In vivo Två-foton avbildning av erfarenhet beroende molekylära förändringar i kortikala neuron

Summary

Erfarenhet beroende molekylära förändringar i nervceller är viktiga för hjärnans förmåga att anpassa sig till följd av beteendemässiga problem. En<em> In vivo</em> Två-photon avbildning metod beskrivs här som gör det möjligt att spåra sådana molekylära förändringar i enskilda kortikala neuroner genom genetiskt kodade reportrar.

Abstract

Hjärnans förmåga att förändras som svar på erfarenhet är väsentlig för friska hjärnans funktion, och avvikelser i denna process bidrar till en mängd olika sjukdomar i hjärnan ^1,2. För att bättre förstå de mekanismer genom vilka hjärnans kretsar reagerar på ett djurs upplevelse kräver förmåga att övervaka erfarenhet beroende molekylära förändringar i en viss uppsättning av nervceller under en längre tid, i det levande djuret. Medan erfarenhet och tillhörande neural aktivitet är känd för att utlösa förändringar genuttryck i nervceller ^1,2, de flesta av de metoder upptäcka sådana förändringar tillåter inte upprepas observation av samma nervceller över flera dagar eller inte har tillräcklig upplösning för att observera enskilda nervceller ^{3 , 4.} Här beskriver vi en metod som kombinerar in vivo två-foton mikroskopi med en genetiskt kodad fluorescerande reporter att spåra erfarenhet-beroende förändringar genuttryck i enskilda kortikala neuroner över Under dag till dag erfarenhet.

En av de väletablerade erfarenhet-beroende gener är Aktivitet reglerade cytoskelett associerat protein (Arc) ^5,6. Transkriptionen av Arc är snabbt och mycket induceras av intensifierade neuronal aktivitet ^3, och dess proteinprodukt reglerar endocytos av glutamatreceptorer och långsiktig synaptisk plasticitet ^7. Uttrycket av Arc har allmänt använts som en molekylär markör för att mappa neuronala kretsarna involverade i specifika beteenden ^3. I de flesta av dessa studier Arc uttryck detekteras genom in situ hybridisering eller immunohistokemi i fasta hjärnan sektioner. Även om dessa metoder visade att uttrycket av Arc lokaliserades till en delmängd av excitatoriska nervceller efter beteende erfarenhet, hur de cellulära mönster av Arc uttryck kan ändras med flera episoder av upprepade eller särskiljande upplevelser under dagarna inte undersöktes.

ntent "> In vivo två-foton mikroskopi erbjuder ett kraftfullt sätt att undersöka erfarenheterna cellulär förändringar i den levande hjärnan ^8,9. För att granskningen av Arc uttryck i levande nervceller med två-foton mikroskopi, genererade vi tidigare en knock- i mus linje där en GFP reporter placeras under kontroll av den endogena Arc promotorn ^10. Detta protokoll beskriver kirurgiska förberedelser och procedurer imaging för att spåra erfarenhet-beroende Arc-GFP uttryck mönster i neuronala ensembler i det levande djuret. I denna metod , kroniska kraniala fönster först implanteras i Arc-GFP möss över kortikala regionerna av intresse. Dessa djur sedan upprepade gånger avbildas genom två-foton mikroskopi efter önskade beteendet paradigm under loppet av flera dagar. kan vara tillämplig för djur som bär denna metod andra fluorescerande reportrar erfarenhet beroende molekylära förändringar ^4.

Protocol

De experimentella procedurer som beskrivs nedan godkändes av National Institute of Mental Health Animal Care och användning kommittén och var i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur. 1. Preoperativ Förberedelser Rengör alla verktyg i en varm pärla autoklav före aseptisk kirurgi, rengör operationsstället med 70% etanol, och lägga ner ren droppe dukar. Bär sterila handskar. Bedöva djuret med nyberedd 1,2% Av…

Representative Results

Detta protokoll beskriver en metod för att spåra erfarenhet beroende molekylära förändringar i enskilda kortikala neuroner i levande djur. En kronisk kraniell fönster först skapade över en kortikal område av intresse i en mus bär en fluorescerande reporter av genuttryck. Två-foton mikroskopi kan sedan kopplas med olika beteendemässiga paradigm att observera beteendemässigt inducerade molekylära förändringar i enskilda nervceller och spåra sådana förändringar i samma uppsättningar av nervceller…

Discussion

In vivo imaging metod som beskrivs här möjliggör upprepad undersökning av uttryck Arc gen förändras i samma uppsättningar av nervceller under flera dagar i det levande djuret. Det är en effektiv och mångsidig metod för att få information om neurala plasticitet-relaterade molekyldynamik i enskilda nervceller som svar på olika beteendemässiga upplevelser. Standard histokemiska metoder såsom in situ hybridisering och immunfärgning kan uppnå encelliga upplösning ^3, men saknar f?…

Materials

Name of the Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
FV1000 multi-photon laser scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	Imaging
Dissection microscope	Omano	555V107	Surgery
Stereotaxis surgery stage for mice	Harvard Apparatus	726335	Surgery
20X or 25X water immersion objective	Olympus	XLPL25XWMP	Imaging
Microscope stage with head-fixation frame	Custom made	N/A	Imaging
Fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Surgery
Dental drill burr	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
CCD camera	QImaging	QICAM 12-bit	Imaging