Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50150
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Institute of Genetics, University of Mainz, 2Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne

Summary

Vi presenterer en teknikk for merking enslige nevroner i sentralnervesystemet (CNS) av

Abstract

I denne artikkelen beskriver vi hvordan du individuelt merke nevroner i de embryonale CNS av Drosophila melanogaster etter juxtacellular injeksjon av lipofile fluorescerende membran markør DII. Denne metoden gjør det mulig visualisering av neuronal celle morfologi i stor detalj. Det er mulig å merke en celle i CNS: celle organer av target nevroner er visualisert henhold DIC optikk eller ved ekspresjon av et fluorescerende genmarkør eksempel GFP. Etter merking kan DII bli omdannet til en permanent brun flekk ved photoconversion å tillate visualisering av cellemorfologi med overført lys og DIC optikk. Alternativt kan Dii-merkede celler observeres direkte med konfokalmikroskopi, slik genetisk innført fluorescerende reporter proteiner for å bli colocalised. Teknikken kan brukes i noe dyr, uavhengig av genotype, som gjør det mulig å analysere mutant fenotyper ved enkelt celle oppløsning.

Introduction

Kjennskap neuronal morfologi på nivået av individuelle celler er en viktig forutsetning for å forstå neuronal tilkobling og CNS-funksjonen. Derfor, fra de tidligste dagene av nevrovitenskap, har forskerne forsøkt å utvikle enkelt celle merking teknikker (se 7 for en historisk behandling av denne saken). Klassiske metoder som Golgi farging gir utmerket oppløsning av neuronal morfologi, men er ikke egnet hvis man søker å merke en spesiell type nervecelle i en rettet måte, som farging oppstår i en tilfeldig måte. Utvikling av metoder for farging enkeltceller ved intracellulær eller juxtacellular injeksjon av fargestoffer fra en microelectrode adressert kravet om spesifikk merking.

Anvendelsen av enkelt Nevron fargestoff injeksjon til Drosophila presentert en stor utfordring, på grunn av den lille størrelsen av både organismen og dens neuroner. Likevel, enkelt Nevron farging av embryonale Drosophila 15. Mens metoden har vært utpreget nyttig og har gitt noen viktige innsikter i mekanismene for neuronal utvikling i Drosophila over de siste 20-30 år (2 f.eks, 10), har mange arbeidstakere skvatt unna det, hovedsakelig på grunn av sine tekniske krav.

Tilgjengeligheten i de senere år av genetiske teknikker for neuronal merking i Drosophila har også bidratt til upopularitet av enkelt Nevron fargestoff injeksjon. GAL4-regissert uttrykk for membran målrettede GFP konstruerer kan gi god oppløsning av nevrale morfologi 1, 20. Imidlertid har denne metoden visse begrensninger: den ofte uunngåelig uttrykk for GFP i flere celler kan skjule strukturen i enkelte nerveceller og en GAL4 driver linje kan ikke være tilgjengelig for å kjøre uttrykk i en bestemt nevron av interesse. Den MARCM (Mosaic Analyse med Repressible Cell Marker) metode 8 kan gi merking av hovedsak enhver Nevron på individ cellenivå, men kan ikke med hell brukes i embryo og tidlig larven grunn av treg omsetningen av GAL80 proteinet.

Gitt disse begrensningene av genetisk merking, tror vi at enkelt Nevron fargestoff injeksjon i Drosophila embryo forblir en verdifull teknikk og fortjener bredere anvendelse. Å fremme dette målet, gir vi her en detaljert beskrivelse av metoden. En illustrasjon av sin makt er gitt av vår siste redegjørelse for morfologi av komplett sett av interneurons i abdominal neuromeres på slutten Drosophila embryo 14. Denne studien, som viste både morfologiske variasjon av individuelle nevrale celletyper og prinsippene for neuromere organisasjon i CNS av embryoet, ville ikke vært mulig med noen annen tiden tilgjengelig merking metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vi har brukt to litt forskjellige varianter av enkelt Nevron merking Fremgangsmåte i våre laboratorier. Forskjellene er knyttet til fosteret samling, dechorionisation, devitellinisation og embryo filetering skritt. Figur 1 gir en oversikt over de vanligste og divergerende trinn variantene.

1. Utarbeidelse av Micro-nåler for Embryo Dissection og Mikropipetter for Dye Injection

  1. Glass nåler for embryo disseksjon er hentet fra glass kapillærer (1 mm diameter og 0,1 mm veggtykkelse) med en Sutter avtrekker (Science Instruments) eller tilsvarende utstyr. Alternativt benyttes en elektrolytisk skjerpet 0,15 mm wolfram ledning montert i en nålholderen brukes for disseksjoner. (Instruksjoner for elektrolytisk skarphet er gitt i 9).
  2. Dye Injection mikropipetter er hentet fra tynnvegget glass kapillærer med indre filamenter (Science-produkter; GB 100 TF 8P) med en Sutter avtrekker (ScienceInstrumenter) eller tilsvarende utstyr. Den mikropipette spissen må være skarp, med en gradvis, ensartet avsmalning av skaftet for å hjelpe passasje gjennom vev av embryoet. Ønsket mikropipette er "High Resistance microelectrode, Sharp og Long" variasjon, som beskrevet på s.20 i Sutter Instrument Pipette Cookbook manuell ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Vanligvis er mikropipetter trukket kort tid før injeksjoner er utført for å sikre sine tips blir skarpe og rene.

2. Innsamling, Montering og Disseksjon av embryo

  1. Embryo Collection. Vi har med hell brukt nervecellen injeksjon metoden beskrevet her i embryoer fra trinn 12 til 17 mars. Embryo gradvis utvikle en cuticle under scenen 17 og blir stadig vanskeligere å dissekere. To alternative tilnærminger er tilgjengelige for å oppnå dembryos på et bestemt utviklingsstadiet.
    1. Tillat fluer å legge egg over natten på eple juice-agar plater belagt med gjær lim. Juster temperaturen egg samlingen som passer den planlagte tid injeksjon den neste dag. Samle alle egg neste dag og velg embryoer på ønsket scenen ved hjelp av morfologiske kriterier 3.
    2. Tillat fluer til lå på agarplater som ovenfor, men bytte ut agarplate med en fersk en hvert 1,5 timer ved 25 ° C. Inkuber hver plate for en definert tidsperiode, inntil embryoer har nådd utviklingsstadiet kreves.
    1. Kjemisk Dechorionation. Bruke et metall spatelen for å skrape embryoer av agar og overføre dem til en glassbeholder (f.eks petriskål eller hulromblokken) inneholdende ca 10 ml Drosophila Ringer eller Fosfatbufret saltvann (PBS) løsning. Tilsett noen dråper konsentrert blekemiddel og agitere i noen minutter på etroterende plattformen til chorion sloughs av embryoene. Vask embryoer i flere endringer av Ringer / PBS til det ikke er lukten av blekemiddel. Under disse vaskinger påse at embryoene ikke kommer i kontakt med væskeoverflaten. Ellers vil de flyte og bli vanskelig å senke for senere manipulasjon. Alternativt kan kjemisk dechorionation utføres under anvendelse kurven teknikken beskrevet av 4.
    2. Mekanisk dechorionation (se figur 2, trinn 1-4). Overfør embryo fra agar plate til en glassplate med dobbeltsidig tape. Unngå overflytting agar med embryoene som det vil forstyrre deres adhesjon til båndet. Tillat embryo tørke i 5 til 10 minutter før chorion blir litt sprø. (Mens du venter, pels dekkglasset nødvendig for senere devitellinisation med lim - se 2.3b nedenfor). Berører hver embryo forsiktig med en nål. Chorion vil sprekke og fosteret vil holde seg til neEdle. Overfør embryo umiddelbart til en agar blokk for å hindre uttørking og justere ca 10 av dem på rad, med sine ventral sider opp.

Devitellinisation og filetering er gjort manuelt ved hjelp av en av de to metodene som er beskrevet i 2.3A og 2.3b.

    1. Overføre en enkelt dechorionated embryo av den aktuelle utviklingsstadiet fra parabolen av Ringer løsning til flere dråper Ringer i en silikon dam på en pre-forberedt objektglass. (Lag en 3 cm firkantet demning ved å smøre et tynt lag av silikon på et objektglass, og deretter tilsette en dråpe av 0,01% poly-L-lysin løsning til sentrum av demningen. La silikon å herde i 24 timer.) Overfør embryoet med et glass Pasteur-pipette, slik at embryoet forblir under overflaten av Ringer under overføringen.
      Avstiv bakre enden av embryoet med et par av fine pinsetter, mens forsiktig squeezing embryoet med et par fine iridectomy saks, om lag en fjerdedel vei tilbake fra sin anterior ende. Ikke kutt rett gjennom embryo. Målet er å bare knekke åpne vitelline membran mens forårsaker minimal skade på fosteret. Med tang fortsatt i posisjon, bruker en tungsten nål for å lette embryo ut av den åpnede membran og plasser den ventrale siden ned på lysbildet. Embryo bør holde seg til poly-lysin strøk.
      Fillet embryoet med en skjerpet tungsten nål. Forsiktig perforere, deretter rive kroppen veggen langs dorsal midtlinjen. Med nålen, trykk ned på kroppen veggen slik at det fester seg til lysbildet. For å hindre skade kroppen veggen, presse kroppen veggen med tarmen lagt inn mellom den og nålen. Deretter bruker nålen å rive gjennom tarmen på sitt fremre og bakre ender og løft den bort. Dersom det er ønskelig, kan ytterligere embryo overføres til samme lysbilde, devitellinised og filetert, tar seg ikke å skade andre embryoer allerede pålysbildet.
    2. Belegge et 24 x 60 mm dekkglass med heptan lim (se tabell 1) ved å plassere en liten dråpe av lim i midten av lysbildet og spre den med en 18 x 18 mm dekkglass til en meget tynn film. Plasser dekkglass på et objektglass og lage en ramme av en tape rundt kantene. Skjær vekk overflødig agar fra blokken holder raden av 10 embryo, forsiktig berøre embryoene med dekkglasset heptan lim dekkglass. De skal nå følge dekkglasset med sine ventral sider vendt nedover. Legg en raus mengde PBS å dekke embryoer (se figur 2, trinn 4-6).
      Penetrere vitelline membran med et glass eller wolfram nålen på ryggsiden av hvert embryo nær dens bakre ende. Rive opp membranen langs dorsal midtlinjen og dra embryoet ut av membranen. Orientere fosteret ventrale side ned andre steder på heptan lim underlaget og filet det ved hjelp av samme metode som beskrevet i 2.3A) (seFigur 2, trinn 7-8). Siden flere embryoer blir filetert på samme lysbilde, er det nyttig å enten være veldig nøyaktig med sin legning eller lage en tegning av sin legning på lysbildet.
  2. Etter filetering, kan embryoene bli lett løst i 10-15 min i 7,4% formaldehyd i PBS, etterfulgt av 4 vaskinger i PBS. Ekstrem forsiktighet må utvises for ikke å bringe embryoet i kontakt med overflaten av løsningen i løpet av denne prosessen, som overflaten strekkreftene vil ødelegge embryoet. Dette pre-fiksering trinnet er ikke strengt nødvendig, men er nyttig for å hindre sammentrekning av kroppen veggen muskler i sent stadium embryoer og bidra til å stabilisere embryonale vev mot unge stadier. Husk at fiksering gjør vevet i embryo mer ugjennomsiktig og så litt kompromisser bildekvalitet under DIC observasjon.

3. Fylling av Injection Mikropipetter

Halvparten fylle en 0,5 ml Eppendorf mikrosentrifuge tube meden 0,1% løsning av carbocynanine fargestoff Dii (Molecular Probes, Eugene, OR) i 100% etanol (husk å bruke "tørr" absolutt EtOH å unngå Dii nedbør). Foreta en smal hullet i lokket av røret og sett den butte enden av mikropipette gjennom hullet i lokket. La DII å stige opp filamentet for minst 5 min. (Alltid dekke hullet i lokket når det ikke fylle en mikropipette for å unngå fordampning av etanol).

Utstyr som kreves for neuron fargestoff injeksjon (figur 3).

Mikroskop. Et fast scene mikroskop må brukes for neuron fargestoff injeksjonen for å unngå vertikal bevegelse av embryo under fokusering. Enhver slik bevegelse ville fortrenge pipetten etter at den har kommet i berøring med embryoet. Vi har funnet både Zeiss Axioskop FS og Olympus AX50/BX50 faste stage modeller å være godt egnet for dette formålet. Mikroskopet skal være utstyrt med overført lys DIC optikk for visualisering av Neurons før farging. Mikroskopet skal også være en oppreist snarere enn en invertert modell. Med en oppreist mikroskop, er spissen av mikropipette på samme side av embryoet som visning objektiv, mens med en invertert mikroskop de to er på motsatte sider av embryoet. Sistnevnte arrangement kompromitterer kvaliteten DIC optikk. Mikroskopet skal settes opp for fluorescens mikroskopi, med et egnet filter sett for Dii observasjon. Siden Dii har en relativt bredt spekter med eksitasjon og utslipp maxima på 549 og 565 nm mange filtersett i dette området vil fungere, f.eks de for 568 Alexa, Cy3, Rhodamine, Texas Rød eller TRITC. Selv om det er praktisk å montere en elektronisk styrt lukkeren i banen av fluorescensen lyskilde, å tillate betjening av porten uten håndkontakt med mikroskop, vi også effektivt merket på et oppsett som ble bare utstyrt med en manuell lukker. Endelig, en høy forstørrelse, høy numerisk aperture vann nedsenking mål kreves for observasjon under injeksjon. Dette målet skal være beregnet for bruk uten dekkglass. Vi har med hell brukt Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W, og Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 W mål.

En mikromanipulator er nødvendig for å plassere og flytte mikropipette under neuron fargestoff injeksjon. Vi har brukt både Leica micromanipulator og en scene montert Narashige 3-akse hydraulisk micromanipulator.

En intracellulær DC forsterker, med anlegget for strøminjiseringen, kreves for iontophoretic injeksjon av Dii fra mikropipette.

4. Prosedyre for Dye Injection

  1. Plasser lysbilde med monterte embryoet (e) på stadiet av injeksjon mikroskop (Figur 3). Bruk en 10x mål å finne et embryo og bringe det inn i midten av synsfeltet.
  2. Swing høy effekt hovedmålet inn visningsvinkel og bringe embryo i fokus. Lokaliser cellen av interesse under DIC optikk (eller med fluorescens hvis målcellen uttrykker GFP) og bringe den inn i sentrum av synsfeltet. Sørg for at feltblenderen av mikroskopet er åpnet bare til kanten av synsfeltet, ikke utover. En smal belysning stråle vil hjelpe posisjonering av mikropipette (se trinn 4.4 nedenfor). Hev målet før det er så høyt som mulig over fosteret og fortsatt er i kontakt med Ringer / PBS-løsning.
  3. Plasser bad elektrode for DC forsterker i PBS godt klar av embryo og banen til micropipette.
  4. Sett injeksjon mikropipette til sin holder, som har blitt fylt med en 0,1 M LiCl-løsning. Fest micropipette holderen til micromanipulator. Bruke mikromanipulator grove kontrollene, bringe mikropipette i mellomrommet mellom spissen av objektivet og embryoet.Sørg for at det er godt over nivået på embryo. På grunn av den korte arbeidsavstand på høy effekt temaet vil mikropipette må holdes på en grunne vinkel for å bringe det inn i fokus (se Figur 3). Du er nødt til å etablere riktig vinkel ved prøving og feiling i første omgang. Hvis vinkelen er for bratt, vil du ikke være i stand til å få micropipette spissen i fokus. Hvis det er for tynt, vil mikropipette akselen foul mot veggen av demningen holder bading løsning på plass.
  5. Sentrer spissen av mikropipette i synsfeltet. For å oppnå dette, bringe øynene til nivået av embryoet og flytte mikropipette og tilbake i Y-aksen av mikroskopet scenen. Når spissen krysser lyset banen, vil du se den lyse refleksjon av lysstrålene fra det. Flytt tuppen av mikropipette fremover i X-aksen, slik at det overskridelser lysstrålen. Det vil være lettere å finne micropipette i den lillesynsfelt på høy effekt målet hvis du er ute etter sin aksel snarere enn dens tips. Nå ser gjennom mikroskop okularene og gradvis senke høy effekt målet til skaftet av micropipette kommer i fokus. Flytte micropipette frem og tilbake i Y-aksen med micromanipulator kontrollene bidrar til å finne det, som det etter hvert kommer i fokus. Når akselen er i fokus, flytt mikropipette i X-aksen inntil spissen ligger i sentrum av synsfeltet. På dette stadiet mikropipette tuppen være godt over nivået av embryo. Bytt til fluorescens belysning og undersøke spissen for å sjekke lekkasje av Dii. Juster likestrøm for å hindre enhver Dii krystall fra forming på spissen.
  6. Bruke mikromanipulator kontrollene, senk mikropipette i Z-aksen. Bringe den tilbake i fokus med mikroskop fokus kontroll. Progressivt senke mikropipette ned mot embryoet på denne måten. I utgangspunktet kan du gjøre dette med grovZ-aksen kontroller av micromanipulator og mikroskop. Men som embryo kommer i fokus, bør du bytte til den fine kontrollbryterne.
  7. Når overflaten av embryoet kommer i fokus, flytter spissen av mikropipette mot kanten av synsfeltet, i retning av mikromanipulator. Fokus på cellen som skal injiseres, og kontrollere at den ligger i midten av synsfeltet. Refokusere på mikropipette spissen og flytte den i Y-aksen til det ligger på samme nivå i Y-aksen som cellen. Flytt spissen av mikropipette mot cellen i X-aksen som du senker det i Z-aksen. Hvis du bruker en Leica micromanipulator, vil du sannsynligvis oppdage at mikroskopet scenen kontrollene gir deg bedre kontroll av bevegelse i X-aksen enn micromanipulator kontroller, så bytte til scenen kontroll som spissen kommer i nærheten av cellen.
  8. Bring mikropipette spissen i kontakt med cellen og foreta en depresjon på overflaten. Passere flere nanoamps av depolarizing strøm for noen få sekunder. Du bør se en liten krystall av Dii forming på cellen. For å bekrefte at cellen har blitt merket, kort åpne lukkeren for å belyse embryo med fluorescerende lys, deretter bytte tilbake til DIC. Dersom cellelegemet interessante viser tegn merking, pålegges gjeldende i flere sekunder. Slå av strømmen og raskt trekke embryoet unna mikropipette i X-aksen ved hjelp av mikroskopet scenen kontrollen. Deretter trekke mikropipette fra oppløsningen. Hvis ingen Dii merking er tydelig, kan mikropipette bli blokkert og vil kreve utskifting med en frisk mikropipette. Det kan hende at tuppen av mikropipette har snagged andre vev underveis til cellen av interesse, og denne vevet farges snarere enn cellen. I dette tilfellet, prøve trekkes ut mikropipette litt, og re-nærme cellen. Det kan være nødvendig å erstatte micropipette og prøv igjen.
  1. Hvis ønskelig, kan flere celler individuelt innstillbarealliere merket i samme embryo.
  2. Fjern mesteparten av løsningen i injeksjon kammeret, så fastsette embryoene ved tilsetning 7,4% formaldehyd / PBS i 10 min etterfulgt av 4 vaskinger med PBS. Embryoet blir deretter hensatt ved romtemperatur i minst 4 timer (eller over natten ved 4 ° C) i et mørkt, fuktig kammer (for å unngå bleking eller tørr fallende) å tillate DII å diffundere gjennom nevronale prosesser. På dette stadiet, kan de Dii-merkede celler enten photoconverted eller vises direkte i confocal mikroskop.

5. Photoconversion for undersøkelse ved DIC Optics

Prinsippet om photoconversion er (photo-) oksidasjon av DAB av det fluorescerende lyset som sendes ut av cellen farget under belysningen med riktig bølgelengde. Dette betyr lyse celler photoconverted i kortere tid sammenlignet med svakt fargede celler. Hvis flere celler merket i ett eksemplar avvike for mye om deres lysstyrke dette kan føre til difficulties i photoconverting alle av dem i samme kvalitet (se figur 4C): I dette tilfellet kan man ha for å bestemme seg for et kompromiss mellom å forsømme de svakere celler (ved hjelp av kort belysning) eller akseptere at de lysere cellene begynner å svelle (med lengre belysning) . Hvis alle cellene er for svakt merket (dermed ønsker svært lang belysning), kan bakgrunn forårsaket av endogene peroxidases bli et problem. Siden DAB er giftig det bør håndteres med forsiktighet. Avfall kan "deaktiveres" med 7% klorbleking.

  1. Photoconversion må utføres for hver embryo individuelt. I tilfeller hvor bare en embryo injiseres per lysbilde er PBS-løsning som dekker embryoet erstattet med en DAB-løsning (3 mg DAB / ml Tris-buffer), glidering plassert på en fluorescensmikroskop og den fylte cellen sett med en 100x objektiv. (Bruke en oppreist mikroskop de objektive fall i DAB-løsning og må rengjøres flere ganger med vann etter photoconversion procedure er ferdig, og dette kan unngås dersom en omvendt mikroskop brukes). En Cy3 filter sett og en 100W Hg lampe brukes og cellen utsatt for de røde eksitasjonsbølgelengdene til en brun DAB reaksjon produktet blir tydelig i den merkede nervecellen (sjekk med jevne mellomrom ved å bytte til lyse feltet belysning). Tiden tatt for optimal DAB farging er variabel, men krever eksponering for eksitasjon lys utover det stadiet der fluorescens er helt falmet. Etter photoconversion er fullført, vaskes preparatet flere ganger med PBS. Erstatte PBS med et fall på 70% glyserol, skrape bort silikon med en skalpell blad, erstatte med en ring av vaselin og legge et dekkglass.
  2. Når flere embryoer har blitt fylt på den ene side, overføre hver embryo til en liten dråpe av PBS på en separat 24 x 60 mm dekkglass med ventrale side av embryoet vender glasset. Plassere en ramme av teip rundt hver embryo å skape et godt og dekke fremstillingen med PBS. Hold lysbilder i en fuktig kammer før photoconversion å hindre dem fra å tørke ut. Utveksling PBS dekker fosteret med DAB-løsning. Plasser øyeblikkelig gli over en omvendt mikroskop utstyrt med en 100W Hg lampe og bruke en Cy3 filter satt til opphisse DII, med øks 50 mål. Etter photoconversion, overføre embryo til en frisk lysbilde i en dråpe 70% glyserol, legge til et dekkglass og tetning med neglelakk.

6. Undersøkelse av konfokalmikroskopi

  1. Etter trinn 4,10, overføre embryo til en liten dråpe PBS på en fersk 24 x 60 mm dekkglass. Vi oppnår optimale optikk ved å montere de nedflatede embryoer med ryggsiden mot dekkglasset (slik at bare en liten mengde PBS mellom dekkglasset og embryo).
  2. Plasser en ramme av teip rundt fosteret og forstørre PBS slippe å fylle rammen når dekket med et lysbilde. Plasser et lysbilde på den nøye og fikse det med neglelakk. Fylt nevroner bør være eksamenstudere aggressiv på en konfokal (eller fluorescens) mikroskop så snart som mulig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 illustrerer typiske resultater av teknikken, beskriver vi her. Fig. 4A viser et eksempel på en Dii fylt enkelt interneuron som ble ren photoconverted. Det viser pent mengden detaljer disse forberedelsene tilbudet. Sett under DIC optikk den romlige konteksten av den merkede celle innenfor det ikke-merkede omliggende vev blir synlig, f.eks plasseringen av cellen organ innen cortex og av fiber projeksjon innenfor neuropile.

Figur 4B er en sak hvor fargestoffet slipp var litt for stor resulterer i flere nabocellene bli merket samtidig. Dette gjør ofte det er vanskelig å forholde seg enkelte anslag til forskjellige celle organer. Det viser også at når direkte på under fluorescerende mikroskop (ingen photoconversion) bakgrunn oppløsning er mye lavere.

Prøven i fig 4C

Figur 4D viser at observasjon etter konfokalmikroskopi avslører morfologien av merkede celler i detalj. Dii merking ble utført i et isolat som en GFP reporter konstruksjon. Dette kan gi viktig informasjon om den romlige kontekst (og identitet) av fargestoff fylt cellen innenfor bestemte bestander av neuronal eller glial celletyper (som definert av genuttrykk).

Som et paradigme for å evaluere morfologiske variasjon av et identifisert nervecellen har vi valgt en av de Apterous positive nevroner 14. Denne nevron ligger i en dorsal og medial posisjon nær til neuropile (DAP, figur 5A, Lundgren et al., 1995) atskilt fra de andre Apterous positive nevroner og er derfor lett identifiserbare i apGal4-UASGFP dyr. Figur 5B viser en DAP celle som var fylt med Dii og photoconverted. Cellen legeme ligger på nivået av fremre commissure og viser en axon som første vokser mot midtlinjen og slår deretter anterior i en medial connective region. Det har veksten kjegle som hevelser på spissen og vendepunktet. 19 etiketter av denne cellen, trukket som maksimum anslag fra image stabler, er oppsummert i figur 5C. Cellemorfologi blir synlig for stor detalj. Bare noen få celler viser vekst kjegle som strukturer, seks av de 19 cellene også sende en gren posterior som alltid kortere enn fremre grenen og kan godt være en forbigående funksjon. I figur 5D alle 19 DAP Cellene merket er stablet med hver celle å ha bare en tetthet på 12%. Dette resulterer i områder blir mørkere de flere celler dele dem. Mens cellen kroppen varierer mer enn en celle diameter rundt midtstillingen varierer mediolateral posisjonen axon innenfor neuropile mye mindre - når neuropile bredde er inndelt i ni deler den ligger alltid i en av de mediale to stillinger.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk oversikt over trinnene i neuron merking metoden og dens to varianter.

"Fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/>
Figur 2. Diagram som illustrerer de ulike trinnene i forberedelsene Drosophila embryo for neuron fargestoff injeksjon, ifølge variant B. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. . Skjematisk fremstilling av oppsett for fargestoff injeksjon Den øvre høyre innsatsen er en forstørret visning av arrangement av prøven, injeksjon mikropipette og bad elektroden A:. Micromanipulator, B: Fast scene mikroskop. Den micromanipulator er satt til en spiss vinkel - ca 10 & de. g; C: mikropipette holder med mikropipette D: Specimen på lysbildet, E: Bath elektrode festet med plasticine, F: Tilkobling til DC forsterker.

Figur 4
Figur 4. Eksempler på Dii-merket interneurons i ventrale nerve ledningen av scenen 17 embryoer. Dorsal utsikt, er anterior til venstre. Midtlinjen: stiplede linjer.

  1. Et eksempel på en aldeles photoconverted enkeltcelle, viser en fremtredende kontralaterale aksonal projeksjon og ipsilaterale dendrittiske fibre (pilspiss). DIC optikk.
  2. viser et preparat hvor mer enn en celle ble merket - dette kan tilsløre den klare oppdrag av en enkelt celle kroppen til projeksjon sin.
  3. 8 celler er merket i 3 påfølgende segmenter. I tillegg, i dette preparatet på photoconversion ble etterfulgt av en standard protokoll antistoffarging mot Fas2 som et landemerke.
  4. viser en enkelt DII fylt nervecellen dokumentert med konfokalmikroskopi i et fly belastning bærer en GFP reporter konstruere.

Figur 5
Figur 5. Målrettet Dii merking (markert med GFP uttrykk) avslører omfanget av morfologiske variasjon av et identifisert nervecellen 14. Klikk her for å se større figur .

  1. DAP celle (kunstig farget blå) kan være entydig anerkjent innen apterous Gal4-UASGFP mønster i buken (DAP, figur 5A, Lundgren et enl. 1995). GFP uttrykkende celler har blitt farget med et anti-GFP antistoff. Midtlinjen er merket med stiplede linjer. ac = anterior commissure, pc = posterior commissure.
  2. viser et eksempel på en photoconverted DII fylt Dap celle. Cellen ble identifisert før å farge fylle en apterous Gal4-UASGFP embryo ved sin uttrykk for GFP.
  3. Et galleri av 19 fyller denne cellen, tegnet som maksimum anslag fra bilde stabler. Dorsal utsikt. Anterior er opp. Den neuropile er i lys grå, er cortex området i mørkere grått.
  4. De 19 DAP cellene er stablet med hver celle har en tetthet på 12%. Regionen okkupert av de fleste cellene har den mørkeste skyggen av grå. Den neuropile av alle prøver (blå) ble skalert til en lignende bredde og fremre commissures ved siden av cellen ble innrettet slik at de overlappet. Mens cellen kroppen varierer mer enn en celle diameter rundt den sentrale posisjon, viser mediolateral posisjon axon innenfor neuropilemindre variasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En stor fordel med Drosophila som modellsystem er at det tillater analyse av utvikling og funksjon av nivået av enkeltceller. Dette er spesielt nyttig om nervesystemet, hvor mangfoldet av celletyper er eksepsjonelt høy og funksjon og morfologi av nabocellene kan være helt annerledes.

Metoden vi her presenterer tillater merking av individuelle nevroner med et fargestoff som kan enten omdannes til et permanent flekk eller undersøkt direkte ved fluorescens mikroskopi. Det avslører morfologi av nevrale prosesser i stor detalj (figur 4). En av de store fordelene med metoden er at det muliggjør morfologi av praktisk talt enhver type av nevron i CNS som skal undersøkes (for embryonisk ventrale nerve ledningen, se Rickert m.fl., 2011;. For embryonisk hjernen, se Kunz et al., 2012). I tillegg krever det ikke komplekse kombinasjoner avgenetiske elementer å være tilstede i fosteret, da flere av de genetiske merkingsteknikker gjøre. Dye injeksjoner kan utføres i celler dyr som bærer rapportørgrupper konstruerer, og dermed lar individuelle celle morfologier å bli visualisert i sammenheng med bestemte genuttrykksmønster (Tall 4D og 5) i enten villtype eller mutante bakgrunner. Vi har også brukt teknikken til å overvåke dynamikken i axon utvekst i levende foster 11 nevroner, 12.

Fremgangsmåten kan lett tilpasses til å merke individuelle nevroner i embryoer av andre organismer, forutsatt embryoet er gjennomsiktig nok til å bli undersøkt under DIC belysning. Vi har brukt det å visualisere nevrale morfologi i et bredt utvalg av leddyr embryoer, inkludert gresshopper 18, 17, 19 centipedes skalldyr og silverfish 16.

Den store ulempen med den tekniskeque ligger i dens tekniske problemer. Vi stoler på at den nåværende detaljert redegjørelse av metoden vil hjelpe interesserte forskere i å mestre det.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra DFG til GMT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore 7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC - amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P
Micromanipulator R Leica to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
  3. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  4. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
  5. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
  6. Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
  7. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  8. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  9. Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
  10. Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
  11. Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
  12. Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
  13. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  14. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
  15. Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
  16. Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
  17. Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
  18. Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
  19. Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
  20. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Tags

Developmental Biology nevrovitenskap nevrobiologi genetikk cellebiologi molekylær biologi anatomi Drosophila bananflue Neurosciences Neuroanatomy Miljø-og biovitenskap embryonale nervesystemet sentralnervesystemet neuronal morfologi enkelt celle merking embryo mikroskopi dyremodell
Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K.… More

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter