Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50150
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Institute of Genetics, University of Mainz, 2Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne

Summary

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS) van

Abstract

In dit artikel beschrijven we hoe u individueel neuronen in de embryonale CZS van Drosophila melanogaster door juxtacellular injectie van de lipofiele fluorescente membraan merker Dil labelen. Deze methode maakt het mogelijk de visualisatie van de neuronale celmorfologie in groot detail. Het is mogelijk om een ​​cel label in het CZS: cellichamen van neuronen doelwit zichtbaar gemaakt onder DIC optiek of door expressie van een fluorescente genetische merker zoals GFP. Na etikettering, de Dil worden omgezet in een permanente bruine vlek door fotoconversie tot visualisatie van celmorfologie toe met doorvallend licht en DIC optiek. Als alternatief kan de DiI gemerkte cellen direct worden waargenomen met confocale microscopie, waardoor genetisch geïntroduceerd fluorescerende reporter eiwitten worden colocalised. De techniek kan worden gebruikt in een dier, ongeacht het genotype, waardoor het mogelijk mutant fenotype analyseren cel resolutie.

Introduction

Kennis van neuronale morfologie op het niveau van individuele cellen is een belangrijke voorwaarde voor het begrijpen van neuronale connectiviteit en CZS-functie. Zo vanaf de vroegste dagen van de neurowetenschappen, hebben onderzoekers getracht enkele cel etikettering technieken (zie 7 voor een historische behandeling van deze kwestie) te ontwikkelen. Klassieke methoden, zoals Golgi kleuring geven uitstekende resolutie van neuronale morfologie maar zijn niet geschikt als men streeft naar een bepaald type neuron label in het gericht, zoals kleuring optreedt op een willekeurige manier. De ontwikkeling van methoden voor het beitsen van enkele cellen door intracellulaire of juxtacellular injectie van kleurstoffen uit een micro-elektrode in op de eis van specifieke etikettering.

De toepassing van enkelvoudige neuron kleurstof injectie Drosophila een belangrijke uitdaging, vanwege de kleine afmetingen van zowel het organisme en de neuronen. Niettemin enkel neuron kleuring van embryonale Drosophila 15. Terwijl de methode is bij uitstek nuttig en heeft een aantal belangrijke inzichten in de mechanismen voor neuronale ontwikkeling in Drosophila in de afgelopen 20-30 jaar (bv 2, 10), hebben veel werknemers teruggeschrokken van het, grotendeels als gevolg van de technische eisen.

De beschikbaarheid in meer recente jaren van genetische technieken voor neuronale etikettering in Drosophila heeft ook bijgedragen aan de impopulariteit van enkel neuron kleurstof injectie. GAL4-gerichte expressie van membraan gerichte GFP constructen kunnen uitstekende resolutie van neurale morfologie 1, 20. Deze methode heeft bepaalde beperkingen: de vaak onvermijdelijk expressie van GFP in meerdere cellen kan de structuur van individuele neuronen verhullen en een GAL4 rijders niet beschikbaar voor expressie in een bepaald neuron plaats. De MARCM (Mosaic Analyse met een Repressible Cell Marker) methode 8 kan coderen van in wezen elke neuron op individueel celniveau, maar niet met succes worden gebruikt in de embryo en vroege larve vanwege de lage omzet van de GAL80 eiwit.

Gezien deze beperkingen van genetische kenmerken wij dat enkel neuron kleurstof injectie in de Drosophila embryo een waardevol techniek en verdient bredere toepassing. Om dit doel te bevorderen, wij hier een gedetailleerde beschrijving van de werkwijze. Een illustratie van het vermogen geleverd door onze recente houden met de morfologie van de benodigde interneuronen in abdominale neuromeres de late Drosophila embryo 14. Deze studie, die zowel de morfologische variabiliteit van individuele neuronale celtypen en de beginselen van neuromere organisatie in het CZS van de embryo geopenbaard, zou niet mogelijk zijn geweest met andere momenteel beschikbare labelingsmethode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

We hebben gebruik gemaakt van twee enigszins verschillende varianten van de enkel neuron etikettering methode in onze laboratoria. De verschillen hebben betrekking op de embryo's worden verzameld, dechorionisation, devitellinisation en embryo fileren stappen. Figuur 1 geeft een overzicht van de gemeenschappelijke en divergerende stappen van de varianten.

1. Voorbereiding van micro-naalden voor Embryo Dissection en Micropipetten Dye Injectie

  1. Glas naalden voor embryo dissectie zijn afkomstig uit glazen capillairen (1 mm diameter en 0,1 mm wanddikte) met een Sutter trekker (Science Instruments) of vergelijkbare apparatuur. Als alternatief wordt een elektrolytisch scherp 0,15 mm wolfraamdraad gemonteerd in een naaldhouder voor dissecties. (Instructies voor het elektrolytisch slijpen zijn in 9).
  2. Dye Injectie micropipetten zijn afkomstig uit dunwandige glazen capillairen met innerlijke filamenten (Science Products; GB 100 TF 8P) met een Sutter trekker (ScienceInstruments) of vergelijkbare apparatuur. De micropipet tip moet scherp, met een geleidelijke, uniforme versmalling van de schacht tot doorgang helpen door de weefsels van het embryo. De gewenste micropipet is de "High Resistance micro-elektrode, Sharp en Long" variëteit, zoals beschreven op p.20 van de Sutter Instrument Pipetteer Kookboek handleiding ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Over het algemeen worden micropipetten kort getrokken voordat injecties worden uitgevoerd om ervoor te zorgen hun tips blijven scherp en schoon.

2. Collectie, Montage en Dissectie van embryo's

  1. Embryo Collection. Wij hebben met succes gebruik hebben gemaakt van het neuron injectie hier beschreven methode in embryo's van stadium 12 tot 17 maart. Embryo's geleidelijk ontwikkelen van een cuticula gedurende de eerste fase 17 en steeds moeilijker te ontleden. Twee alternatieve benaderingen zijn beschikbaar om em te verkrijgenbryos op een bepaald ontwikkelingsstadium.
    1. Laat vliegen om eitjes 's nachts op appelsap-agar platen gecoat met gist pasta leggen. Stel de temperatuur van het ei collectie aan het geplande tijdstip van de injectie de volgende dag aan te passen. Verzamel alle eieren de volgende dag en selecteer embryo's in de gewenste fase met behulp van morfologische criteria 3.
    2. Laat vliegen om op agarplaten te leggen als hierboven, maar uit te wisselen de agar plaat met een verse elke 1,5 uur bij 25 ° C. Incubeer elke plaat gedurende een bepaalde periode, tot embryo's hebben bereikt de ontwikkelingsfase vereist.
    1. Chemische Dechorionation. Een metalen spatel embryo schraap de agar en overbrengen in een glazen vat (bijv. petrischaaltje of holte blok) met ongeveer 10 ml Ringer Drosophila of fosfaat zoutoplossing (PBS) gebufferd. Voeg een paar druppels geconcentreerd bleekmiddel en schud een paar minuten op eenroterende platform tot het chorion poelen van de embryo's. Was embryo's in een aantal wijzigingen van Ringer / PBS totdat er geen geur van de resterende bleekmiddel. Tijdens deze wasbeurten op dat de embryo's in contact komen met het vloeistofoppervlak. Anders zullen ze drijven en moeilijk onder te dompelen voor later manipulatie. Als alternatief kan chemische dechorionation worden uitgevoerd volgens de techniek beschreven door basket 4.
    2. Mechanische dechorionation (zie figuur 2, stappen 1-4). Transfer embryo's uit de agar plaat aan een dia bedekt met dubbelzijdig plakband. Agar vermijden dat de embryo's zou verstoren hun hechting aan de tape. Toestaan ​​embryo drogen gedurende 5 tot 10 minuten totdat het chorion wordt een beetje broos. (Tijdens het wachten, de vacht van de dekglaasje die nodig is voor later devitellinisation met lijm - zie 2.3b). Zachtjes aanraken elk embryo met een naald. De chorion zal opengespleten en het embryo zal houden aan de needle. Transfer embryo onmiddellijk een agar blok verdamping tegen en lijn ongeveer 10 daarvan in een rij, met de ventrale zijde naar boven.

Devitellinisation en fileren worden handmatig gedaan met behulp van de beschreven methoden in 2.3A en 2.3B.

    1. Breng een enkele dechorionated embryo van de juiste ontwikkelingsstadium van de schotel van de Ringer oplossing voor verschillende druppels Ringer in een siliconen dam op een voorbereide microscoopglaasje. (A 3 cm vierkant dam door deze te smeren een dunne laag siliconenrubber op een microscoopglaasje, voeg een daling van 0,01% poly-L-lysine oplossing voor het midden van de dam. Laat de silicone uitharden gedurende 24 uur.) Breng de embryo met een glazen Pasteur pipet, zodat de embryo blijft onder het oppervlak van de Ringer tijdens de overdracht.
      Brace het achterste uiteinde van de embryo met een paar fijne pincetten, onder matig SqueezIng het embryo met een paar fijne iridectomie schaar, ongeveer een kwart van de weg terug van zijn voorste uiteinde. Niet dwars door het embryo. Het doel is om gewoon kraken openen de vitelline membraan met minimale schade aan het embryo. Met de tang nog in positie, gebruik dan een wolfraam naald om het embryo te vergemakkelijken uit de geopende membraan en positie ventrale zijde naar beneden op de dia. Het embryo moet vasthouden aan de poly-lysine vacht.
      Fillet het embryo met een scherp wolfraam naald. Zachtjes perforeren, dan scheurt het lichaam muur langs de dorsale middellijn. Met behulp van de naald, duwt u op het lichaam muur, zodat het plakt aan de dia. Om schade aan de lichaamswand voorkomen duw de lichaamswand de darm geplaatst tussen het en de naald. Maak dan gebruik van de naald om door de darm scheuren op zijn voorste en achterste uiteinden en het til. Indien gewenst kunnen extra embryo's worden overgedragen aan dezelfde dia, devitellinised en gefileerd, zorg ervoor dat u andere embryo's beschadigen al opde dia.
    2. Coat een 24 x 60 mm dekglaasje met heptaan lijm (zie tabel 1) door een druppeltje lijm in het midden van de schuif en verspreiden met een 18 x 18 mm dekglaasje een zeer dunne film. Plaats het dekglaasje op een microscoopglaasje en een frame van een klevende tape rond de randen. Snijd overtollige agar uit het blok die de rij van 10 embryo's, zachtjes aanraken van de embryo's met het dekglaasje heptaan lijm dekglaasje aan. Ze moeten nu voldoen aan de dekglaasje met hun ventrale zijde naar beneden gericht. Voeg een royale hoeveelheid PBS om de embryo's te dekken (zie figuur 2, stappen 4-6).
      Dringen de vitelline membraan met een glas of wolfraam naald op de rugzijde van elke embryo nabij zijn achterste uiteinde. Scheur het membraan langs de dorsale middellijn en sleep het embryo uit het membraan. Richt de embryo ventrale zijde naar beneden elders op het heptaan lijm ondergrond en filet met behulp van dezelfde methode zoals beschreven in 2.3A) (zieFiguur 2 stappen 7-8). Sinds enkele embryo's worden gefileerd op dezelfde dia, is het nuttig om ofwel zeer nauwkeurig te zijn met hun geaardheid of een tekening van hun oriëntatie te maken op de dia.
  2. Na fileren, embryo's licht worden vastgesteld voor 10-15 min in 7,4% formaldehyde in PBS, gevolgd door 4 wasbeurten in PBS. Uiterste zorg worden gezorgd dat het embryo in contact brengen met het oppervlak van de oplossing tijdens dit proces de oppervlaktespanningskrachten de embryo vernietigen. Deze pre-fixatie stap is niet strikt noodzakelijk, maar is nuttig om samentrekking van de spieren te voorkomen lichaamswand in late embryo's en de stabilisering van embryonale weefsels op jonge stadia. Houd in gedachten dat fixatie maakt de weefsels van het embryo meer ondoorzichtig en dus enigszins compromissen beeldkwaliteit onder DIC observatie.

3. Het vullen van de Injectie Micropipetten

Half vullen een 0,5 ml Eppendorf microfugebuisje meteen 0,1% oplossing van de kleurstof DiI carbocynanine (Molecular Probes, Eugene, OR) in 100% ethanol (zeker 'droog' absolute EtOH gebruiken DiI neerslaan te voorkomen). Een kleine opening in het deksel van de buis en plaats het stompe einde van de micropipet door het gat in het deksel. Laat de DiI opstijgen het filament ten minste 5 minuten. (Bedek het gat in het deksel wanneer niet vullen van een micropipet verdamping van ethanol voorkomen).

Materiaal voor neuron kleurstof injectie (figuur 3).

Microscoop. Een vaste fase microscoop moet worden gebruikt voor neuron kleurstof injectie de verticale beweging van het embryo te vermijden tijdens het scherpstellen. Een dergelijke beweging zou verdringen de pipet na het in contact komen met de embryo. We hebben zowel de Zeiss Axioskop FS en de Olympus AX50/BX50 vaste fase modellen zijn geschikt voor dit doel. De microscoop moet worden uitgerust met doorvallend licht DIC optiek voor visualisatie van neurons voor kleuring. De microscoop moet ook rechtop dan een omgekeerde model. Met een rechte microscoop, de punt van de micropipet aan dezelfde zijde van het embryo als die doel, dat met een omgekeerde microscoop beide aan weerszijden van het embryo. Deze laatste regeling afbreuk doet aan de kwaliteit van de DIC optiek. De microscoop moeten worden opgezet voor fluorescentie microscopie, met een geschikt filter set voor Dil observatie. Omdat Dil heeft een vergelijkbaar breed spectrum met excitatie en emissie maxima bij 549 en 565 nm veel filtersets in dit bereik zal werken, bijvoorbeeld die voor Alexa 568, Cy3, Rhodamine, Texas Rood of TRITC. Hoewel het handig om een ​​elektronisch gestuurde sluiter passen in het pad van de fluorescentie lichtbron, de werking van de sluiter kunnen zonder direct contact met de microscoop ook daadwerkelijk een label op een opstelling die alleen is uitgerust met een handgeschakelde sluiter. Ten slotte is een hoge vergroting, hoge numerieke aperture water immersie objectief noodzakelijk is voor observatie tijdens de injectie. Deze doelstelling moet worden ontworpen voor gebruik zonder een dekglaasje aan. We hebben met succes gebruikt de Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W, en Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 W doelstellingen.

Een micromanipulator moet plaatsen en de micropipet bewegen tijdens neuron kleurstof injectie. We hebben zowel de Leica micromanipulator en een podium gemonteerde Narashige 3-assige hydraulische micromanipulator.

Een intracellulaire DC versterker met de mogelijkheid voor stroominjectie, vereist voor iontoforetische injectie van DiI van de micropipet.

4. Procedure voor Dye Injectie

  1. Plaats de dia met de gemonteerde embryo (s) van het stadium van de injectie microscoop (Figuur 3). Gebruik een 10x objectief een embryo lokaliseren en te brengen naar het midden van het gezichtsveld.
  2. SwING het hoge vermogen doelstelling in de kijkpositie en breng het embryo in beeld. Zoek de cel van belang onder DIC optiek (of met fluorescentie als de doelcel expressie GFP) en breng deze in het midden van het gezichtsveld. Ervoor dat het velddiafragma van de microscoop alleen geopend aan de rand van het gezichtsveld, niet daarbuiten. Een smalle verlichtingsbundel zal helpen positionering van de micropipet (zie stap 4.4 hieronder). Breng de doelstelling totdat deze zo hoog mogelijk boven de embryo terwijl nog in contact met de Ringer / PBS oplossing.
  3. Plaats het bad elektrode voor de DC versterker in de PBS uit de buurt van het embryo en het pad van de micropipet.
  4. Plaats de injectie micropipet in de houder, die is gevuld met een 0,1 M LiCl oplossing. Bevestig de micropipet houder aan de micromanipulator. Met de micromanipulator grove controles brengen de micropipet in de ruimte tussen het uiteinde van het doel en de embryo.Zorg ervoor dat het ver boven het niveau van het embryo. Door de korte werkafstand van de high power doelstelling zal de micropipet moeten worden opgeslagen onder een kleine hoek om het in beeld te brengen (zie figuur 3). U moet de juiste hoek vast te stellen door trial and error in eerste instantie. Als de hoek te steil, zult u niet in staat zijn om de micropipet tip te krijgen in focus. Als het te ondiep, zal de micropipet as fout tegen de muur van de dam die de baden oplossing op zijn plaats.
  5. Plaats de punt van de micropipet in het gezichtsveld. Daartoe brengt de ogen op het niveau van het embryo en beweeg de micropipet heen en weer in de Y-as van de microscoop fase. Wanneer de punt het licht pad kruist, zie je de heldere reflectie van de lichtstralen van het. Beweeg de punt van de micropipet in de X-as zodat overschrijdingen de lichtbundel. Het zal gemakkelijker zijn om de micropipet vinden in de kleinegezichtsveld van de hoog vermogen objectieve als u op zoek bent naar de as in plaats van de tip. Kijk nu door de microscoop oculairs en geleidelijk verlagen van de high power doel tot de as van de micropipet komt in beeld. Verplaatsen van de micropipet heen en weer in de Y-as met de micromanipulator controles helpt vinden, zoals het geleidelijk komt in beeld. Wanneer de as scherp is, beweegt de micropipet in de X-as totdat de punt ligt in het midden van het gezichtsveld. In dit stadium micropipet tip moet ruim boven het niveau van de embryo. Schakel over naar fluorescentie verlichting en onderzoekt de tip om te controleren op lekkage van Dil. Stel de gelijkstroom om een ​​DiI kristallen uit die aan het uiteinde.
  6. Met de micromanipulator controles laat de micropipet in de Z-as. Breng het terug in focus met de microscoop scherpstelling. Geleidelijk verlagen micropipet terug naar de embryo op deze manier. In eerste instantie kunt u dit doen met de groveZ-as besturing van de micromanipulator en microscoop. Echter, als het embryo komt in beeld moet u overschakelen naar de fijne controle knoppen.
  7. Wanneer het oppervlak van het embryo is scherpgesteld, beweegt de punt van de micropipet naar de rand van het gezichtsveld in de richting van de micromanipulator. Richten op de cel worden geïnjecteerd en controleer dat ligt in het midden van het gezichtsveld. Richten op de micropipet tip en verplaatsen in de Y-as totdat het ligt op hetzelfde niveau in de Y-as de cel. Beweeg de punt van de micropipet naar de cel in de X-as u laten zakken in de Z-as. Bij gebruik van een Leica micromanipulator, zult u waarschijnlijk merken dat de microscoop stadium controleert u fijnere controle over beweging in de X-as is dan de micromanipulator controles, dus overschakelen naar het podium controle als de punt komt dicht bij de cel.
  8. Breng de micropipet tip in contact met de cel en een depressie op het oppervlak. Pass verschillende nanoamps van depolarizing huidige enkele seconden. Je zal een klein kristal van Dil vormen op de cel. Om te bevestigen dat de cel is gelabeld, kort de sluiter te openen voor het embryo verlichten met tl-licht, schakelt terug naar DIC. Als het lichaam van de cel van belang tekenen van etikettering, gelden stroom voor nog enkele seconden. Zet de huidige en snel trek de embryo van de micropipet in de X-as met de microscooptafel controle. En trek de micropipet uit de oplossing. Indien geen DiI labeling blijkt, kan de micropipet worden geblokkeerd en vervangen door een verse micropipet vereisen. Het kan zijn dat de punt van de micropipet heeft andere weefsels snagged op weg naar de cel van belang en dit weefsel wordt gekleurd in plaats van de cel. In dit geval probeert terugtrekking der micropipet licht en weer naar de cel. Het kan nodig zijn de micropipet vervangen en opnieuw proberen.
  1. Desgewenst kunnen meerdere cellen individueelbondgenoot gelabeld in hetzelfde embryo.
  2. Verwijder het merendeel van de oplossing in de injectiekamer, bevestig de embryo's door toevoeging van 7,4% formaldehyde / PBS gedurende 10 minuten gevolgd door 4 wassingen met PBS. Het embryo wordt vervolgens bij kamertemperatuur gedurende ten minste 4 uur (of overnacht bij 4 ° C) in een donkere, vochtige kamer (vermijden bleken of droge dalen) om de DiI diffunderen in neuronale processen. In dit stadium kan de DiI gemerkte cellen hetzij photoconverted ook niet rechtstreeks in de confocale microscoop.

5. Fotoconversie voor onderzoek met DIC Optics

Het principe van de fotoconversie-(foto-) oxidatie van DAB door het fluorescerende licht dat door de gekleurde cel tijdens de belichting met de geschikte golflengte. Dit betekent dat heldere cellen worden photoconverted in een kortere tijd in vergelijking met zwak gekleurde cellen. Als meerdere cellen gelabeld in een monster te veel verschillen met betrekking tot hun helderheid kan dit leiden tot difficulties in photoconverting allemaal in dezelfde kwaliteit (zie figuur 4C): in dit geval kan men hebben om te beslissen over een compromis tussen het verwaarlozen van de zwakkere cellen (met behulp van korte belichting) of accepteren dat het helderder cellen beginnen te zwellen (met behulp van langere belichting) . Als alle cellen te zwak gelabeld (dus nodig lange verlichting), kan achtergrond veroorzaakt door endogene peroxidase een probleem. Omdat DAB is giftig moet met zorg worden behandeld. Afval kan worden 'uitgeschakeld' met 7% bleken met chloor.

  1. Fotoconversie moet worden uitgevoerd voor elk embryo afzonderlijk. In gevallen waar slechts een embryo geïnjecteerd per slede de PBS-oplossing die de embryo vervangen door een DAB oplossing (3 mg DAB / ml Tris buffer), de dia op een fluorescentiemicroscoop en de gevulde cel bekeken met een 100x objectief. (Met een rechtopstaande microscoop doel dips in de DAB oplossing en moet worden gereinigd meerdere malen met water na de fotoconversie pROCEDURE is voltooid, dit kan worden voorkomen door een omgekeerde microscoop wordt gebruikt). Een Cy3 filter set en een 100W Hg lamp gebruikt en de cel blootgesteld aan de rode golflengten tot een bruin reactieproduct DAB duidelijk in de gelabelde neuron (zie periodiek door over te helder veld verlichting). De tijd die nodig is voor een optimale DAB kleuring is variabel, maar vereist de blootstelling aan het excitatielicht dan het stadium waarin de fluorescentie volledig is vervaagd. Na fotoconversie voltooid, was het preparaat meerdere malen met PBS. Vervang de PBS met een daling van 70% glycerol, schraap de siliconen met een scalpel, te vervangen door een ring van Vaseline en voeg een dekglaasje aan.
  2. Wanneer meerdere embryo's zijn gevuld op een dia breng elke embryo een kleine druppel PBS op een aparte 24 x 60 mm dekglaasje met de ventrale zijde van het embryo naar het glas. Plaats een frame van plakband rond elk embryo tot een goed te maken en de voorbereiding met P dekkenBS. Houd de dia's in een vochtige kamer voordat fotoconversie om ze niet uitdrogen. Exchange de PBS die het embryo met DAB oplossing. Onmiddellijk een glijbaan op een omgekeerde microscoop uitgerust met een 100W Hg-lamp en gebruik een Cy3 filter ingesteld op de Dil prikkelen, met behulp van bijl 50 doelstelling. Na fotoconversie, breng het embryo een nieuwe dia in een daling van 70% glycerol, voeg een dekglaasje en afdichting met nagellak.

6. Onderzoek door confocale microscopie

  1. Na stap 4,10, transfer embryo een druppel PBS op een verse 24 x 60 mm dekglaasje. We optimale optica op door de afgeplatte embryo's met de rugzijde naar het dekglaasje (waardoor slechts een kleine hoeveelheid PBS tussen het dekglaasje en embryo).
  2. Plaats een frame van plakband rond het embryo en vergroten de PBS druppel aan het frame te vullen wanneer bedekt met een glijbaan. Plaatst u voorzichtig een glijbaan op en zet deze vast met nagellak. Neuronen gevuld moet examenINED een confocale (of fluorescentie) microscoop zo spoedig mogelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 4 toont typische resultaten van de techniek, de hier beschreven. Figuur 4A toont een voorbeeld van een gevulde DiI enkele interneuron dat zuiver was photoconverted. Het toont mooi de mate van detail deze voorbereidingen aanbod. Wanneer bekeken onder DIC optiek de ruimtelijke context van de gemerkte cel in de niet-gemerkte omringende weefsel zichtbaar wordt, bijvoorbeeld de positie van het cellichaam in de cortex en de vezels in de projectie neuropile.

Figuur 4B is een geval waarin de kleurstof daling was een beetje te groot waardoor verschillende aangrenzende cellen worden gelijktijdig gemerkt. Dit maakt het vaak moeilijk om de individuele projecties betrekking hebben op verschillende cellichamen. Het toont ook aan dat wanneer rechtstreeks bekeken worden onder de fluorescentiemicroscoop (geen fotoconversie) achtergrond resolutie is veel lager.

Het monster in Figuur 4C

Figuur 4D toont de waarneming door confocale microscopie de morfologie van gelabelde cellen toont in detail. DiI labeling werd uitgevoerd in een stam die een GFP reporter construct uitgevoerd. Dit kan belangrijke informatie over de ruimtelijke context (en identiteit) van de kleurstof gevulde cel in specifieke populaties van neuronale of glial celtypes (zoals gedefinieerd door genexpressie).

Als paradigma om morfologische variabiliteit van een geïdentificeerde neuronen te evalueren hebben we gekozen voor een van de ongevleugeld positieve neuronen 14. Dit neuron ligt in een dorsale en mediale positie dicht bij de neuropile (DAP, figuur 5A Lundgren et al.., 1995) gescheiden van de andere ongevleugeld positieve neuronen en is gemakkelijk herkenbaar apGal4-UASGFP dieren. Figuur 5B toont een cel dAP dat was gevuld met Dil en photoconverted. Het cellichaam ligt op het niveau van het voorste en commissure toont een axon dat eerst groeit naar de middellijn en draait anterior mediale in een verbindende regio. Het heeft groeikegel zoals zwellingen op de tip en het keerpunt. 19 labels van deze cel, getrokken maximum prognoses afbeeldingsstapels, zijn in figuur 5C. Celmorfologie zichtbaar voor detail. Slechts enkele cellen geven groeikegel zoals structuren, zes van de 19 cellen ook sturen een tak posterior dat is altijd korter dan de voorste tak en misschien wel een tijdelijke functie. In Figuur 5D alle 19 gemerkte cellen dAP gestapeld waarbij elke cel die slechts een dekking van 12%. Dit resulteert in zones gelegd donkerder meer cellen delen. Terwijl het cellichaam varieert meerdere cellen diameter in het midden, de mediolaterale positie van het axon in de neuropile varieert veel minder - wanneer de neuropile breedte is verdeeld in negen delen altijd bevindt in een van de mediale twee posities.

Figuur 1
Figuur 1. Schematisch overzicht van de stappen van de neuron labelingsmethode en de twee varianten.

"Fo: inhoud-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/>
Figuur 2. Diagram van de verschillende stappen bij de voorbereiding van Drosophila embryo's voor neuron kleurstof injectie, volgens variant B. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. . Schematische weergave van de opstelling voor kleurstof injectie Rechtsboven insert is een vergroot aanzicht van de opstelling van het monster, de injectie micropipet en het bad elektrode A:. Micromanipulator, B: Vaste trap microscoop. De micromanipulator is vastgesteld op een ondiepe hoek - ongeveer 10 & de. g; C: Micropipet houder met micropipet, D: Specimen op dia, E: Bad elektrode vast met plasticine, F: Aansluiting op DC versterker.

Figuur 4
Figuur 4. Voorbeelden van Dil-gelabeld interneuronen in de ventrale zenuw snoer van fase 17 embryo's. Dorsale uitzicht, anterior is naar links. Midline: stippellijnen.

  1. Een voorbeeld van een perfect photoconverted cel, met prominente contralaterale axonale projectie ipsilaterale dendritische vezels (pijlpunt). DIC optiek.
  2. toont een preparaat waarin meer dan een cel werd gelabeld - deze kunnen verdoezelen de duidelijke toewijzing van een cellichaam zijn projectie.
  3. 8 cellen zijn gelabeld in 3 opeenvolgende segmenten. Bovendien in dit preparaat de fotoconversie werd gevolgd door een standaard protocol antilichaamkleuring tegen Fas2 als oriëntatiepunt.
  4. toont een DiI gevulde neuron gedocumenteerd confocale microscopie in een vlieg stam die een GFP reporter construct.

Figuur 5
Figuur 5. Gerichte Dil etikettering (gemarkeerd door GFP expressie) onthult het bereik van de morfologische variabiliteit van een geïdentificeerde neuron 14. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

  1. De DAP cel (kunstmatig gekleurd blauw) kan ondubbelzinnig worden erkend binnen de ongevleugeld Gal4-UASGFP patroon in de buik (DAP, figuur 5A, Lundgren et eenl. 1995). GFP tot expressie brengende cellen werden gekleurd met een anti-GFP antilichaam. De middellijn is gemarkeerd met stippellijnen. ac = commissura anterior, PC = achterste commissuur.
  2. toont een voorbeeld van een photoconverted DiI gevulde dAP cel. De cel werd voorafgaand geïdentificeerd te verven het invullen van een ongevleugeld Gal4-UASGFP embryo door de expressie van GFP.
  3. Een galerij van 19 vullingen van deze cel, getekend als maximale projecties van beeld stacks. Dorsale uitzicht. Anterior om is. De neuropile is in het licht grijs, de cortex gebied is in donkerder grijs.
  4. De 19 dAP cellen worden gestapeld waarbij elke cel met een dekking van 12%. De regio bezet door het merendeel van de cellen heeft de donkerste tint van grijs. De neuropile van specimens (blauw) werd aangepast aan een gelijke breedte en de voorste commissuren naast de cel werden uitgelijnd zodat ze elkaar overlappen. Terwijl het cellichaam varieert meerdere cellen diameter rond de centrale positie, de positie van de mediolaterale axon in de neuropile toontminder variatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een groot voordeel van Drosophila als model is dat het onderzoek van de ontwikkeling en functie van het niveau van afzonderlijke cellen mogelijk maakt. Dit is vooral handig over het zenuwstelsel, waar de diversiteit van celtypen uitzonderlijk hoog en de werking en vorm van naburige cellen kan heel anders.

De werkwijze die we hier kunnen de kenmerken van individuele neuronen met een kleurstof die kan worden omgezet in een permanente vlek of rechtstreeks onderzocht door fluorescentie microscopie. Het toont de morfologie van neurale processen in detail (figuur 4). Een van de grote voordelen van de werkwijze is dat de morfologie van vrijwel elk type neuron kan in het CZS te onderzoeken (de embryonale ventrale zenuwkoord Zie Rickert et al., 2011;. De embryonale hersenen, zie Kunz et al.., 2012). Bovendien is het niet nodig complexe combinaties vangenetische elementen aanwezig in het embryo, doordat sommige van de genetische labelingstechnieken doen. Kleurstof injecties kunnen worden uitgevoerd in cellen van dieren die reporter constructen dragen, waardoor individuele cel morfologie te worden gevisualiseerd in de context van specifieke genexpressiepatronen (figuren 4D en 5) ofwel wildtype of mutant achtergronden. We hebben ook de gebruikte techniek om de dynamiek van axon uitgroei monitoren in levende embryonale neuronen 11, 12.

De werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan individuele neuronen in embryo's van andere organismen, mits de embryo label transparant genoeg worden getoetst DIC verlichting. We hebben gebruikt om neurale morfologie in een grote verscheidenheid van embryo geleedpotigen, waaronder sprinkhanen 18, duizendpoten 17, 19 en schaaldieren zilvervisjes 16 visualiseren.

Het belangrijkste nadeel van de technischeque ligt in zijn technische problemen. Wij vertrouwen erop dat de huidige gedetailleerde beschrijving van de methode zal geïnteresseerde onderzoekers helpen bij het beheersen van het.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de DFG naar GMT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore 7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC - amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P
Micromanipulator R Leica to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
  3. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  4. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
  5. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
  6. Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
  7. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  8. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  9. Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
  10. Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
  11. Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
  12. Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
  13. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  14. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
  15. Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
  16. Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
  17. Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
  18. Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
  19. Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
  20. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Tags

Developmental Biology Neuroscience neurobiologie genetica celbiologie moleculaire biologie anatomie Drosophila fruitvlieg Neurowetenschappen Neuroanatomie Biowetenschappen embryonale zenuwstelsel het centraal zenuwstelsel neuronale morfologie enkele cel etikettering embryo microscopie diermodel
Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K.… More

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter