Summary
Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen. Ein
Abstract
Die Fähigkeit des Gehirns als Reaktion auf Erfahrungen zu ändern ist wichtig für gesunde Funktion des Gehirns, und Anomalien in diesem Prozess beitragen zu einer Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns 1,2. Zum besseren Verständnis der Mechanismen, durch die Schaltkreise des Gehirns reagieren auf eines Tieres Erfahrung erfordert die Fähigkeit, die Erfahrung angewiesen molekulare Veränderungen in einer bestimmten Gruppe von Neuronen zu überwachen, die über einen längeren Zeitraum, in dem lebenden Tier. Während die Erfahrung und die damit verbundenen neuronalen Aktivität ist bekannt, dass Veränderungen der Genexpression in Nervenzellen 1,2 auslösen, die meisten der Methoden, um solche Veränderungen zu erkennen erlauben nicht wiederholte Beobachtung der gleichen Neuronen über mehrere Tage oder keine ausreichende Auflösung zu beobachten einzelnen Neuronen 3 , 4. Hier beschreiben wir eine Methode, die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit einem genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter Erfahrungen abhängigen Veränderungen der Genexpression in einzelnen kortikalen Neuronen über die Strecke Laufe des Tages-to-day Erfahrung.
Einer der gut etablierten Erfahrung abhängigen Genen ist Activity-regulierten Zytoskelett assoziierten Protein (Arc) 5,6. Die Transkription von Arc wird schnell und stark von verstärkten neuronalen Aktivität 3 induziert wird, und dessen Proteinprodukt reguliert die Endozytose von Glutamatrezeptoren und langfristige synaptischen Plastizität 7. Die Expression von Arc wurde weithin als molekularer Marker neuronaler Schaltkreise in spezifischen Verhaltensweisen 3 beteiligten Karte verwendet. In den meisten dieser Studien wurde Arc-Expression durch in situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie in festen Gehirnschnitte detektiert. Obwohl diese Methoden ergab, dass die Expression von Arc auf eine Teilmenge von erregenden Neuronen nach Verhaltensstörungen Erfahrung, wie die zellulären Strukturen des Arc Ausdruck kann mit mehreren Episoden von wiederholten oder besondere Erfahrungen über Tage zu ändern wurde nicht untersucht wurde lokalisiert.
ntent "> In vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie ein guter Weg, um Erfahrungen-abhängige zelluläre Veränderungen im lebenden Gehirn 8,9 untersuchen bietet. Um die Prüfung der Arc Ausdruck in Live-Neuronen durch Zwei-Photonen-Mikroskopie zu ermöglichen, haben wir vorher erzeugte einen Dominoeffekt in Maus, in der ein GFP-Reporter steht unter der Kontrolle des endogenen Promotor Arc 10 platziert. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Vorbereitungen und bildgebenden Verfahren zum Verfolgen erfahrungsabhängiger Arc-GFP-Expression in neuronalen Mustern Ensembles in dem lebenden Tier. Bei diesem Verfahren , chronische kranialen Fenster wurden zuerst in Arc-GFP-Mäuse in den kortikalen Regionen von Interesse implantiert. Die Tiere wurden dann wiederholt durch Zwei-Photonen-Mikroskopie nach gewünschten Verhaltensänderungen Paradigmen im Laufe von mehreren Tagen abgebildet. Diese Methode kann allgemein für Tiere, die anderen fluoreszierenden Reporter Erfahrung-abhängigen molekularen Veränderungen 4.Protocol
Die experimentellen Verfahren beschrieben wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care und Use Committee genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
Ein. Präoperative Vorbereitung
- Reinigen Sie alle Werkzeuge in einem heißen Perle Sterilisator vor aseptische Chirurgie, reinigen die Operation vor Ort mit 70% Ethanol, und legte sauber Packpapier und Klebeband. Trage sterile Handschuhe. Betäuben das Tier mit frisch zubereiteten 1,2% Avertin Lösung bei 0,02 ml / g, intraperitoneal gegeben. Alternativ mit Isofluran-Gas betäubt durch einen Nasenkonus, 5% für die Induktion, 1,5% für die Wartung, mit einem passiven scavenger Schaltung. Überprüfen Sie die Anästhesie Ebene mit Schwanz oder Zehen drückt in voller Sedierung zu gewährleisten.
- Decken die Augen des Tieres mit steriler Augensalbe, und spritzen frisch zubereitet Dexamethason (0,2 mg / kg) und Carprofen (5 mg / kg) subcutaneously zu Gehirn Schwellung und Entzündung 11 zu verhindern. Rasieren die Haare über den Schädel zwischen den Ohren, und sterilisieren Sie die Haut mit betadine Peeling und drei alternierende Tupfer von 70% Ethanol.
- Montieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Chirurgie Bühne mit earbars mit einem Wasserkreislauf Heizkissen unter dem animal set bei 37 ° C. Überprüfen Sie regelmäßig das Tier Anästhesie Ebenen und Ergänzung des ursprünglichen Anästhesie Dosis nach Bedarf.
- Inject 200 ul von 0,5% Carbostesin unter der Kopfhaut, um den Bereich zu betäuben. Inzision der Haut und entfernen Sie den Hautlappen über den Schädel. Entfernen Sie die Knochenhaut und trocknen Sie den Bereich mit einem sauberen Wattestäbchen.
2. Chronische Cranial Fenster Chirurgie
- Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit einem 0,5 mm-Fräse vorsichtig skizzieren 3-5 mm Durchmesser-Kreis über das Gehirn region of interest. Periodisch benetzen Bohrstelle mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung und klar weg Knochenmehl mit sauberen Wattestäbchen. Wenn die Knochen blutet, verwenden gelfoam mit steriler Kochsalzlösung eingeweicht, um die Blutung auslöschen und warten, bis es zu stoppen.
- Wenn der letzte Knochen Schicht erreicht ist, heben und entfernen Sie die Knochen Insel mit spitzen Pinzette. Dura Anhänge auf der untersten Platte des Knochens können auftreten, wenn das Fenster durchquert einen Knochen Nahtmaterial werden. Diese sollten vorsichtig entfernt werden, da der Knochendeckel abgehoben ist.
- Befeuchtetem Gel-Schaum vorsichtig über den freiliegenden dura seiner Oberfläche zu reinigen und warten jeden Dural Blutung zu stoppen Critical Schritt:. Nicht fortfahren, bis alle dural Blutung aufgehört hat. Blut, das im Inneren des kranialen Fenster eingeklemmt wird meist führt zu einem undurchsichtigen Fenster.
- Wenn die Region von Interesse unter einer Stelle, wo die Dura ist besonders dick, Entfernen der Dura oben kann es erforderlich sein. Wenn dies der Fall ist, sanft zu trennen die Dura von der Pia unten mit sehr feinen Pinzetten, einen kleinen Einschnitt in der angehobenen Dura mit einem anderen Paar von feinen Pinzette, dann erfassen die Schnittkanten und sanftspaltete die Dura. Die Dura ist dünn, aber stark, so vorsichtig sein, nicht das Gehirn mit den intakten Rändern der Dura schneiden.
- Spülen Sie den Bereich mit einem sterilen ACSF oder sterile Kochsalzlösung.
- Ziehen einer sterilen Deckgläschen (3-5 mm) über die Dura oder pia Critical Schritt:. Wenn die umgebenden Schädel Kurven deutlich, verwenden Kwiksil 12 Klebstoff in Räumen, wo die Dura oder pia keinen engen Kontakt mit dem Deckglas in Regionen füllen würde Das wird nicht abgebildet werden.
- Verwenden Cyanoacrylat Gels, um das Elastomer und Kleber die Kanten des Deckglases bestimmt. Decken Sie die gesamte freiliegende Schädel mit Cyanacrylat Gel oder einer krazyglue und zahnmedizinischen Zement-Mischung Critical Schritt:. Lassen Sie keine Cyanacrylat-Gel, das Gehirn zu berühren.
- Einbetten eine maßgeschneiderte Metall-Fixierung bar am gegenüberliegenden Ende des Schädels.
- Zurückzukehren das Tier in einen warmen Wiedergewinnungskammer, nach einer Injektion von intraperitonial Ketoprofen, 5 mg / kg, for Schmerzen. Fahren Sie mit der Analgetikum für zwei Tage nach der Operation.
- Nach zwei Wochen post-operative Erholung, betäuben das Tier mit Isofluran (5% für Induktion, 1,5% für die Wartung), montieren Sie ihn in einem maßgeschneiderten Mikroskoptisch mit einem Kopf-Befestigungsrahmen, und überprüfen Sie die kranialen Fenster für optische Klarheit unter Beleuchtung mit blauem Licht. Hirnoberfläche Blutgefäß Klarheit ist höchst bezeichnend von kranialen Fensters Qualität. Wenn die Kanten scharf Blutgefäß definiert sind, ist das Fenster wahrscheinlich verwendbar. Die Zwei-Wochen post-operative Recovery-Zeit wird empfohlen, genügend Zeit für das Tier von der Operation erholen können. Cranial Fenstern in der Regel klar, und während dieser Zeit zu verbessern, und bleiben optisch transparent für weitere Wochen bis Monate, bis das Nachwachsen des Schädels oder Verdickung der Dura verschlechtert Fenster Qualität.
3. Behavioral-Protokolls und Laser Scanning Zwei-Photonen-Mikroskopie
- Tiere mit klaren cranial Fenstern wird es einer umgebenden Reiz ausgesetzt werden oder Gegenstand einer Verhaltenstraining Sitzung, und dann nachher zum Zeitpunkt der maximalen Arc-GFP-Expression abgebildet. Vor Beginn eines Verhaltensmodells Protokoll, sollte das Tier in einer konsistenten Heimkäfig Umwelt zu Tag zu Tag Variation Basislinie Arc-GFP Expressionsniveaus minimieren gehalten werden.
- Beginnen Verhaltenstraining oder Umweltreize Paradigmen, abhängig von der Hirnregion des Interesses. Beispielsweise können Tiere auf unterschiedliche visuelle Umgebungen über aufeinanderfolgende Tage ausgesetzt werden und abgebildet jeden Tag nach visueller Stimulation zu Stimulus-spezifische Antworten in der Sehrinde 10 zu identifizieren.
- Arc-GFP-Fluoreszenz in den Neuronen in der Regel ihren Höhepunkt erreicht Stufe zwei Stunden nach der Stimulation. Die experimentelle Zeitachse kann optimiert werden, um den Nachweis von Arc-GFP-Expression in Neuronen an ihrer Spitze Fluoreszenzwerte erleichtern.
- Nach einer Verhaltenstherapie Training oder environmental Stimulation abgeschlossen ist, betäuben das Tier mit Isofluran (5% für Induktion, 1,5% für die Wartung) und montieren das Tier in der maßgeschneiderten Mikroskoptisch mit Kopf-Fixierung Rahmen unter der Zwei-Photonen-Mikroskop.
- Der Kopf des Tieres Position mit dem Kopf-Fixierungsrahmenplatte, der direkt an der Bühne unter Verwendung des implantierten Metallstange am Schädel befestigt. Isofluran und Sauerstoff kontinuierlich an der Maus durch ein Nasenkonus zugeführt. Die Körpertemperatur wird beibehalten mit einem Heizkissen.
- Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop Detektoren von Umgebungslicht werden durch die Durchführung der Zwei-Photonen-Laser-Scanning in einem dunklen Raum geschützt. Verwenden Sie ein 20x oder 25x (1,05 numerische Apertur) Wasser Immersionslinse für die Bildgebung. Zunächst unter Auflicht-Fluoreszenz Beleuchtung, zu erwerben ein Bild der Oberfläche Blutgefäß Muster über das Gehirn interessierenden Region mit einer CCD-Kamera für zukünftige Bildausrichtung.
- Starten Zwei-Photonen-Laser-Scanning-, ein 3-D-Bild-Stapels erfassen. Ein Olympus FV1000MPE Multi-Photonen-Mikroskop wird in unserem Setup verwendet. Die Anregungswellenlänge des Zwei-Photonen-Laser bei 920 nm festgelegt, und die Leistung des Lasers aus dem Ziel emittiert wird bei ungefähr 50 mW eingestellt. Emittierten Fluoreszenz wird gleichzeitig in grünen und roten Kanälen (dichroitischen Spiegel bei 570 nm, bei Sperrfiltern 495-540 nm und 570-625 nm) unter Verwendung einer externen zweikanaligen photomutiplier Detektionssystem nahe der Probe platziert detektiert. Arc-GFP-Fluoreszenz erscheint nur in den grünen Kanal, während Gewebe Autofluoreszenz erscheint in beiden Kanälen 13, 14.
- Typische Bildstapeln haben Abmessungen von ca. 320x320x100 um (Breite x Länge x Tiefe), eine horizontale Auflösung von 0,5 &mgr; m / Pixel, und eine vertikale Auflösung von 3 pm / Pixel.
- Nach dem Erwerb der Bildstapel, wieder das Tier in das Haus Käfig. Bitte nicht stören das Tier bis zur nächsten Verhaltens-und Imaging-Sitzung. Wiederholen Sie das Verhalten und die bildgebenden Verfahren über Tage als wünschenswerted.. Verwenden Sie die zuvor erworbenen Hirnoberfläche Blutgefäß Bild zu orientieren zurück zu der gleichen bildgebenden Lage.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Erfahrungen abhängigen molekularen Veränderungen in den einzelnen kortikalen Neuronen in lebenden Tieren zu verfolgen. Eine chronische kranialen Fenster als einem kortikalen Bereich von Interesse in einer Maus, die ein fluoreszierendes Reporterprotein der Genexpression erstellt. Zweiphotonenmikroskopie können dann mit verschiedenen Verhaltensparadigmen gekoppelt werden, um verhaltensrelevante induzierte molekulare Veränderungen einzelner Neuronen beobachten und zu verfolgen solche Änderungen in den gleichen Gruppen von Neuronen über mehrere Tage (Abb. 1).
In Arc-GFP-Mäuse, können Erfahrungen abhängigen Veränderungen in Arc Genexpression zuverlässig in einzelnen kortikalen Neuronen für mehrere Tage mit diesem Protokoll abgebildet werden. Transgene Arc-GFP Knock-in-Maus drückt eine destabilisiert grün fluoreszierendes Protein (d2EGFP, Protein Halbwertszeit ca. zwei Stunden) unter der Kontrolle des endogenen Promotors des Immediate-Early-Gen Arc (Abbildung 2).
nhalt "> Historische Protokolle beschreiben chronischen kranialen Fenstern haben kritischen Schritte in leitenden erfolgreiche kranialen Fenster Operationen 11 skizziert. Dieses Protokoll stellt zusätzliche Führung beim Entfernen der Dura, wenn nötig, das erhöht die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens klare optische Fenster, wenn solche Fenster über Schädelnähten befinden (siehe Schritt 2,4).Nach der Genesung von kranial Fenster Chirurgie, werden die Tiere in einem maßgeschneiderten Kopf-Befestigungsrahmen und Bühne montiert. Abbildung 3 zeigt die headbar und Kopf-Befestigungsrahmen in Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet. Wahrung einer durchgängigen Zwei-Photonen-Mikroskop Imaging Tischposition und Setup erleichtert Tag-zu-Tag Neuausrichtung der Bilder bei der Rückkehr zu einer zuvor abgebildeten Region des Gehirns, und erhöhen experimentellen Effizienz bei mehreren Tieren am gleichen Tag (Abbildung 4) abgebildet werden.
Während Verhaltenstraining oder Umweltreize, ist es ratsamzu Haus Tiere einzeln und in einem ökologisch konsequente Heimkäfig Lage, zu minimieren Tag-zu-Tag Schwankungen im Hintergrund Arc-GFP-Aktivierung Ebenen (Abbildung 1).
Ein kritischer Vorzeichen einer stabilen, klaren kranialen Fenster ist die scharfe Muster von Blutgefäßen unter Epi-Fluoreszenzbeleuchtung. Diese Blutgefäßmuster sollte nicht wesentlich ändern über mehrere Tage Bildgebung (Abbildung 5).
Abbildung 6 zeigt die Expressionsmuster von Arc-GFP in frontalen kortikalen Neuronen unter einer Baseline Heimkäfig Bedingung (A) und nach Durchführung eines neuen Motors Verhalten (B). Schicht II / III kortikalen Neuronen in der gleichen Region des Gehirns im gleichen Tier zuverlässig abgebildet werden, und die gleichen Neuronen Lage sein sollte, über mehrere Tage bildgebender identifiziert werden. Es ist typisch, um einen 3-D-Bild-Stack zu Probe Hunderte von Neuronen zu sammeln. Neuron Kanten sollten scharf und klar im gesamten Bild sTack. Gewebe Autofluoreszenz im roten Kanal auch einen Index des Fensters Klarheit. Wenn das abgebildete Region wird drastisch düsterer über Tage, wird der kraniale Fensterqualität wahrscheinlich verschlechtert. Ein typisches kranialen Fenster bleibt optisch klar für mindestens eine Woche. Nach mehreren Wochen bis Monaten wird das Nachwachsen des Schädels von den Rändern der Schädelbasis Fenster und Verdickung der Dura schließlich verhindern, dass weitere Imaging-Experimente.
Abbildung 1. Ein Schema skizziert die experimentellen Schritte. Während der Tiere Vorbereitungsphase werden kranialen Fensters Operationen am Arc-GFP Mäusen durchgeführt. Die Tiere werden etwa zwei Wochen nach der Operation in ihrem eigenen Käfig erholen. Die Klarheit der Schädelbasis Fenster wird dann geprüft, mit Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie. Wenn die Fenster bereit für Bildgebung sind, werden die Tiere einzeln in einer ruhigen, ökologisch konsequente untergebrachtHeimkäfig Umwelt, woher der Experimental Timeline Phase kann beginnen. Der Verhaltensforscher Stimulationsprotokoll und die Bildgebung Intervall kann zugeschnitten auf Arc-GFP auf ihrem Höhepunkt Fluoreszenz, die in der Regel tritt zwei Stunden nach Aktivierung zu erkennen. Nachdem die Stimulierung Verhaltensstörungen abgeschlossen ist, ist das Tier narkotisiert und der kortikalen Bereich von Interesse wird durch das Fenster unter Verwendung kranialen Zweiphotonenmikroskopie abgebildet. Das Tier wird dann dem heimischen Käfig zurückgegeben. Die Verhaltens-und Imaging-Sitzungen können über Tage wie gewünscht wiederholt werden.
Abbildung 2. Ein Diagramm, das die Konstruktion der Arc-GFP Knock-in-Maus Zeile, in der ein Gen, das grün fluoreszierende Protein destabilisiert ersetzt den kodierenden Teil des unmittelbar frühen Gens Arc. In diesem Stamm von Maus ist GFP-Expression unter der Kontrolle des endogenen Promotor Arc. Dieses Diagramm neu gezeichnet wird basierend aufdie Beschreibung in Referenz 10.
Abbildung 3. Schaltplan und Abmessungen des Kopfes-Fixierung Setup für Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet. Der feste Hälfte des headbar ist an der Rückseite des Schädels (Abschnitt 2.8) verklebt, und das Ende mit dem Schraubenloch dient der narkotisierten Tierkopfes an dem Rahmen zu befestigen. Am Kopf Fixierungsrahmenplatte besteht aus einer dünnen Metallplatte atop zwei Pole mit Schrauben befestigt.
Abbildung 4. Beispiel einer Laser-Scanning Zweiphotonenmikroskop Setup für Arc-GFP-Mäuse Bildgebung. Beachten Sie die 25x Wasser Immersionslinse, Heizkissen und benutzerdefinierte Mikroskoptisch mit einem Kopf-Befestigungsrahmen. Die narkotisierten Arc-GFP-Maus gezeigt, hier ist bereit für in vivo-Bildgebung.
Abbildung 5. Aufnahmen Hirnoberfläche Blutgefäßen in einem chronischen kranialen Fenster über mehrere Tage, welche die Klarheit und Stabilität des Blutgefäßes Mustern im Zeitverlauf. Hirnoberfläche wurde mit blauem Licht beleuchtet wird, und die Bilder wurden durch ein 25x Wasser Immersionslinse von einer CCD-Kamera auf dem Mikroskop montiert entnommen.
Abbildung 6. In vivo Zwei-Photonen-Bilder von Arc-GFP-Expressionsmuster in frontalen kortikalen Neuronen der Maus nach zwei unterschiedlichen Verhaltens Erfahrungen. (A) Die Maus blieb in seinem eigenen Käfig vor der Bildgebung am ersten Tag. (B) Die Maus durchgeführt einen neuen Motor Verhalten vor Bildgebung am zweiten Tag. Fluorescent Bilder von der gleichen kortikalen Bereich wurden gleichzeitig in grün und rot Kanäle erworben. GFP-Fluoreszenz erschien nur im grünen Kanal, während Gewebeautofluoreszenz erschienen in beiden Kanälen. Detection Parameter wurden eingestellt, so dass Gewebe Autofluoreszenz Ebenen sowohl in rot und grün Kanälen hatten die gleichen Werte, und diese Parameter wurden während Experimenten erhalten. Die rote Kanalsignal wurde dann aus dem grünen Kanal Signal breitbandig Gewebeautofluoreszenz während Offline-Analyse zu entfernen subtrahiert. Die daraus resultierenden grün fluoreszierenden Signale von einer 18 um dicken 3-D Bildstapel wurden von maximaler Intensität auf die horizontale Ebene projiziert, um eine Top-Down-Sicht der zellulären Muster der Arc-GFP-Expression liefern. Maßstab, 30 um.
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Discussion
Die in-vivo-Bildgebung hier beschriebene Methode ermöglicht die wiederholte Untersuchung des Arc Veränderungen der Genexpression in den gleichen Gruppen von Neuronen über mehrere Tage im lebenden Tier. Es ist eine effiziente und vielseitige Methode, um Informationen über neuronale Plastizität verwandte molekulare Dynamik in einzelnen Neuronen in Reaktion auf verschiedene Verhaltensweisen Erfahrungen zu erhalten. Standard histochemische Verfahren wie in situ Hybridisierung und Immunfärbung kann einzellige Auflösung 3 erzielen, aber es fehlt die Fähigkeit, Veränderungen der Genexpression in den gleichen Neuronen über mehrere Tage verfolgen. Biolumineszenz, Magnetresonanz oder nuklearen bildgebenden Verfahren können Veränderungen der Genexpression im selben Tier zu verfolgen durch geeignete Reporter 15, aber es fehlt die räumliche Auflösung, um die Expression in einzelnen Neuronen unterscheiden. Als solche können keine anderen existierenden Methoden um Veränderungen der Genexpression zu messen entsprechen sowohl die räumliche Auflösung und die zeitliche covschnittlichen des bildgebenden Verfahrens beschrieben.
Ein entscheidender Schritt in diesem Verfahren ist die kranialen Fensters Chirurgie. Es sollte mit besonderer Sorgfalt durchgeführt werden, um Verletzungen des Gehirns oder Verlassen Blut unter dem Deckglas, die Entzündungen verursachen und verringern die Klarheit der Schädelbasis Fenstern zu vermeiden. Für gut durchgeführten kranialen Operationen, bleibt das Fenster für mehrere Wochen klar, bis Verdickung der Dura oder Nachwachsen des Schädels von den Rändern des Fensters verhindern, dass weitere Bildgebung. Die Dura bei Bedarf entfernt werden, wie es für chronische optischen Imaging-Experimente an Ratten und Affen 16,17 getan worden, um die optische Klarheit der Schädelbasis Fenstern erhöhen.
Eine Einschränkung für die Zwei-Photonen-Mikroskopie Technik in diesem Protokoll ist der Bildtiefe. Die maximale Tiefe, bei der Bildgebung hochwertige Bilder erhalten werden können, werden auf der kranialen Fenster Klarheit des Mikroskops Einrichtung und der Helligkeit des fluoresz hängen ent Reportern. Für Arc-GFP Mäusen, wir in der Regel Bild bis zu 300 um unterhalb der Pia-Oberfläche. Um Veränderungen der Genexpression in tiefen Hirnregionen zu untersuchen, kann die Fluoreszenz Mikroendoskopie angewendet, um die Tiefenbegrenzung in herkömmlichen Zwei-Photonen-Mikroskopie 18 überwunden werden.
Potenzielle Störfaktoren für die Genexpression ändert sich mit diesem in vivo bildgebenden Verfahrens bestimmt umfassen alle Nachwirkungen von Schädeloperation oder Anästhesie, das mit Verhaltensleistung oder die Induktion von Arc-GFP stören könnten. Es ist wichtig, das gesamte Ausmaß der Arc-GFP Aktivierung in Reaktion auf spezifische Erfahrungen in festen Hirnschnitten zuerst überprüfen, und vergleichen Sie diese in dem Maße durch wiederholte Bildgebung mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet. Die post-operative Erholungsphase und die wiederholten Imaging Abständen kann dann eingestellt werden, um die möglichen Nebenwirkungen der Operation und Narkose auf Arc-GFP-Aktivierung zu minimieren.
_CONTENT "> Die bildgebenden hier beschriebene Verfahren dürfte allgemein anwendbar auf transgene Mäuse mit fluoreszierenden Reporter für andere Erfahrung 4-regulierte Gene. Ferner kann es mit einem fluoreszierenden Marker, die die Morphologie von markierten Neuronen 8,9 zu markieren, oder Indikatoren kombiniert werden das spiegeln die neurophysiologischen Aktivitäten in diesen Neuronen 19, 20. Diese weiteren Anwendungen kann eine umfassendere Sicht der Erfahrung-abhängigen molekularen Veränderungen in einzelnen Neuronen liefern und beziehen diese molekularen Veränderungen der strukturellen und funktionellen Veränderungen, die stattfinden in Neuronen bei normalen oder pathologischen Erfahrungen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei L. Belluscio für Chirurgie Filmtechnik, D. Kwon danke für die Dreharbeiten Unterstützung, Bearbeitung K. Liu für Video-Unterstützung und K. MacLeod für alle Hintergrundmusik. KW erkennt die großzügige Unterstützung der NIMH Division of Intramural Forschungsprogramme und die Gene, Cognition and Psychosis Program. Diese Arbeit wurde von der NIMH Intramural Research Program (VC, YY, SMKW) und der NIAAA Division of Intramural Klinische und Biologische Research Program (VC, RMC, DML) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
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