IVIS Spektrum pozitif elektroporasyona genç farelerin beyinlerinde tespit edilebilir.

Bu çalışmada, lusiferaz deney ve biyoışıldama görüntüleme P7 başlayarak yapıldı. Bu zaman noktası anne ve yavruların doğum stresten kurtarmak için izin seçildi. Başlangıçta P0 yavrular ile çalışırken, yavru hayatta ciddi yavrular ölü bulundu ya da anne tarafından yemiş olduğu etkilenmişti.

Başlangıçta, başarılı elektroporasyon ile sıçan yavrular üç dakikalık bir pozlama süresi ile 2D-biyoparlaklık resim ile tanımlanır. Daha sonra, pozitif yavrular electroporated alanının konumunu belirtmek için 3D görüntüler oluşturmak için kullanılır.

  1. Ml 15 mg / ml konsantrasyonda PBS içinde D-lusiferin sodyum tuzu seyreltin ve steril bir şırınga filtresi ile filtre edilerek sterilize.
  2. Yavrular tartılır.
  3. Üst karın ile bir yandan yavru almak ve biraz karın germek. Lusiferin çözelti intraperitoneal, vücut ağırlığının her 10 ul / g enjekte edilir. Eski ve daha çevik olanlar için, lusiferin enjekte önce indüksiyon odasında izofluran ile yavrular ön uyuşturan.
  4. % 3 izofluran ile IVIS Spectrum içindeki XGI-8 Gaz Anestezi Sistemi Izofluran akını açın.
  5. Anestezi Sistemi cam burun konisi içine hayvanın burun koyun.
  6. Derin anestezi (2-3 dakika) kadar bir yüzükoyun pozisyonda hayvan tutun. Ardından% 1.5 izofluran akını azaltır.
  7. Bütün çöp olumlu yavrular seçmek için bir 2D-biyoparlaklık ölçümü seçin. Aşağıdaki ayarları kullanın
    Ekran 1
    Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
    1. Bir logların yazıldığı Setkmark 8'de orta binning ve F / Stop ile Fotoğraf üzerinde, kamera ölçüm başladıktan sonra yukarıda bir fotoğraf alır.
    2. Set Tahrik filtresi: blok.
    3. Emisyon filtre ayarlayın: açık.
    4. Orta binning ayarlayın.
    5. 1 de F / Stop ayarlayın.
    6. Set Sahne seviyesi A.
    7. 180 sn ışıldama pozlama süresini ayarlayın.
  8. Daha pozitif yavrularından elektroporasyona alanı ölçmek ateşböceği lusiferaz için aşağıdaki DLIT ayarlarını kullanmak için 3 boyutlu resimlerin oluşturulması için.
    Ekran 3
    Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
    1. Fotoğraf üzerinde bir onay işareti koymak; kamera ölçüm başladıktan sonra yukarıda bir fotoğraf alır.
    2. Yapı üzerinde bir onay işareti ayarlama, hayvanın önce yüzey biyoışıldama ölçüm IVIS tarafından taranır.
    3. Use iki hafta yaşına kadar Emisyon filtreleri ve pozlama süresi aşağıdaki ayarları değiştirebilirsiniz:
      Emisyon filtre 1: 590 nm, pozlama süresi 300 sn
      Emisyon filtresi 2: 600 nm, pozlama süresi 240 sn
      Emisyon filtresi 3: 620 nm, pozlama süresi 180 sn
      Emisyon filtresi 4: 640 nm, pozlama süresi 120 sn
      P20 daha yaşlı sıçanlarda
      Emisyon filtre 1: 600 nm, pozlama süresi 300 sn
      Emisyon filtresi 2: 620 nm, pozlama süresi 300 sn
      Emisyon filtresi 3: 640 nm, pozlama süresi 300 sn
      Ekran 3
      Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
      Nedeniyle yaşlı hayvanlarda sinyal gücü azalmaya, pozlama süresi üç iyi emisyon filtreleri için büyütülür.
    4. Set Sahne seviye B
    5. Orta binning ayarlayın.
    6. 1 de F / Stop Set
  9. Sonra ölçüm, mar birbirinden onları ayırt etmek için bir kulak deliğinin kod ile sıçan k ve IVIS Canlı Görüntüleme bunları fotoğraflara maç
  10. Ölçüm prosedürünün sonunda, izofluran akını kapatın ve kendi kafesine dönmeden önce birkaç dakika boyunca ısıtılmış tabakta sıçan tutmak.

3. Biyoparlaklık Görüntüler Analizi

3D görüntüler, 3D film ve sinyal kaynağının hacminin nicelikleme nesil Yaşayan Image yazılımı IVIS Spectrum önceden yüklenmiş tarafından yapılır.

  1. 3D görüntüler Üretimi
    1. İlk olarak, bir yüzey topografya yeniden, bu nedenle% 20-30 arasında eşik ayarlayın.
      Ekran 4
      Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
      Ekran 5
      een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
    2. Her dalga boyu için% 10 bir görüntü eşik ile DLIT 3D yeniden başlatın.
      Ekran 7
      Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
      Ekran 8
      Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
      Screen 9
      Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
    3. 3D araç içinde animasyon düğmesini kullanarak 3D filmler oluşturun.
    4. 3D görüntünün farklı yönelimlerin yanı sıra anahtar kare olarak yakınlaştırma görüşlerini seçin ve 'Record & # tuşuna39, düğme, tek bir pozisyon / yönlendirme diğerine geçi kayıt.
      Ekran 10
      Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

4. Davranışsal Test

Davranış testleri sıçanda IUE aracılı gen manipülasyonu erişkinliğe uzun vadeli etkileri başlatmak olup olmadığını belirlemek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Bu özel durumda, geçici bir etki, İEÜ'de sonra tek taraflı tam boy insan kortikal DISC1 aşırı ifadesi ile ilgili dopamin için özel bir test olarak, amfetamin düşük doz ile ve olmadan (OF), bir açık alanda hareketlilik testi ile araştırılmıştır davranış 24. Tarafından gerçekleştirilen benzer bir prosedürde Niwa ve diğerleri. DISC1 demonte, IUE fareler değil kullanılarak IUE farelerde kontrol aşırı duyarlılık gösterdi18, amfetamin için.

Rahimde bir DISC1 aşırı ifade eden bir vektör ile elektropore edildi sıçanlar 07:00-07:00, 12 saat ışık ile laboratuar koşulları altında yapılmıştır ve ad libitum beslendi. 3 aylık sıçanlar davranış testi uygulandı.

Amfetamin etkileri bir okuma, ses ve ışığa izole edilmiş oda içinde yer alan bir tru tarama etkinliği sisteminin bir açık-alan olarak lokomosyon miktarının belirlenmesi için kullanılmıştır. Bu sistem süreyi ölçer ve açık alanın marjı veya merkezinde harcanan hayvan hareketleri, zaman ve mesafe mesafe, hem de davranış 25 yetiştirme.

  1. İlk gün, tuzlu enjeksiyondan sonra sınamak
    1. Hayvanlar tartılır.
    2. Periton boşluğu içine bir tuzlu su çözeltisi (1 x PBS) 1 ul / g vücut ağırlığı enjekte edilir.
    3. Sağ enjeksiyonundan sonra, açık alana hayvan koymak ve TruScan sistemin ölçümü başlatın. 15 dk An için rekord 3 x 5 dk bölüme verileri bölmek.
    4. Geri eve kafese hayvan koymak.
  2. Amfetamin enjeksiyon İkinci gün, testi
    1. Hayvanlar tartılır.
    2. Intraperitoneal, 0.5 mg / ml amfetamin çözeltisi 1 ml / g vücut ağırlığı enjekte edilir.
    3. Enjeksiyon açık alana hayvan koymak ve TruScan sistemin ölçümünü başlatmak hemen sonra. 15 dakika için rekor ve 3 x 5 dk bölüme verileri bölmek.
    4. Onun ev kafesine hayvan dönün.
  3. Lokomosyonu ve belirli Tru Scan yazılımı tarafından üretilen yetiştirme davranışlarını analiz. Graphpad (Prizma) ile Grafikler oluşturma ve SPSS İstatistik yazılımı tarafından istatistikleri hesaplar.

Representative Results

Şekil 3, 150 mg lusiferin / kg vücut ağırlığı arasında, enjeksiyondan sonra, P7 az üç sıçan yavrularının görüntüleme ölçümleri canlı. İEÜ verimliliğindeki değişkenlik gösteren sinyal gücü farklar görülebilir. Güçlü biyolüminesans sinyaller P36 (Şekil 4) kadar kaydedildi. Şekil 5'de, biyolüminesans görüntüleme kortikal (Şekiller 5A ve 5C) ve hipokampal (Şekil 5B ve 5D) elektroporasyon tanımlama yeteneği tasvir edilmiştir. Kafatası kaldırma (Şekil 7B) ve P14 da cryosectioned beyin (Şekil 8) karşılık gelen GFP-Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin sonra floresan sinyali ile biyoışıldama sinyali (Şekil 7) arasındaki korelasyon, Şekil 6-8 de gösterilmektedir. Not, orada hiçbir herhangi bir zaman noktasında, canlı farelerde bir floresan sinyalinin tespiti.

çadır "> in vivo görüntüleme biyoışıldama gösterilen örneklerde. 2B, farklı Elektroporasyona beyin alanlarında yaklaşık ayrımı büyük ölçüde 3D ​​görüntüler (Şekiller 5C ve 5D) üreten IVIS Spectrum yazılımın DLIT programı ile artırıldı (Şekil 5A ve 5B) sağlar , prefrontal korteks ve hipokampus elektroporasyon ayırt edilebilir. Bu hipokampus electroporate hedeflerken, hipokampus korteks yalan dorsal için bazı progenitör hücreler de (Şekil 7) isabet edilebilir olduğu unutulmamalıdır.

Tek taraflı rahimde, korteks içine pCAX vektör ile elektropore ve ardından tam uzunlukta bir insan DISC1 aşırı ifade eden fareler yetişkin olarak spontan ve amfetamin ile endüklenen hiperaktivite hem de incelenmiştir. PCAX-Disc1 ile elektropore edildi sıçanlar amfetamin düşük doz aşırı duyarlı idi. Bu fareler önemli ölçüde mo taşınanYeniden sonra tuzlu su enjeksiyonuna göre daha amfetamin tedavi sonrasında ise kontrol hayvanları (Şekil 10) vermedi.

Şekil 1
Şekil 1. A) korteks elektroporasyon ve B) hipokampal elektroporasyon için elektrot konumunu düzeni, yeşil = ventrikül içindeki DNA-Mix enjekte.

Şekil 2,
Şekil 2. Lusiferaz reaksiyon.

Şekil 3,
Şekil 3,. / Kg vücut ağırlığı luciferine 150 mg enjeksiyonundan sonra P7 farelerin lüminesans ölçümü; maruz kalma süresi 180 saniye; hiçbir ışık yayılması sinyali A) sıçan, B) fare zayıf biyolüminesans sinyal ile, güçlü bir lüminesan sinyal ile C) sıçan.

Şekil 4,
Şekil 4. IUE başarı tespit edilebilir büyük bir zaman penceresini gösteren 150 mg / kg luciferine enjeksiyonundan sonra aynı sıçanın arka arkaya biyoışıldama ölçümlerinin saat hattı.

Şekil 5,
Hipokampus B) & D). C) & D) 3D resimler;; korteks A) ve C). P7 A) & B kortikal ve hipokampal elektroporasyon arasındaki farklar) 2D resim Şekil 5 İllüstrasyon.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6,. P14 A bir sıçan yavru E16 hipokampal elektroporasyon) biyolüminesens B 2D-resim) biyoışıldama sinyal C 3D resimde) İllüstrasyon biyoparlaklık sinyali D) beyin GFP epi-floresan sinyali ile birlikte beyin disseke. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7
Şekil 7. GFP ihtiva eden plasmid ve lusiferaz ile elektroporasyona aynı P14 fare beyni bir 20 um cryo bölümünden bir floresan resmin Detayvektör, DAPI ile çekirdekler boyama; CA1-3 = Cornu ammonis 1-3; DG = kıvrımlarının; FC = Fasciolarum cinereum.

Video 1. Bir hipokampus 3D animasyon P14 de sıçan elektropore.

Şekil 8,
Şekil 8,. Amfetamin testi şeması: ilk gün serum fizyolojik enjeksiyonu 15 dakika duruşmadan önce, 24 saat sonra amfetamin açık alanda odasında test etmeden önce enjeksiyon.

Şekil 9,
Şekil 9,. Amfetamin testi. . Gri çubuklar = DISC1 aşın grubu; kontrol grubu n = 10; 15 dk Beyaz çubuk = kontrol grubu üzerinde bir TrueScan sistem tarafından kaydedilen hayvanın (cm) kaydırabilir mesafeyi gösteren bar grafiği DISC1 overekspresyonu grubu n = 11; ANOVA: soykırımından * tedavi p = 0.043; amfetamin ns vs toplam süre tuzlu = değil önemli Pcontrol = 0.172, pDISC1 = 0.001 T-Testi.

Discussion

Çalışmamız IUE nöronların beyin seçici bir alanda bir transgen ifade eden ve bu müdahalesinin bir sonucu olarak, bu hayvanlar yapılan manipülasyon işlevselliğini gösteren davranış değişiklikleri gösteren yetişkin fareler üretmek için uygun olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, bir örnek olarak, prefrontal kortekste küçük bir kısmında, tek taraflı DISC1 aşırı ifade eden fareler amfetamin karşı aşırı duyarlılık (Şekil 9) göstermektedir.

In vivo görüntüleme biyolüminesans ile elektroporasyon başarı için fareler seçme IUE hücre transfeksiyon doğal değişkenlik kontrol edilmesinde etkili olduğu ve daha sonraki incelemeler için düşük denekler arası değişkenlik homojen IUE alana sahip gruplar elde etmek için uygulanmıştır.

Bu çalışmada, biz Tho bile, yeni doğan hayvan ko-elektroporate GFP-uyarılan floresan tespiti ile çöp itibaren Electroporated yavrular seçmek koyamadıköf, aynı zamanda ve aynı hayvanda eşit eş elektroporate lusiferazın bir biyoışıldama sinyal luciferase enjeksiyon (Şekil 6) sonra tespit edilebilir, ve nöronlar ifade GFP altı aylık yaşta hala beyin mevcuttu. Biz, sıçan, lusiferaz / lusiferin Reaksiyon başarılı elektroporasyona beyinleri ile hayvanlar (Şekil 3) ayırt etmek için çok uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

IUE başarı kantitatif kontrolü aynı maruz kalma süresi (Şekil 3) içinde fotonların sayısı ile ölçülür ve ortak tanımlanmış lusiferaz enzimatik aktivitesine karşılık gelir biyoışıldama sinyalinin gücü ile ilgilidir. Küçük biyoışıldama sinyalleri 6 aylık sıçan beyninde histolojide ~ 1x10 4 fotonlar / sn / cm 2 / steradyan göstermek 1,000-2,000 GFP-boyanmış hücrelerin bir parlaklık ile, foton sayıları 100-200 tarafından saptanabilen ve. Yüksek sinyal dispbir ışıltısını koydu ~ 5x10 6 fotonlar / sn / cm 2 / steradyan ve ~ 64.000 sayıları kadar.

Kullanılan Sprague Dawley fare suşu olarak, artan yaşla birlikte uzunlamasına biyoışıldama sinyalin zayıflamasına gözlenen ve sinyal P35 yaşına (Şekil 4) ötesine kayboldu. Bu noktada, lusiferazın geçici, plazmid vektör tabanlı ekspresyon ya da azaltır, ve biyoışıldama sinyal nedeniyle artan beyin kitle, veya her ikisi de yok olan sinyal için nedenleri için zayıfladıkça olup olmadığını bilmek yoktur. Yetişkin farelerde, bu fonksiyonel deneyi için, davranış çalışmaları için seçim sadece sinyalin yere göre yapılan, ancak bio-sinyal gücüne göre edildi.

3D niceliksel biyolüminesans izlenmesi farklı elektroporate alanlarda (Şekil 5) arasındaki farklılaşma izin olsa da, onun titizlikle derinlik kuruş bulunan hücreler için sınırlıBeynin nsion. Şekil 6 2D ve 3D resimde biyoışıldama ölçüm elektroporasyon iyi bir konumlandırma belirtilen bir hipokampal elektroporasyon bir örneğini göstermektedir. Parçalara ölüm sonrası beyinde, bir GFP floresans sinyali hipokampusun doğru hedefleme gösteren, biyoışıldama sinyali ile aynı konumu hakkında tespit edildi. Ama histoloji gösterileri de hipokampus korteks dorsal hücreler (Şekil 7) hedef olmuştu. Bu biyoışıldama deney olumlu, İEÜ yavrular tespit etmek ve aynı zamanda Electroporated alanının bir fikir var, ama, sonuçta, görüntüleme tam olumlu hedeflenen hücrelere lokalize otopsi histoloji yerini alamaz yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.

Bizim gösteri c sapmaları simülasyonu hipokampal, kortikal ya da beyin bölgelerinin ince hedef manipülasyonlar oluşturmak için IUE teknolojinin uygulanması için söz gösterirortical göç veya yetişkin hayvan etkileyebilecek diğer nörogelişimsel kusurlar. İkili elektroporasyon 26 davranışı üzerinde olası bir daha büyük bir etki avantajına sahip olmakla birlikte, embriyoların daha fazla ölüm oranı da vardır. Tek taraflı tek taraflı bir elektroporasyon, küçük bir bölgede daha IUE manipulasyon davranışı değiştirmek için yeterli olduğunu göstermek için bir iç kontrol olarak tek, hem de sahip iki hemisfer karşılaştırmak amacıyla seçildi. Nöronlar arasındaki bağlantı ya da mimari IUE kaynaklı değişimler, uygun bir davranış testi ile bir lezyon ve-olduğu-IUE-manipüle bölgenin istenen maç uyandırma olmadan indüklenebilen bilimsel söz bağlıdır.

Sorun giderme

İndirimli DKBKS İEÜ yavruların hayatta artan ilgili çeşitli öneriler vardır. İlk olarak, elektroporasyon sırasında çok ince cam kılcal damarların kullanılması doku lesio en aza indirmek amacıylan tavsiye edilir. İkincisi, her uterus boynuzu vajinal sonunda ilk embriyo electroporate yok: ilk doğan embriyonun ölümü diğer tüm embriyoların bir iptale şansını artırır. Üçüncü olarak, doğumdan sonra, anne fareler nedeniyle sık sık perinatal stres onların döl kısmını öldürür. Ek stresi azaltmak için, doğumdan hemen sonra canlı görüntüleme ile başlar, ama yedi gün boyunca bekleyin.

Yavruların-GFP floresans saptama

Bir hafta doğumdan sonra, IVIS Spektrum canlı binoküler floresan mikroskopik görüntüleme veya floresan görüntüleme kullanarak ya floresan sinyal (epifluorışıma ve transfluorescence modları; GFP uyarma / emisyon için: 465/520 nm ve 500/540 nm). Bu, derinin kafatası ve yüksek otofloresan arka plan gibi doku ile kısa dalga boyu uyarım ve emisyon ışık iletimi sınırlı azalan altında floresan kullanarak engellemek hem de mümkündürSıçan koşulları ribed. Şekil 6'da gösterildiği gibi, canlı bir hayvanda lusiferaz sinyali de (kafatası olmadan) kesilir beyinde tespit edilebilir ve burada, aynı zamanda, bir floresan sinyali (Şekil 6D) tespit edilebilir.

Yakından aralıklı beyin bölgelerinde biyolüminesensin Farklılaşma

Hatta 3D resimde biyoışıldama alanının konumu% 100 tahmin edilemez. Ya da tahmin edilen alanın altında üstünde özellikle hücreler de yanlışlıkla hedef ve transfekte edilebilir. Kesin konum (bkz. Şekil 7) ölüm sonrası (floresans) histoloji tarafından kontrol edilmelidir.

Disclosures

Bu çalışmanın yazarları, bu çalışmada mali ilgi yok ve bu çalışma için endüstrisi tarafından desteklenen edilmemiştir. Açık erişim ücreti PerkinElmer Inc sonrası yayın ile katkıda bulunmuştur.

Acknowledgments

Yazarlar plasmidlerini sağlamak için Tracy Young-Pearse'nin ve Atsushi Kamiya teşekkür ederim.

CK, ve MASS (DE 792/2-4); Bu çalışma OR ve CK (Bmbf 01EW1003), DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) için NEURON-ERANET keşfetmek tarafından finanse edildi

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O		 100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  2. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  3. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  4. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  5. Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  7. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
  8. Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  10. Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
  11. Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
  12. Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
  13. Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
  14. Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
  15. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
  16. Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  17. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
  18. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  19. Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).
  20. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
  21. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  22. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
  23. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
  24. Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
  25. Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
  26. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).

Tags

Nörobilim Sayı 79 Hippocampus Bellek Şizofreni, Luciferase bozulmuş-in-şizofreni-1 (DISC1)
Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O.,… More

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter