Summary
我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示
Abstract
この記事では、我々は個々に親油性の蛍光膜マーカーDiIのjuxtacellular注射によるキイロショウジョウバエの胚中枢神経系の神経細胞をラベル付けする方法を説明します。この方法は、非常に詳細に神経細胞形態の可視化を可能にします。それは、CNS内の任意のセルにラベルを付けることが可能です：標的ニューロンの細胞体は、DIC光学の下やGFPなどの蛍光遺伝子マーカーの発現によって可視化されています。標識後、DIIは、透過光とDIC光学系と細胞形態の可視化を可能にすることにより光電永久茶色の染色に変換することができます。あるいは、DiI標識細胞を遺伝子導入した蛍光レポータータンパク質がcolocalisedすることを可能にする、共焦点顕微鏡で直接観察することができます。技術はそれが可能な単一細胞の解像度で変異体の表現型を解析すること、遺伝子型にかかわらず、任意の動物に使用することができます。
Introduction
個々の細胞レベルでの神経形態の知識は神経接続とCNS機能を理解するための重要な前提条件です。このように、神経科学の黎明期から、研究者は、単一細胞標識技術（この問題の歴史的な治療のために7を参照）を開発しようとしてきた。そのようなゴルジ染色などの古典的な方法は、神経形態の優れた解像度を提供しますが、一つは染色はランダムに発生するように、指示された方法で、神経細胞の特定の種類にラベルを付けるために求める場合は適していません。微小電極から色素の細胞内またはjuxtacellular注射することで、単一細胞を染色するための方法の開発は、特定のラベリングの要件に対処した。
ショウジョウバエへの単一ニューロン染料注入のアプリケーションが原因生物とニューロンの両方のサイズが小さい、大きな課題を提示した。 ショウジョウバエの胚のそれにもかかわらず、単一のニューロンの染色15の研究室では、1980年代半ばに達成された。方法は極めて有用であったし、最後の20〜30年（ 例えば、2、10）以上、ショウジョウバエの神経発達のメカニズムにいくつかの重要な洞察を提供してきましたが、多くの労働者が主な理由として、その技術的な要求のために、それを敬遠してきた。
ショウジョウバエのニューロンの標識のための遺伝的技術のより近年の可用性は、単一ニューロンの色素注入の不人気に貢献してきました。膜標的化GFPコンストラクトのGAL4指向発現は、神経形態学1、20の優れた分解能を提供することができます。しかし、この方法は、一定の制限があります：複数の細胞におけるGFPのしばしば不可避式は個々のニューロンの構造を分かりにくくすることができますとGAL4ドライバーラインは、関心のある特定の神経細胞での発現を駆動するのに利用可能でないかもしれません。 MARCM（REPを持つモザイク解析ressible細胞マーカー）法8は、個々 の細胞レベルで、本質的に任意のニューロンを標識しましたが、正常になぜならGAL80タンパク質の代謝回転の遅い胚と早期幼虫に使用することはできませんを提供することができます。
遺伝標識のこれらの制限を考えて、私たちは、 ショウジョウバエの胚において、単一ニューロンの色素注入は重要な手法のままで、広範なアプリケーションに値すると信じています。この目標を推進するために、我々はここで方法の詳細な説明を提供します。そのパワーのイラストが遅くショウジョウバエの胚14の腹部neuromeresにおける介在の完全なセットの形態の我々の最近のアカウントで提供されています。個々の神経細胞種の形態学的変動と胎児の中枢神経系における神経分節組織の原則の両方を明らかにしたこの研究では、現在使用可能な他の標識法では不可能だったでしょう。
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Protocol
私達は私達の研究室で単一ニューロン標識法の2つのわずかに異なるバリアントを使用している。違いは胚コレクション、dechorionisation、devitellinisationおよび胚フィレットの手順に関連しています。 図1は変異体の共通の発散と手順の概要を説明します。
1。仕分けインジェクション用の胚の解剖及びマイクロピペット用マイクロ針の作製
- 胚の解剖用ガラス針はサタープラー（サイエンス·インスツルメンツ）または同等の機器とガラスキャピラリー（直径1mmと0.1mmの壁の厚さ）から描かれています。あるいは、針ホルダーに取り付けられた電解削っ0.15mmのタングステンワイヤは解剖のために使用されます。 （シャープ電解するための手順を9に示されている）。
- サッタープラー（科学と、染料インジェクションピペットは、インナーフィラメント（100 GBのTF 8P科学製品）の薄肉ガラスキャピラリーから描かれていますインスツルメンツ）または同等の装置。マイクロピペットチップは、胚の組織を通過させることを支援するためにシャンクの緩やかな、均一なテーパーと、シャープにする必要があります。サター·インストゥルメントピペットクックマニュアルのP.20（上の説明に従って、使用するマイクロピペットは、 "高抵抗微小電極、シャープ、ロング"品種ですhttp://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ）。一般的に、マイクロピペットは、注射は、その先端が鋭く、きれいなまま確保するために実施される少し前に引っ張られる。
2。コレクション、マウントおよび胚の解剖
- 胚コレクションは。我々は、正常な段階12から17 3から胚ここで説明ニューロン注入法を用いてきた。胚は、徐々にステージ17の間にキューティクルを開発し、解剖することがますます困難になる。 2つの代替方法は、emを得ることが可能です特定の発達段階におけるbryos。
- ハエが酵母ペーストを塗布リンゴジュース寒天プレート上で一晩卵を産むことができます。翌日注射の予定時間に合わせて採卵の温度を調整します。翌日にすべての卵を収集し、形態学的基準3を使用して所望の段階で胚を選択します。
- ハエは25℃で1.5時間毎に上記のように寒天プレート上に横たわっていたが、新鮮なものに寒天プレートをスワップアウトすることができ℃、胚が必要な発達段階に到達するまで、決められた期間、各プレートをインキュベートする。
- 化学Dechorionation。寒天から胚をこすり、約10ミリリットルショウジョウバエリンガーまたはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で緩衝溶液含有するガラス容器（ 例えばペトリ皿またはキャビティブロック）にそれらを転送するために金属製のヘラを使用してください。濃縮された漂白剤を数滴を追加し、上に数分間攪拌胚オフ絨毛脱落するまで、ロータリープラットフォーム。残留漂白剤の臭いがなくなるまでリンガー/ PBSのいくつかの変更で胚を洗浄します。これらの洗浄時には、胚が液面に接触しないことを確認してください。それ以外の場合は、フロートと後の操作のために水没することは困難になるだろう。あるいは、化学dechorionationを4で説明したバスケット方式を用いて行うことができる。
- メカニカルdechorionation（図2を参照、手順1〜4を繰り返します）。両面粘着テープで覆われたスライドに寒天プレートから胚を転送します。それはテープへの接着を妨害するような胚と寒天を転送することは避けてください。絨毛膜が少し脆い取得するまでの胚は5〜10分間乾燥することができます。 （接着剤で後でdevitellinisationのために必要と待っている間に、コートカバースリップ - 2.3B以下を参照してください）。針で軽く各胚をタッチします。絨毛膜は開いた分割され、胚は、NEに固執するedle。乾燥を防ぎ、彼らの腹側を上向きにして、行にそれらの約10を揃えるために寒天ブロックにすぐに胚を移します。
Devitellinisationとフィレットは 2.3Aと2.3Bで説明する2つの方法のいずれかを使用して手動で実行されています。
- リンゲル液の皿から事前に準備顕微鏡スライド上にシリコーンダムにおけるRinger数滴に適切な発達段階の単一dechorionated胚を転送します。 （不鮮明で3 cm角ダム顕微鏡スライド上にシリコーンシーラントの薄層を確認してから、ダムの中心に0.01パーセントのポリ-L-リジン溶液の液滴を追加します。シリコーンは24時間硬化させます。）胚が転送中にリンガーの表面の下に残っていることを確認しながら、ガラスパスツールピペットを用いて胚を転送します。
優しくSQUEEZながら、細かいピンセットで胚の後端を引き締めるその前端から帰り約四分の一、細かい虹彩切除術のはさみで胚をING。胚を介して右切断しないでください。目的は、胚への最小限の損傷を引き起こしながら、ちょうど卵黄膜を開いてクラックすることです。まだ位置に鉗子で、開かれた膜の胚を容易にし、スライド上にそれを腹側を下に配置するためにタングステン針を使用しています。胚はポリリジンコートに固執する必要があります。
尖ったタングステン針を持つフィレット胚。穏やかに穿孔し、背側正中線に沿って体壁を引き裂く。それはスライドにこだわったように針を使用して、体壁を下に押します。体壁の損傷を防ぐために、それと針との間に介在する腸と体壁を押してください。その前方及び後方端で腸を通って引き裂き、それを持ち上げて外し、針を使用しています。必要に応じて、追加の胚は、同じスライドに移しdevitellinisedと切り身、既に上の他の胚を傷つけないように注意しながらすることができるスライド。 - コートスライドの中央に接着剤の小滴を配置し、非常に薄いフィルムに18×18mmのカバーグラスとそれを広めることでヘプタン接着剤（ 表1参照）と24×60mmのカバースリップ。顕微鏡スライドにカバースリップを置き、その縁の周りに片面粘着テープのフレームを作る。 10胚の行を保持ブロックから離れて過剰な寒天をカットし、静かにカバーガラスヘプタングルーカバースリップで胚をタッチします。彼らは今、彼らの腹側を下にしてカバースリップを遵守すべきである。 （ 図2、ステップ4-6を参照）の胚をカバーするために、PBSの寛大な量を追加します。
その後端近く各胚の背側のガラスまたはタングステン針と卵黄膜を貫通している。背側正中線に沿って膜を開いて引き裂き、膜の胚を外にドラッグします。東洋の他の場所ヘプタン糊基板やフィレットそれは2.3Aで説明したのと同じ方法を使用して上にダウン胚腹側（）を参照してください図2は、）7-8を繰り返します。いくつかの胚を同じスライドにフィレットされますので、どちらの向きで非常に正確であるか、または、スライド上の向きの図面を作っておくと便利です。
- リンゲル液の皿から事前に準備顕微鏡スライド上にシリコーンダムにおけるRinger数滴に適切な発達段階の単一dechorionated胚を転送します。 （不鮮明で3 cm角ダム顕微鏡スライド上にシリコーンシーラントの薄層を確認してから、ダムの中心に0.01パーセントのポリ-L-リジン溶液の液滴を追加します。シリコーンは24時間硬化させます。）胚が転送中にリンガーの表面の下に残っていることを確認しながら、ガラスパスツールピペットを用いて胚を転送します。
- フィレット後、胚を軽くPBS中7.4％ホルムアルデヒド中で10〜15分間固定してもよいし、PBSで4回洗浄した。表面張力は、胚を破壊するように細心の注意が、このプロセスの間、溶液の表面に接触胚を持参しないように注意する必要があります。この前の固定ステップは厳密には必要ではありませんが、後期胚において体壁筋の収縮を防止し、若い段階で胚組織を安定させるのを助けることが有用である。固定は胚の組織をより不透明にないことに注意してくださいので、多少DIC観察下で画質が低下します。
3。インジェクションマイクロピペットの充填
ハーフで0.5 mlエッペンドルフ微量遠心チューブを埋める100％エタノールでcarbocynanine染料DII（Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州）（DIIの沈殿を避けるために、 "ドライ"無水エタノールを使用してください）の0.1％溶液。チューブの蓋に細い穴を開けると、蓋の穴からマイクロピペットの平滑末端を挿入します。 DiIを、少なくとも5分間フィラメントを上昇することができます。 （エタノールの蒸発を避けるために、マイクロピペットを満たさないときは、必ず蓋に穴をカバーする）。
機器は、ニューロン染料注入（図3）のために必要。
顕微鏡。固定ステージ顕微鏡はフォーカシング時の胚の縦方向の移動を避けるために、神経細胞の色素注入のために使用する必要があります。それは、胚に接触した後に、そのような動きは、ピペットを変位う。我々はツァイスAxioskop FSとオリンパスAX50/BX50固定ステージの両モデルは、この目的に適していることがわかりました。顕微鏡はneurの可視化のための透過光微分干渉光学系を装備する必要があります染色前にアドオン。顕微鏡もむしろ倒立モデルより直立しなければなりません。倒立顕微鏡で2つが胚の反対側にあるのに対し、正立顕微鏡を用いて、マイクロピペットの先端は、閲覧目的として胚の同じ側にある。後者の構成は、DIC光学系の品質が損なわれます。顕微鏡は、DIIの観察に適したフィルターセットで、蛍光顕微鏡用に設定されるべきである。 DiIをこの範囲内に多くのフィルターセットがうまくいく549および565 nmでの励起および発光極大を持つ比較的広いスペクトルを持っているので、アレクサ568、Cy3と、ローダミン、テキサスレッドまたはTRITC用のものを例えば 。それは顕微鏡を用いて、手で直接触れることなく、シャッターの動作を可能にするために、蛍光光源のパス内の電子制御式シャッターに合うように便利であるが、我々はまた、効果的にのみ手動シャッターが装備されていた設定に標識した。最後に、高倍率、高開口apertu再水浸対物レンズは、注入中に観察するために必要です。この目的は、カバーガラスなしで使えるように設計されるべきである。我々は、正常ツァイスAchroplan 100x/1.0W、オリンパスLUMPlanフロリダ100x/1.0W、オリンパスLUMPlanフロリダ/ IR 60x/0.9 Wの目標を使用しています。
マイクロマニピュレーターニューロン色素注入時マイクロピペットを配置し、移動する必要があります。私たちは、ライカマイクロマニピュレータとステージマウント持てる3軸油圧マイクロマニピュレーターの両方を使用している。
細胞内のDCアンプは 、電流注入のための施設で、マイクロピペットからDiIのイオン導入注入するために必要です。
4。仕分けインジェクション用の手順
- 注射顕微鏡のステージ（ 図3）に搭載された胚（s）でスライドを配置します。胚を見つけて、視野の中心にそれを持って来るために10倍の対物レンズを使用してください。
- SW視聴位置に高電力の目標をINGと焦点に胚をもたらす。 DIC光学（または標的細胞がGFPを発現した場合の蛍光を用いた）の下で目的の細胞を見つけて、それを視野の中心に持って来る。顕微鏡の視野絞りを超えていない、ただの視野の端に開いていることを確認します。狭い照明ビームは（以下の手順4.4を参照）マイクロピペットの位置決めを支援するでしょう。それでもリンガー/ PBS溶液と接触を維持しながら、それは、胚の上にできるだけ高くなるまで目標を引き上げる。
- 胚およびマイクロピペットのパスのよく澄んだPBSにDCアンプのために風呂の電極を配置します。
- 0.1MのLiCl溶液で満たされたそのホルダ、に注入マイクロピペットを挿入します。マイクロマニピュレーターにマイクロピペットホルダーを取り付けます。マニピュレーター粗いコントロールを使用して、客観的かつ胚の先端との間の空間にマイクロピペットをもたらす。それがうまく胚のレベルを超えていることを確認します。なぜならハイパワー目標の短い作動距離のため、マイクロピペット（ 図3参照） は 、フォーカスにそれを持って来るために、浅い角度で保持されなければならないでしょう。あなたが裁判と最初のインスタンスでエラーによって適切な角度を確立する必要があります。角度が急峻すぎる場合は、フォーカスにマイクロピペットのチップをもらうことができなくなります。それが浅すぎる場合は、マイクロピペットのシャフトは適所に入浴液を保持し、ダムの壁に詰まらされます。
- 中心視野内のマイクロピペットの先端。これを達成するために、胚のレベルにあなたの目を持参し、顕微鏡ステージのY軸に前後にマイクロピペットを移動します。その先端が光路を横切るとき、あなたはそれからの光線の明るい反射を見ることができます。それは、光ビームをオーバーシュートように、X軸に前方にマイクロピペットの先端を移動します。それは小さいでマイクロピペットを見つけやすくなります高電力目的の視野には、その軸ではなく、その先端を探している場合。今顕微鏡接眼レンズに目を通し、マイクロピペットのシャフトが焦点になるまで徐々に高電力の目標を下げてください。それが徐々に焦点が来るようにマニピュレーターコントロールとY軸に前後にマイクロピペットを移動すると、それを見つけるのに役立ちます。その先端が視野の中心に位置するまでシャフトが合うと、X軸にマイクロピペットを移動します。この段階では、マイクロピペットチップはよく胚のレベル超えている必要があります。蛍光照明に切り替え、DiIの漏れをチェックするために先端を調べます。先端に形成されるの任意DIIの結晶を防止するためにDC電流を調整します。
- マイクロマニピュレータのコントロールを使用して、Z軸にマイクロピペットを下げる。顕微鏡のフォーカス制御でフォーカスにそれを持ち帰る。徐々にこのように胚に向かってマイクロピペットを下げる。最初は粗いでこれを行うことができますマニピュレーターおよび顕微鏡のZ軸を制御します。胚が焦点に来るようにただし、細かいコントロールノブに切り替える必要があります。
- 胚の表面が焦点になると、マイクロマニピュレータの方向に、視野の端の方にマイクロピペットの先端を移動します。注入する細胞に焦点を当て、それが視野の中心に位置していることを確認してください。マイクロピペットの先端に再び集中し、それが細胞のように、Y軸で同じレベルに位置するまで、Y軸に動かします。あなたがZ軸でそれを下げるように、X軸のセルに向かってマイクロピペットの先端を移動します。ライカマイクロマニピュレータを用いた場合は、おそらく顕微鏡ステージは先端が細胞に近づいたようにステージ制御に切り替えて、あなたにマニピュレーターコントロールよりも、X軸の動きを細かく制御できるように制御していることがわかります。
- 細胞と接触マイクロピペットチップを持参し、その表面にうつ病を作る。 depolariziのいくつかのナノアンペアを渡す数秒間現在のNG。あなたは、セル上に形成DiIの小さな結晶が表示されるはずです。セルが入力されていることを確認するために、簡単に蛍光灯で胚を照らすためにシャッターを開け、その後、DICに切り替える。目的の細胞の本体はラベリングの兆候を示している場合、いくつかのより多くの秒現在適用されます。現在の電源をオフにして、迅速顕微鏡ステージコントロールを使用して、X軸のマイクロピペットから胚を引き出します。その後、溶液からマイクロピペットを撤回します。全くDIIの標識が明らかでない場合は、マイクロピペットは、ブロックされることがあり、新鮮なマイクロピペットで交換が必要になります。あなたは、マイクロピペットの先端が目的の細胞への途中で他の組織を引っかけており、この組織はむしろセルよりも染色されることがあります。この場合、セルを若干マイクロピペットを撤回し、再アプローチしてみてください。これは、マイクロピペットを交換して、再度試してみる必要があるかもしれません。
- 必要に応じて、複数のセルがindividuすることができます味方は同じ胚で標識した。
- 注入チャンバー内の液のほとんどを除去し、PBSで4回洗浄し、続いて10分間7.4％ホルムアルデヒド/ PBSを添加して胚を固定してください。胚は、その後、DiIをが神経プロセス全体に拡散するように、（漂白やドライ陥るのを避けるために）暗い、湿ったチャンバ内で少なくとも4時間（または一晩4℃）室温で放置されています。この段階では、DiI標識細胞はどちらphotoconvertedしてもよいし、共焦点顕微鏡に直接表示。
5。 DICの光学系を用いた検討のための光電
光変換の原理は、適切な波長で照射中に染色された細胞によって放出された蛍光灯によりDABの（フォト）の酸化です。これは明るい細胞が弱く染色された細胞に比べて短い時間でphotoconvertedていることを意味します。 1検体で標識複数のセルがその明るさに関する違いすぎている場合、これはdifficuにつながることができます同じ品質でそれらのすべてをphotoconvertingでlties（ 図4C参照）：この場合、1は弱い細胞（短い照明を使用して）無視したり（長い照明を使用して）明るい細胞が膨潤し始めるということを受け入れるとの間の妥協点を決定する必要があります。すべてのセルが弱すぎる（従って非常に長い照明を必要とする）のラベルが付いている場合は、内因性ペルオキシダーゼによって引き起こされる背景には、問題になることができます。 DABは毒性があるので、慎重に扱われるべきである。廃棄物は、漂白7％の塩素と '非活性化 "することができます。
- 光変換を個別に各胚のために行わなければならない。唯一の1つの胚をスライドごとに注入される場合には、胚をカバーPBS溶液をDAB溶液（3mgのDAB / mlのトリス緩衝液）、蛍光顕微鏡と100xの目的でご覧に満ちたセル上に配置され、スライドに置き換えられます。 （DAB溶液に正立顕微鏡の対物レンズを使用したディップと光電pの後に水で数回洗浄する必要がありrocedureが完了しました。倒立顕微鏡が使用されている場合、これは）を回避することができる。茶色のDAB反応生成物が標識されたニューロン（明視野照明に切り替えることにより、定期的にチェックしてください）で明らかになるまで、Cy3のフィルターセットと100Wの水銀ランプを使用し、セルが赤色の励起波長にさらされている。最適なDAB染色に要する時間は可変であるが、蛍光は完全に色あせている段階を超えて励起光にさらす必要があります。光変換が完了した後、PBSで準備を数回洗う。 70％のグリセロールを含むPBSドロップを交換し、手術用メスの刃を用いてシリコーンを削り取る、ワセリンのリングと交換して、カバースリップを追加します。
- 複数の胚を1スライドに満たされた場合は、ガラスが直面している胚の腹側を持つ別の24×60mmのカバースリップ上でPBSの小滴に各胚を転送します。井戸を作成し、Pと準備をカバーするために、各胚の周り粘着テープのフレームを配置BSを取得しています。乾燥からそれらを防ぐために光変換前湿室でスライドを保つ。 DAB溶液と共に胚をカバーするPBSを交換します。直ちに100W Hgランプを備えた倒立顕微鏡上にスライドを配置して、斧50対物レンズを用いて、DIIを励起するために設定されたCy3フィルタを使用します。光変換した後、マニキュアでカバーガラスとシールを追加し、70％グリセロールのドロップ新鮮なスライドに胚を移す。
6。共焦点顕微鏡による検査
- 新鮮な24×60mmのカバースリップ上でPBSの小滴へのステップ4.10の後、転送胚。私たちは、カバースリップに向かって背側（カバーガラスとの間に胚のPBSのみ少量を残す）と扁平な胚をマウントすることで最適な光学系を実現しています。
- 胚の周りに粘着テープのフレームを配置し、スライドで覆われたときにフレームを埋めるために、PBSドロップを拡大。慎重にスライドを置き、マニキュアで固定します。満たされたニューロンは受験する必要がありますできるだけ早く、共焦点（または蛍光）顕微鏡でined。
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Representative Results
図4は技術の典型的な結果を示して、私たちはここで説明しています。 図4Aは、きれいにphotoconvertedたDiIを埋め単一介在ニューロンの例を示しています。それは、うまくこれらの準備が提供する詳細情報の量を示しています。非標識の周囲の組織内に標識された細胞の空間的な文脈が見えるようになり、DIC光学の下で見たときに、皮質内および神経網内の繊維投影の細胞体の位置を例えば 。
図4Bは、染料ドロップが同時にラベル付きとなっていくつかの隣接するセルの結果少し大きすぎた場合です。これは、しばしば、それが難しいの異なる細胞体への個々の予測を関連付けることができます。また、直接蛍光顕微鏡下で見たとき（無光電）背景の解像度がはるかに低いことを示しています。
図4cに標本
図4Dは、共焦点顕微鏡による観察が詳細に標識された細胞の形態を明らかにすることを示しています。 DiIを標識はGFPレポーター構築物を運ば株で行った。これは、神経やGLの特定の集団内で色素充填したセルの空間コンテキスト（およびアイデンティティ）に関する重要な情報を提供してもよいIAL細胞型（遺伝子発現によって定義されるように）。
識別されたニューロンの形態学的変動性を評価するためのパラダイムとして、私たちは無翅の陽性ニューロン14のうちの1つを選択しました。このニューロンは、他の無翅の陽性ニューロンとは別の（DAP、 図5A、ラングレンら 、1995）に近い神経網に背内側位置にあり、したがってapGal4-UASGFP動物で容易に識別可能である。 図5Bは、DAPセルを示しているそれはDIIとphotoconvertedに満ちていた。細胞体は前交連のレベルである、最初の正中線に向かって成長し、その後中間結合領域では前方になり軸索を示しています。それは、先端に腫れやターニングポイントのような成長円錐を持っています。画像スタックからの最大予測として描かれ、このセルの19のラベルは、 図5Cに要約されています。細胞形態は、非常に詳細に見えるようになる。ごく少数の細胞は、成長円錐のように見せる構造; 19細胞の6も常に前枝よりも短いとよく過渡特徴なのかもしれないです、分岐後に送信します。 図5Dに標識された全19 DAP細胞は12％のみ不透明度を有する各セルに積層されている。より多くの細胞である暗いエリアでのこの結果は、それらを共有する。細胞体は、中心位置の周りに複数のセル径を変化させながら、神経網内の軸索の中外側の位置はあまり変化します - 神経網幅はそれが内側2つの位置のいずれかに常に常駐し9の部分に分かれていたとき。
図1。ニューロン標識法とその2つの変形の手順の概略図。
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図2。バリアントBに従って、ニューロン色素注入のために、ショウジョウバエの胚の準備の様々なステップを示す図は、 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 。仕分けインジェクション用のセットアップの概略図右上のインサートは、標本、インジェクションピペットとバス電極の配置の拡大図である。マイクロA、B：固定ステージ顕微鏡。マニピュレーターは、浅い角度で設定されている - 約10＆ドgであり、C：マイクロピペット、Dとマイクロピペットホルダー：スライド上の標本は、E：粘土で固定バス電極、F：DCアンプへの接続。
図4：ステージ17胚の腹側神経索におけるDiI標識ニューロンの例。背景色、前部は左側にあります。ミッドライン：点線。
- 著名な反対側の軸索投射と同側の樹状繊維（矢印）を示す完璧photoconverted単一セルの例。 DIC光学。
- 複数のセルが標識された準備を示しています - これはその投影への単一の細胞体の明確な割り当てが見えにくくなる場合があります。
- 8セルは連続した3つのセグメントで標識されている。また、この準備に光変換は、ランドマークとしてFAS2に対する標準プロトコル抗体染色を行った。
- GFPレポーター構築物を運ぶハエ株の共焦点顕微鏡で文書化された単一のDiIを充填したニューロンを示しています。
図5。対象とDIIのラベリングは、（GFP発現でマーク）特定ニューロン14の形態変動の範囲を明らかにする。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
- DAP細胞（人工的に着色された青）は一義的に腹部（DAP、 図5A、ラングレンらで無翅の GAL4-UASGFPパターン内では認識することができますリットル、1995）。 GFPを発現する細胞は、抗GFP抗体で染色されています。正中線は点線でマークされています。 AC =前交連、後交連PC =。
- photoconverted DiIを充填したDAPセルの一例を示しています。細胞は、GFPの発現により、その無翅の GAL4-UASGFP胚で充填染める前に同定された。
- 19のギャラリーが画像スタックからの最大投影として描かれ、このセルの塗りつぶし。背景色。前歯がアップしています。神経網が薄い灰色になって、皮質領域は、濃い灰色になっています。
- 19 DAPの細胞を12％の不透明度を有する各セルに積層されている。ほとんどの細胞が占める領域は、灰色の暗い影を持っています。すべての標本の神経網（青）は、同様の幅に合わせて縮小された、彼らが重なるように、セルの横前方交連を整列させた。細胞体は、中央位置の周りに複数のセル径を変化させながら、神経網内の軸索の中外側の位置を示してい変動が少ない。
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Discussion
モデル系としてショウジョウバエの一つの主要な利点は、単一細胞のレベルでの発達と機能の解析を可能にすることである。これは、細胞の種類の多様性は非常に高く、隣接する細胞の機能と形態が全く異なることがあります神経系に関しては特に便利です。
ここでお見せする方法は、永久染色剤や蛍光顕微鏡法による直接調べに変換することができる色素を持つ個々の神経細胞のラベリングを可能にします。それは偉大な詳細に神経プロセス（ 図4）の形態を明らかにする。方法の主な利点の一つは、それは、胚腹側神経索のために（検査されるCNSにおけるニューロンの実質的に任意のタイプの形態を可能にすることで、リッケルトら、2011;胚脳のために、クンツらを参照してください。 ら 、2012）。さらに、それはの複雑な組み合わせを必要としません遺伝的要素遺伝標識技術のいくつかがそうであるように、胚の中に存在させる。色素注射することにより、個々の細胞の形態は野生型または変異背景のいずれかで特定の遺伝子の発現パターン（ 図4Dおよび5）のコンテキストで可視化することができるように、レポーターコンストラクトを運ぶ動物の細胞内に行うことができる。我々はまた、胚性ニューロン11,12生体内で軸索伸長の動態を監視する技術を使用している。
方法は容易に胚はDIC照明の下で検査されるのに十分透明である限り、他の生物の胚において個々の神経細胞を標識するために適合させることができます。我々はバッタ18、ムカデ17、甲殻類19と紙魚16を含む節足動物の胚、幅広い種類の神経形態学を視覚化するためにそれを使用している。
テクニの主な欠点queのは、その技術的な難しさにある。我々は、メソッドの現在の詳細な説明はマスタリングでそれを興味を持って研究者を支援することを信頼しています。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、DFGからGMTへの助成金によって支えられて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
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References
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