Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Published: January 5, 2013 doi: 10.3791/50148
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 4, 1
1Unit on Neural Circuits and Adaptive Behaviors, Genes Cognition and Psychosis Program, National Institute of Mental Health, 2Department of Neuroscience, Brown University - National Institutes of Health Graduate Partnership Program, 3Section on Synaptic Pharmacology, Laboratory for Integrative Neuroscience, National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, 4Champalimaud Neuroscience Programme, Champalimaud Center for the Unknown

Summary

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir. An

Abstract

Deneyimi yanıt olarak değiştirmek için beyin yeteneği sağlıklı beyin fonksiyonu için önemlidir ve bu süreçte anormallikler beyin bozuklukları 1,2 çeşitli katkıda. Iyi beyin devrelerinin bir hayvanın deneyimi tepki hangi mekanizmalar anlamak için canlı hayvan, zaman uzun bir süre boyunca, nöronların belirli bir set deneyimi bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için yeteneği gerektirir. Deneyim ve ilişkili nöral aktivitenin nöronlar 1,2 gen ekspresyon değişiklikleri tetiklemek için bilinen iken, yöntemlerin çoğu bu değişiklikleri algılamak için birden fazla gün içinde aynı nöronların tekrar gözlem izin vermez ya da bireysel nöronlar 3 gözlemlemek için yeterli çözünürlüğe sahip değilsiniz , 4. Burada, üzerinde bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı gen ekspresyon değişiklikleri izlemek için genetik olarak kodlanmış floresan muhabiri olan iki foton mikroskopi vivo birleştiren bir yöntem tarif gün-gün deneyim tabii.

Köklü deneyimi bağımlı genlerden biri Aktivite regüle sitoskeletal ilişkili protein (Arc) 5,6 olduğunu. Arc transkripsiyon hızla ve son derece yoğunlaştırılmış nöronal aktivitenin 3 ile tetiklenen, ve onun protein ürünü glutamat reseptörleri ve uzun vadeli sinaptik plastisite 7 endositoz düzenler. Arc ifadesi yaygın 3 özel davranış katılan nöral devrelerin eşlemek için bir moleküler belirteç olarak kullanılmıştır. Bu çalışmaların çoğunda, Arc ifadesi sabit beyin bölümlerinde situ hibridizasyon veya immünohistokimya saptandı. Bu yöntemleri Arc ifade Arc ifade hücresel desenleri gün boyunca tekrarlanan ya da farklı deneyimler çoklu atakları ile değişebilir incelenmiştir değildi nasıl davranışsal deneyim, sonra eksitatör nöronların bir alt kümesi lokalize olduğunu göstermiştir rağmen.

ntent "> in vivo iki foton mikroskopi canlı beyin 8,9 deneyim bağımlı hücresel değişiklikleri incelemek için güçlü bir yol sunar. iki foton mikroskopi ile canlı nöronlar Arc ifade muayene etkinleştirmek için, önceden oluşturulan bir knock- fare doğrultusunda bir GFP muhabiri endojen Arc organizatörü 10 kontrolü altında yerleştirilir. hangi Bu protokol cerrahi hazırlıkları ve canlı hayvan nöronal toplulukları deneyim-bağımlı Arc-GFP ifade desenleri izlemek için görüntüleme yöntemleri anlatılmaktadır. Bu yöntemde , kronik kranial pencereler ilk ilgi kortikal bölgeler üzerinde Arc-GFP fareler implante edildi. Bu hayvanlar daha sonra art arda birkaç gün boyunca istenilen davranış paradigmaları sonra iki foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bu yöntem taşıyan hayvanların genel olarak uygulanabilir olabilir diğer floresan gazetecilere deneyim-bağımlı moleküler değişikliklere 4.

Protocol

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Ruh Sağlığı Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Ulusal Enstitüsü tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre idi.

1. Pre-operatif Hazırlama

  1. Aseptik cerrahi öncesi sıcak boncuk sterilizatör tüm araçları temizleyin,% 70 etanol ile cerrahi alan temiz ve temiz açılan bezler indirdi. Steril eldiven giyin. Ml / g, intraperitonially 0.02 verilen taze hazırlanmış% 1.2 avertin çözeltisi ile hayvan anestetize. Alternatif olarak, pasif bir çöpçü devreli bir burun konisi, indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5, izofluran ile gaz ile uyutmak. Tam sedasyon sağlamak için kuyruk veya ayak tutam kullanarak anestezi seviyesini kontrol edin.
  2. Steril oftalmik merhem ile hayvanın göz kapağı ve taze hazırlanmış deksametazon enjekte edilir (0.2 mg / kg) ve karprofen (5 mg / kg) subcutaneouslBeyin şişme ve iltihaplanmayı önlemek için 11 y. Kulakları arasındaki kafatası üzerinde saç Tıraş ve betadin fırçalayın ve% 70 etanol üç alternatif bezlerle cildi sterilize.
  3. 37 hayvan seti altında bir su sirkülasyon ısıtma pedi ile, earbars olan bir stereotaksik cerrahi aşamasında hayvan monte ° C. Düzenli hayvanın anestezi düzeyleri kontrol etmek ve gerektiğinde orijinal anestezik dozu tamamlamak.
  4. Alan uyuşturmak için kafa derisi deri altına% 0.5 marcain 200 ul enjekte edilir. Cilt kesilirken ve kafatası üzerinde flep kaldırmak. Periost çıkarın ve temiz pamuklu çubukla kurulayın.

2. Kronik Kranial Pencere Cerrahisi

  1. Yavaşça ilgi beyin bölgesi üzerinde 3-5 mm çaplı daire özetledi 0,5 mm çapak ile yüksek hızlı bir diş matkap kullanın. Düzenli, temiz pamuklu çubukla steril% 0.9 salin ve uzak net kemik tozu ile sondaj sahasını ıslak. Kemik kanamaları, g kullanınelfoam taşma kurulayın ve bunu durdurmak için beklemek steril serum fizyolojik ile çimlendirilmiş.
  2. Son kemik tabakası ulaşıldığında, ince uçlu forseps ile kemik ada kaldırın ve çıkarın. Penceresinde bir kemik sütür geçerse kemiğin alt rafa Dura ekleri karşılaştı olabilir. Kemik kapak kaldırıldığında gibi Bu nazikçe kaldırılması gerekir.
  3. Rulo yüzeyi temizlemek ve durdurmak için herhangi dural kanama için beklemek maruz dura üzerinde hafifçe jel köpük nemlendirilmiş Kritik adım:. Tüm dural kanama durana kadar devam etmeyin. Kraniyal pencere içine hapsolur Kan genellikle opak bir pencere açar.
  4. Dura yukarıda dura kaldırarak, özellikle kalın olduğu ilgi bölgesi bir yer altında ise, gerekli olabilir. Bu durumda, hafifçe çok ince forseps ile aşağıdaki pia gelen dura ayırmak, ince forseps bir çift ile kaldırdı dura küçük bir kesi yapmak, sonra kesik kenarları kavrayın ve yavaşçadura bölünmüş. Dura ince fakat kuvvetli, yani dura sağlam kenarları ile beyin dilim için dikkatli olun.
  5. Steril ACSF veya steril serum fizyolojik ile alanı durulayın.
  6. . Dura veya pia üzerinde steril bir cam lamel (3-5 mm) Kritik adım Lay: çevreleyen kafatası eğrileri önemli ölçüde ise, dura veya pia bölgelerde lamel ile yakın temas yapmazdım yerleri doldurmak için Kwiksil 12 yapıştırıcı kullanın bilgidir olmayacaktır.
  7. Elastomer yapıştırıcı ve cam lamel kenarlarını kaplayacak şekilde Siyanoakrilat jeli kullanın. . Herhangi bir siyanoakrilat jel beyin yüzeyine temas etmesine izin vermeyin: siyanoakrilat jel veya krazyglue ve diş çimento karışımı ile tüm maruz kafatası Kritik adım örtün.
  8. Kafatasının karşı ucuna bir ısmarlama metal kafa sabitleme çubuğu gömün.
  9. Ketoprofen bir İntraperitoneal enjeksiyon, 5 mg / kg fo sonra, sıcak bir iyileşme odasına hayvan Dönüşr ağrı yönetimi. İki gün daha operasyon sonrası için analjezik devam edin.
  10. Ameliyat sonrası iyileşme iki hafta sonra, (indüksiyon için% 5, bakım için% 1.5) izofluran ile hayvan uyutmak, bir baş-fiksasyon çerçeve ile ısmarlama bir mikroskop aşamasında monte ve optik netlik için kraniyal penceresini kontrol edin mavi ışık ile aydınlatma altında. Beyin yüzeyi damar netlik kraniyal pencere kalitesi önemli bir göstergesidir. Damar kenarları keskin olarak tanımlanmış ise, pencereyi kullanılabilir olması muhtemeldir. Iki hafta ameliyat sonrası iyileşme süresi cerrahi kurtarmak için hayvan için yeterli zaman tanımak için tavsiye edilir. Kraniyal pencereler genellikle temizlemek ve iyileştirmek bu süre içinde, ve dura kafatası veya kalınlaşma büyütme penceresi kalitesini düşürür kadar ay ek hafta optik saydam kalır.

3. İki foton Mikroskobu, Taramalı Davranış Protokolü ve Lazer

  1. Net c Hayvanlarranial pencere çevresel bir uyarıcı maruz kalan ya da bir davranış antrenman tabi tutuldu ve daha sonra maksimal Arc-GFP tanımının o zaman sonra yansıma olacaktır. Bir davranış protokolü başlamadan önce, hayvan bazal Arc-GFP ifade düzeylerinde gün-gün varyasyonu azaltmak için tutarlı bir ev kafes ortamında tutulmalıdır.
  2. Ilgi beyin bölgesine bağlı olarak, davranışsal eğitim veya çevresel stimülasyon paradigmaları başlayın. Örneğin, hayvanlar ardışık gün içinde farklı görsel ortamlara maruz kalabileceği ve görsel korteks 10 uyarıcı-özel yanıtlar tanımlamak için görsel uyarı sonrasında her gün görüntülenmiş.
  3. Nöronlarda Arc-GFP floresan genellikle iki saat stimülasyonu sonrası doruk düzeyine ulaşır. Deneysel çizelgesi doruğa floresan seviyelerde nöronlarda Arc-GFP tanımının algılama için optimize edilebilir.
  4. Davranışsal bir antrenmandan ya environmenta sonral uyarım tamamlandığında, (indüksiyonu için% 5, bakım için% 1.5), izofluran ile hayvan anestetize ve iki-fotonlu mikroskop altında kafa tespit çerçeve ile ısmarlama mikroskop aşamasında hayvan monte edin.
  5. Hayvanın baş pozisyonu kafatası üzerinde implante metal çubuk kullanarak, sahne doğrudan bağlanan kafa fiksasyon çerçeveye sabitlenir. Isoflurane ve oksijen kesintisiz bir burun yoluyla fare için temin edilir. Vücut sıcaklığı bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur.
  6. Mikroskop dedektörler karanlık bir odada iki foton lazer tarama yaparak ortam ışığı korunur emin olun. Görüntüleme için bir 20x veya 25x (1.05 sayısal diyafram) suya daldırma objektifi kullanın. Birincisi, epi-floresan aydınlatma altında, gelecekte görüntü uyum için bir CCD kamera ile ilgi beyin bölgesi üzerinde yüzey damar desenleri bir görüntü kazanır.
  7. 3-D görüntü yığını elde etmek için tarama iki foton lazer başlatın. Bir Olympus FV1000MPE çoklu foton mikroskop bizim kurulum kullanılmaktadır. Iki-fotonlu lazer uyarma dalga uzunluğu 920 nm 'de yer almaktadır, ve objektif yayılan lazer gücü yaklaşık 50 mW ayarlanır. Yayılan floresans eşzamanlı örneği yakın yerleştirilmiş harici iki kanallı photomutiplier algılama sistemi kullanılarak yeşil ve kırmızı kanalları (570 nm'de dikroik ayna, 495-540 nm ve 570-625 nm bariyer filtreler), tespit edilmiştir. Doku oto-floresans kanal 13, 14 hem görünür, oysa Arc-GFP floresan sadece yeşil kanal görünür.
  8. Tipik görüntü yığınlarını yaklaşık 320x320x100 mikron boyutları (en x boy x derinlik), 0,5 mikron / piksel yatay çözünürlük ve 3 mikron / piksel dikey çözünürlüğe sahip.
  9. Görüntü yığını aldıktan sonra, onun ev kafesine hayvan dönün. Sonraki davranış ve görüntüleme oturuma kadar hayvan rahatsız etmeyin. Desir olarak gün boyunca davranış ve görüntüleme işlemi tekrarlayıned. Geri aynı görüntüleme konuma yönlendirmek için önceden edinilmiş beyin yüzeyinde kan damarı resmi kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol canlı hayvanların bireysel kortikal nöronların deneyim-bağımlı moleküler değişiklikleri izlemek için bir yöntem açıklanır. Kronik bir kraniyal pencere ilk gen floresan muhabiri taşıyan bir fare bir ilgi kortikal bölge üzerinde oluşturulur. İki foton mikroskopi sonra tek tek nöronların davranışsal indüklenmiş moleküler değişiklikleri gözlemlemek ve birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri tür değişiklikler (Şekil 1) izlemek için çeşitli davranışsal modeller ile birleştiğinde olabilir.

Arc-GFP farelerde, Arc gen ekspresyonu deneyim bağımlı değişiklikler güvenilir bu protokolü kullanarak birden fazla gün için tek tek kortikal nöronlarda görüntülenebilir. Transgenik Arc-GFP knock-in mouse acil erken gen Arc endojen promotör (Şekil 2) kontrol altında (d2EGFP, protein yarı-ömrü, yaklaşık iki saat) bir istikrarsız bir yeşil floresan proteini ifade eder.

ontent "kronik kraniyal pencere açıklayan> Geçmiş protokolleri başarılı kraniyal pencere ameliyatları 11 yürütmede kritik adımları ana hatlarıyla. Bu protokol, pencereler kafatası dikişler üzerinde bulunması halinde net optik camlar alınma ihtimalini artırır, gerekirse dura giderilmesinde ek rehberlik sağlar (Adım 2.4 'e bakınız).

Kafatası pencere ameliyat sonrası iyileşme sonra, hayvanlar bir ısmarlama baş tespit çerçeve ve aşama olarak monte edilmiştir. Şekil 3 headbar ve iki-fotonlu görüntüleme sırasında kafa tespit çerçeve gösterilmektedir. Tutarlı bir iki foton mikroskop görüntüleme aşamasında konum ve kurulum bakımı önceden görüntülü beyin bölgesi dönerken görüntülerin gün-gün yeniden düzenlenmesi kolaylaştırmak ve birden çok hayvanlar aynı gün (Şekil 4) yansıması zaman deneysel verimliliğini artıracaktır.

Davranışsal eğitim veya çevresel stimülasyon sırasında, tavsiye edilirEv hayvanları için tek başına ve bir çevre tutarlı ev kafeste konumda, arka Arc-GFP aktivasyon düzeylerinde gün-günlük dalgalanmaları (Şekil 1) en aza indirmek için.

Istikrarlı, açık kraniyal pencere eleştirel bir işareti epi-floresan aydınlatma altında kan damarlarının keskin bir kalıptır. Bu damar deseni görüntüleme birden fazla gün (Şekil 5) üzerinde önemli bir değişiklik olmamalıdır.

Şekil 6, bir taban çizgisi ev kafes durumda (A) altında ve yeni bir motor davranışı (B) performans sonra frontal kortikal nöronlarda Arc-GFP salgılanma modellerini gösterir. Aynı hayvanda aynı beyin bölgesi içinde katman II / III kortikal nöronlarda güvenilir bir görüntülü edilebilir, ve aynı nöronların görüntüleme birden fazla gün içinde tespit edilmesi gerekir. Bu nöronların örnek yüzlerce bir 3 boyutlu görüntü yığın toplamak için tipiktir. Nöron kenarları görüntü ler boyunca keskin ve net olmalıdırtack. Kırmızı kanalda Doku oto-floresans da pencere açıklık bir dizin sağlar. Görüntülü bölgede gün boyunca büyük ölçüde belirsizdir olursa, kraniyal pencere kalitesi olasılıkla bozulmuş. Tipik bir kraniyal pencere en az bir hafta için optik açık kalacaktır. Ay birkaç hafta sonra, dura kraniyal pencere ve kalınlaşma kenarlarından kafatası büyütme sonunda daha fazla görüntüleme deneyler önleyecektir.

Şekil 1
Şekil 1. Deney adımları özetleyen bir şema. Hayvan Hazırlık aşamasında, kraniyal pencere ameliyatları Arc-GFP fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar kafeslerine cerrahi kurtarmak için yaklaşık iki hafta verilir. Kraniyal pencere netlik sonra epi-floresan mikroskobu kullanılarak kontrol edilir. Pencere görüntüleme için hazırsanız, hayvanların tek başına, sessiz, çevreyle uyumlu yerleştirilmiştirEve kafes ortamında, nereden Deneysel Çizelgesi aşaması başlayabilir. Davranışsal stimülasyon protokolü ve görüntüleme aralığı genellikle iki saat aktivasyon sonrasında oluşan zirve floresans, at Arc-GFP algılamak için tasarlanmış olabilir. Davranışsal uyarım tamamlandıktan sonra, hayvan anestezi ve ilgi konusu kabuk bölgesi iki-fotonlu mikroskopi kullanılarak kafatası pencereden görüntülenmektedir. Hayvan daha sonra kafeslerine geri döndürülür. Davranışsal ve görüntüleme oturumları istediğiniz gibi gün boyunca tekrar edilebilir.

Şekil 2,
Şekil 2. Arc-GFP yapısını gösteren bir diyagram knock-in mouse çizgi, içinde bir gen kodlama yeşil floresan protein acil erken gen Arc kodlama bölümünü destabilize değiştirilir. Bu fare suşu olarak, GFP tanımı endojen Arc promotörün kontrolü altındadır. Bu diyagram göre yeniden çizilirReferans 10 deki açıklama.

Şekil 3
Şekil 3. Şematik ve iki-foton görüntüleme için kullanılan baş-fiksasyon kurulum boyutları. Headbar ve katı yarısı kafatasının arka (Bölüm 2.8) ile yapıştırılmış ve vida deliği ile son kareye anestezi hayvanın kafasını takmak için kullanılır. Baş-fiksasyon çerçevesi vida ile iki kutup tepesine monte edilmiş ince metal bir plakadan oluşur.

Şekil 4,
Şekil 4. Arc-GFP farelerin görüntüleme için iki foton mikroskop kurulum tarama bir lazer örneği. Bir baş-fiksasyon çerçeve ile 25x suya daldırma objektifi, ısıtma yastığı ve özel mikroskop sahne unutmayın. Burada gösterilen anestetize Arc-GFP fare in vivo görüntüleme için hazır hale gelir.

Şekil 5, Şekil 5. Zamanla damar desenleri netlik ve kararlılık gösteren birden fazla gün içinde kronik bir kraniyal pencere beyin yüzeyinde kan damarlarının görüntüleri. Beyin yüzeyi mavi ışık ile aydınlatılan ve görüntülerin mikroskop üzerine monte edilmiş bir CCD kamera ile 25x suya daldırma objektifi aracılığıyla alındı.

Şekil 6
Iki farklı davranışsal deneyimler sonrasında bir fare frontal kortikal nöronlarda Arc-GFP ifade desenlerini Şekil 6. Vivo iki foton görüntüler. (A) fare ilk gününde görüntüleme önce kendi ev kafeste kaldı. (B) fare ikinci gününde görüntüleme önce yeni bir motor davranış gerçekleştirilir. Aynı kortikal bölgenin Floresan görüntüleri eşzamanlı olarak yeşil ve kırmızı kanalları içinde satın alınmıştır. Doku otofloresans iki kanal çıktı ise GFP floresan sadece yeşil kanal ortaya çıktı. Detectiokırmızı ve yeşil iki kanal doku oto-floresans seviyeleri eşit okumaları vardı ve bu parametreler deneyler boyunca muhafaza edildi, böylece n parametreleri belirlenmiştir. Kırmızı kanal sinyali sonra off-line analiz sırasında geniş bant doku otofloresans kaldırmak için yeşil kanal sinyal çıkarıldı. 3-boyutlu bir görüntü yığını kalınlığında 18 mikron dan çıkan yeşil floresan sinyalleri Arc-GFP ifade hücresel desen bir yukarıdan aşağı bir görünüm sağlamak için, yatay düzlemde maksimum yoğunluğu tarafından tahmin edildi. Ölçek çubuğu, 30 mikron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo görüntüleme yöntemi burada açıklanan canlı hayvan birden fazla gün içinde nöronların aynı setleri Arc gen ekspresyon değişiklikleri tekrar muayene sağlar. Çeşitli davranışsal deneyimler yanıt bireysel nöronların nöral plastisite ile ilgili moleküler dinamiği hakkında bilgi edinmek için etkin ve çok yönlü bir yöntemdir. Böyle situ hibridizasyon ve immün olarak Standart histokimyasal yöntemler çözünürlüğü 3 tek hücreli ulaşmak, ancak birden fazla gün içinde aynı nöronlarda gen ekspresyon değişiklikleri izlemek için yetenek eksikliği olabilir. Biyoparlaklık, manyetik rezonans, veya nükleer görüntüleme yöntemleri uygun gazetecilere 15 ile aynı hayvan gen ekspresyonu değişiklikleri izlemek, ancak bireysel nöronların ekspresyon düzeyleri ayırt etmek uzaysal çözünürlüğü eksikliği olabilir. Gibi, gen ekspresyon değişiklikleri ölçmek için başka hiçbir mevcut yöntemleri uzamsal çözünürlük ve zamansal cov iki maçgörüntüleme yöntemlerinin erage burada açıklanan.

Bu prosedürde bir kritik adım kraniyal pencere cerrahidir. Bu iltihaba yol ve kraniyal pencere netliğini azaltacaktır cam lamel, altındaki beyin veya bırakarak kan travma önlemek için ekstra bakım ile yapılmalıdır. Pencerenin kenarlarından kafatası dura veya büyütme kalınlaşma daha ileri görüntüleme yöntemleri bilmek kadar iyi yürütülmüş kranial ameliyatları için, pencerenin birkaç hafta boyunca açık kalacaktır. Gerekirse kraniyal pencere optik netlik artırmak için, sıçanlarda ve maymunlarda 16,17 kronik optik görüntüleme deneyleri için yapılmış gibi dura, kaldırılabilir.

Bu protokolde kullanılan iki foton mikroskopi tekniği için bir sınırlama görüntüleme derinliğidir. Yüksek kaliteli görüntüler elde edilebilir hangi maksimum görüntüleme derinliği kraniyal pencere açıklığı, mikroskop kurulumu ve fluoresc ve parlaklığı bağlıdır ent gazetecilere. Arc-GFP fareler için, biz genellikle pial yüzeyden 300 mikron görüntü kadar. Derin beyin bölgelerinde gen ifadesini değiştirir incelemek için, floresan mikroendoskopi geleneksel iki-fotonlu mikroskopisi 18 derinlik sınırlama üstesinden gelmek için uygulanabilir.

Vivo görüntüleme yöntemi ile bu belirlenen gen ekspresyon değişiklikleri için potansiyel faktörlerin davranışsal performansı veya Arc-GFP indüksiyon uğratabilecek kranial cerrahi veya anestezi herhangi bir kalıcı etkileri vardır. Bu, ilk olarak sabit beyin kesitleri içinde belirli deneyimler yanıt olarak Arc-GFP etkinleştirme genel kapsamını kontrol ve in vivo iki-fotonlu mikroskopi kullanılarak tekrarlandı görüntüleme yöntemi ile gözlenen ölçüde bu karşılaştırmak için önemlidir. Ameliyat sonrası iyileşme dönemi ve yinelenen görüntüleme aralıklarla ardından Arc-GFP aktivasyonu cerrahi ve anestezi potansiyel yan etkileri en aza indirmek için ayarlanabilir.

_content "> görüntüleme yöntemi burada açıklanan diğer deneyimi ile düzenlenen genleri 4 floresan gazetecilere taşıyan transgenik fareler için genel olarak uygulanabilir olması muhtemeldir. Ayrıca, floresan etiketli nöronlar 8,9 morfolojisi vurgulamak işaretçileri veya göstergeleri ile kombine edilebilir olanlar nöronlar 19, 20 nörofizyolojik faaliyetlerini yansıtmaktadır. Bu ileri uygulamalar bireysel nöronların deneyim-bağımlı moleküler değişikliklerin daha kapsamlı bir görünüm sağlamak ve normal sırasında nöronların yer almak veya yapısal ve işlevsel değişiklikler bu moleküler değişikliklerin ilgili olabilir patolojik deneyimler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar yardımı filme yönelik cerrahi filme ekipmanları, D. Kwon L. Belluscio teşekkür etmek istiyorum, video için K. Liu tüm arka plan müziği için yardım düzenleme ve K. MacLeod. KW İntramural Araştırma Programları NIMH Bölümü ve Genler, Biliş ve Psikoz Programı cömert desteğini onaylar. Bu çalışma NIMH İntramural Araştırma Programı (VC, YY, SMKW) ve intramural Klinik ve Biyolojik Araştırma Programı NIAAA Bölümü (VC, RMC, DML) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FV1000 multi-photon laser scanning microscope Olympus FV1000MPE Imaging
Dissection microscope Omano 555V107 Surgery
Stereotaxis surgery stage for mice Harvard Apparatus 726335 Surgery
20X or 25X water immersion objective Olympus XLPL25XWMP Imaging
Microscope stage with head-fixation frame Custom made N/A Imaging
Fine forceps Fine Science Tools 11251-20 Surgery
Dental drill burr Fine Science Tools 19007-05 Surgery
CCD camera QImaging QICAM 12-bit Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
  2. Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
  3. Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
  4. Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
  5. Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
  6. Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
  7. Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
  8. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).
  9. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  10. Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
  11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
  12. Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  14. Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
  15. Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
  16. Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
  17. Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  18. Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
  19. Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).

Tags

Nörobilim Sayı 71 Tıp Anatomi Nörobiyoloji Cerrahi Serebral korteks frontal korteks Stereotaksik Teknikleri Moleküler Görüntüleme Nöronal Plastisite Nörobilim, iki-foton mikroskopi deneyim-bağımlı Gen Ekspresyonu Arc-GFP Fare Kranial Pencere, immünohistokimya hayvan modeli
Kortikal Nöronlar <em>In Vivo</em> İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, V. Y., Ye, Y., Mastwal, S. S.,… More

Cao, V. Y., Ye, Y., Mastwal, S. S., Lovinger, D. M., Costa, R. M., Wang, K. H. In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (71), e50148, doi:10.3791/50148 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter